儿茶素抑制NF-κB-TSLP通路缓解过敏性哮喘小鼠炎症反应

儿茶素抑制NF-κB-TSLP通路缓解过敏性哮喘小鼠炎症反应潘增烽;周园;阮岩;罗霞;闫亚杰;周联
【摘要】Aim To explore the mechanism of catechin in inhibiting Th2-driven inflammation responses of allergic asthma mice.Methods Female BALB/c mice were chosen to establish an allergic asthma model by sensitized and excited with OVA.Then,the administered group was intervened with catechin by series of dose (75,150,300 mg · kg-1).The proportion of peripheral leukocyte cells was analysed,and pathological changes in lung tissues were observed by HE dyeing.The levels of TSLP,IL-5,IL-13 in lung tissues and OVA specific IgE in mouse serum were measured using ELISA kit.NF-κB p65,IκB protein expression levels in lung tissues were investigated using Western blot,and NF-κB p65 nuclear translocation was detected with immunofluorescent technique.Results Catechin could not only effectively reduce the proportion of peripheral leukocyte cells,but relieve the levels of TSLP,Th2 inflammatory factor IL-5 and IL-13,and the activation of NF-κB signal pathway in lung tissues of allergic asthma mice.Conclusions Catechin can effectively relieve Th2 inflammation in allergic asthma mice induced by allergen OVA.The possible mechanism may be that it could reduce expression of TSLP by inhibiting the NF-κB signal.%目的探讨儿茶素(catechin)对过敏性哮喘小鼠炎症反应的治疗作用及其机制.方法采用BALB/c♀小鼠建立鸡卵清蛋白(OVA)致敏和激发的过敏性哮喘模型,给药组分别给予儿茶素(75、150、300 mg·kg-1)干预.记录外周血白细胞分类及计数;HE染色观察肺组织病理学改变;ELISA法检测血清OVA
特异性IgE水平及肺组织TSLP、IL-5、IL-13的含量;Western blot检测肺组织NF-κB p65、IκB蛋白表达情况;免疫荧光检测NF-κB p65核转录情况.结果儿茶素可明显减少外周血白细胞总数,降低血清OVA特异性IgE含量,减少肺组织中TSLP以及Th2型炎症因子IL-5、IL-13的含量,抑制NF-κB p65核转录.结论儿茶素可有效缓解OVA所致的过敏性哮喘小鼠的Th2型炎症反应,其作用可能是通过调控NF-κB通路,抑制TSLP表达而实现的.
【期刊名称】《中国药理学通报》
【年(卷),期】2018(034)002
【总页数】6页(P207-212)
【关键词】儿茶素;过敏性哮喘;胸腺基质淋巴生成素;Th2型炎症;抗炎;NF-κB
【作者】潘增烽;周园;阮岩;罗霞;闫亚杰;周联
【作者单位】广州中医药大学中药学院,广东广州510006;广州中医药大学中药学院,广东广州510006;广州中医药大学第一附属医院耳鼻咽喉科,广东广州510405;广州中医药大学中药学院,广东广州510006;广州中医药大学第一临床医学院,广东广州510405;广州中医药大学中药学院,广东广州510006
【正文语种】中文
【中图分类】R-332;R284.1;R322.35;R392.12;R364.5;R562.250.22
过敏性哮喘是由嗜酸粒细胞、淋巴细胞等多种细胞参与的慢性气道炎症疾病，常表现为以支气管平滑肌收缩为主的过敏反应性症状及Th2型炎症反应[1]。

现认为胸腺基质淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)是Th2型炎症反应的
重要启动因素[2]。

过敏原或炎症因子刺激上皮细胞产生TSLP[3]。

TSLP因子可以通过促进树突状细胞成熟、诱导Th2型细胞增加及相应的炎症因子释放，最终导
致嗜酸粒细胞、淋巴细胞浸润，加重哮喘的炎症反应[4]。

儿茶素是茶多酚中的主要活性成分，已有报道发现其可缓解过敏性角膜炎豚鼠的过敏症状[5]，且有一定的体外抗炎作用[6]，但其对过敏性哮喘是否有治疗作用尚不
明确。

故本研究对儿茶素对卵清蛋白(ovalbumin, OVA)所致过敏性哮喘小鼠的治
疗作用及其机制进行了初步探讨。

1 材料
1.1 试剂儿茶素标准品、OVA(美国Sigma公司)；氯雷他定片(批号：SH00064，拜耳医药上海有限公司)；氢氧化铝凝胶、DAPI(美国Thermo公司)；小鼠OVA
特异性IgE ELISA试剂盒(美国Biolegend公司)；小鼠IL-5、小鼠IL-13 ELISA试剂盒(台湾Arigo公司)；兔抗小鼠p65抗体、兔抗小鼠IκB抗体(美国Cell Signal 公司)；抗β-actin抗体(博士德公司)；细胞核蛋白与胞质蛋白抽提试剂盒、BCA
蛋白浓度测定试剂盒(增强型)、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(碧云天生物技术公司)；山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG) (H+L)-HRP、山羊抗兔IgG(H+L)-HRP(三箭生物
技术公司)；DyLight 549-羊抗兔IgG (H+L)(联科生物公司)。

1.2 仪器 ECLIPSE TE2000-S型倒置显微镜(日本Nikon公司)；Mini-PROTEAN Tetra Cell型电泳仪(美国Bio-Rad公司)；Tanno5200型全自动化学发光图像分
析仪(Tanno公司)；D3024R型微型高速冷冻离心机(赛洛捷克公司)；LSM800激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss公司)。

2 方法
2.1 过敏性哮喘小鼠模型的制备 SPF级8周龄BALB/c ♀小鼠，购自广州中医药大学实验动物中心(合格证号：44005800005107)。

分为正常组、模型组、儿茶素给药组(75、150、300 mg·kg-1)、氯雷他定组(2 mg·kg-1)，每组6只。

模型组与
各给药组于d 1、8、15腹腔注射25 μg OVA、1 mg氢氧化铝完成基础致敏，并在d 22～28，鼻部给予1 mg OVA激发[7]，正常组以相应体积的PBS代替。

在激发前30 min, 给药组灌胃给予相应的药物(Fig 1)。

Fig 1 Allergic asthma model
received an intraperitoneal injection of 25 μg of ovalbumin (OVA) and 1 mg of alum in 300 μL of phosphate-buffered saline. One week after the last OVA sensitization (day 21), a series of seven daily intranasal OVA(500 μg) challenges were administered.
2.2 ELISA法检测小鼠血清中OVA特异性IgE的含量取小鼠外周血于无菌EP管中，3 000 r·min-1，4℃离心10 min，得小鼠血清。

配制标准曲线，加样孵育洗涤后，加入酶标抗体孵育洗涤，加底物液显色，终止反应后，450 nm、570 nm 检测吸光度。

2.3 血液分析仪分析小鼠外周血细胞的比例取50 μL小鼠外周血于无菌EP管中，加入5 μL肝素钠混匀后，于兽用血液分析仪分析小鼠外周血白细胞、淋巴细胞、单核细胞的比例。

2.4 肺组织病理切片完成最后一次激发后24 h，脱颈椎处死小鼠，取出新鲜的组织，固定于4%多聚甲醛中。

组织经乙醇脱水、二甲苯透化后，石蜡包埋切片。

切片用苏木精、伊红染色后，再次脱水透明，最后用中性树胶封片。

2.5 ELISA法检测肺组织中TSLP、IL-5、IL-13的含量取30 mg左右新鲜组织，加入300 μL生理盐水低温匀浆1 min，4℃、5 000 r·mi n-1离心5 min，2次离心后，取上清得匀浆液，并用BCA试剂盒检测其浓度。

配制标准曲线，加样孵育洗涤后，加入酶标抗体孵育洗涤，加底物液显色，终止反应后，450 nm检测吸光度。

2.6 蛋白印迹法检测肺组织中NF-κB p65、IκB蛋白的表达情况取30 mg新鲜组
织，加入200 μL含1% PMSF的胞质蛋白提取剂，低温匀浆1 min，冰浴15 min，4℃、15 000×g离心5 min后，取上清得胞质蛋白。

PBS冲洗后，加入50 μL含1% PMSF的核蛋白提取剂，每1 min涡旋1次，涡旋10次，4℃、15
000×g离心5 min后，取上清得核蛋白。

提取的蛋白用BCA试剂盒检测其浓度，蛋白变性，以20 μg蛋白量计算上样体积。

电泳，转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，5% TBST清洗；加入一抗，4℃孵育过夜。

5% TBST室温清洗；加入二抗，室温孵育1 h，5% TBST清洗二抗；ECL液显色4 min后，拍照，图像分析系统计
算各泳道灰度值。

2.7 免疫荧光检测肺组织中NF-κB p65蛋白核转录情况取肺组织石蜡切片，60 ℃烘烤后，松节油、乙醇梯度脱蜡，枸橼酸抗原修复。

0.2% Triton X-100透化，10%山羊血清封闭，加入NF-κB p65抗体4 ℃孵育过夜，加入荧光二抗，DAPI
封片，激光共聚焦显微镜观察。

2.8 数据处理所有数据以表示，多样本均数间比较采用单因素方差分析，组间两
两比较采用SNK检验。

所有统计学分析均采用SPSS 15.0统计软件处理。

3 结果
3.1 儿茶素对过敏性哮喘小鼠血清中OVA特异性IgE的影响如Fig 2所示，给予
儿茶素干预后，小鼠血清的OVA特异性IgE含量明显减少( P<0.05)。

Fig 2 Level of OVA-specific IgE in serum of allergic asthma mice
*P<0.05 vs model
Fig 3 Proportion of inflammatory cells in peripheral blood of allergic asthma mice
A: WBC; B: Gran; C: Lymphocyte; D: Monocyte. #P<0.05 vs control; *P<0.05, **P<0.01 vs model.
3.2 儿茶素对过敏性哮喘小鼠外周血细胞的影响如Fig 3所示，给予儿茶素干预后，哮喘小鼠外周血中白细胞、淋巴细胞及单核细胞明显减少(P<0.05)。

3.3 儿茶素可明显减少炎性细胞浸润 Fig 4的HE染色结果表明，哮喘小鼠肺组织
中炎症细胞浸润明显，给予儿茶素后可明显缓解这种症状。

3.4 儿茶素可明显降低哮喘小鼠肺组织TSLP、IL-5、IL-13的含量 ELISA法检测肺组织中TSLP及Th2炎症因子的含量，如Fig 5所示，儿茶素可抑制肺组织中TSLP、IL-5、IL-13的上升(P<0.05或P<0.01)。

3.5 儿茶素对过敏性哮喘小鼠肺组织NF-κB p65、IκB蛋白表达的影响 Fig 6 Western blot结果表明，儿茶素可抑制NF-κB p65入核转录，并增加其调节因
子IκB的表达。

Fig 4 Results of HE staining in lung(×200)
A: Control; B: Model; C: Catechin 75 mg·kg-1; D: Catechin 150 mg·kg-1; E: Catechin 300 mg·kg-1; F: Loratadine 2 mg·kg-1
Fig 5 Levels of TSLP (A), IL-5(B), IL-13(C) in lung tissues of allergic asthma mice
#P<0.05, ##P<0.01 vs control; *P<0.05, **P<0.01 vs model
3.6 儿茶素对过敏性哮喘小鼠肺组织NF-κB p65蛋白核转录的影响 Fig 7结果表明，儿茶素可明显抑制NF-κB p65核转录，核内NF-κB p65的表达减弱。

4 讨论
过敏性哮喘是一种常见的、以气道炎症为主要特征的慢性呼吸系统疾病。

过敏性哮喘发病机制受过敏原、基因遗传等因素的影响，临床上常表现为不同淋巴细胞亚群的失平衡、嗜酸性粒细胞的气道浸润、Th2细胞因子过度表达等。

Fig 6 Expression of NF-κB p65, IκB in mouse lung tissues by Western blot A: NF-κB p65 and IκB in cytoplasm; B: NF-κB p65 in nucleus. ##P<0.01 vs
control; *P<0.05, **P<0.01 vs model.
2型辅助性T细胞(Th2细胞)在过敏性鼻炎、过敏性哮喘等过敏反应中起关键作用[8]，其分泌的Th2因子如IL-4、IL-5、IL-13，可促使嗜酸性粒细胞迁移至炎症部位，并可诱导B细胞释放IgE抗体。

研究发现，TSLP是Th2型炎症反应的重要启动因素。

尘螨等过敏原可刺激上皮细胞分泌TSLP因子，来源于上皮的TSLP可通过促进树突状细胞OX40L与CD4+T细胞上的OX40结合, 进而使CD4+T细胞向Th2亚群分化，上调Th2细胞因子的比例[9]。

与此同时，Th2细胞因子IL-13又
可刺激上皮细胞分泌TSLP，最终导致呼吸道炎症的反复与难愈。

Fig 7 Nuclear transcription of NF-κB p65 in immunofluorescence
本研究通过ELISA法检测肺部匀浆液中TSLP的含量，发现儿茶素可抑制TSLP的表达，且给药组与模型组之间差异具有统计学意义；在给予儿茶素干预之后，肺组织中IL-5和IL-13的含量同样明显降低。

此外，儿茶素可以降低OVA所致的过敏性哮喘小鼠血清中OVA特异性IgE的含量及小鼠外周血中白细胞、淋巴细胞、单核细胞的比例，且在高剂量组中，这种差异具有统计学意义。

通过HE染色观察肺组织局部病变，发现儿茶素同样可以缓解肺组织中炎症反应，明显减轻炎症细胞的浸润情况，提示儿茶素可能通过抑制TSLP的表达，缓解下游的炎症反应。

目前认为，在过敏性炎症中，细胞因子、微生物、环境过敏原等多种因素可刺激TSLP表达，而NF-κB信号通路可能是TSLP表达的重要调控机制[10]。

研究发现，TNF-α、IL-1β可通过刺激NF-κB信号通路，诱导气道上皮细胞及角质细胞分泌TSLP因子[11-12]；IκB激酶β(inhibitor kappa B kinase β,IKKβ) 缺失或NF-κB 信号抑制剂干预，则减少上皮细胞表达TSLP[13]。

亦有研究指出，儿茶素类化合
物可通过抑制NF-κB信号通路，缓解大鼠的肝损伤[14]。

故本研究考察了儿茶素
对NF-κB信号通路活化的经典途径(IκBα降解、NF-κB p65入核)的干预作用[15]。

结果发现，儿茶素可抑制NF-κB p65进入细胞核，并上调IκB水平，减轻炎症反应，有效地抑制NF-κB信号的活化。

综上所述，儿茶素可有效地缓解OVA所致的过敏性哮喘小鼠的Th2炎症反应及其过敏症状，其作用可能是通过调控NF-κB通路，减少TSLP的表达而实现的。

(致谢:本实验主要在广州中医药大学中药学院中医药免疫室完成，非常感谢本课题组的全体老师及同学对实验的指导和帮助。

)
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