实验六 培养细胞有被小泡免疫细胞化学染色与观察

实验六培养细胞有被小泡免疫细胞化学染色与观察
一、实验目的：
1、掌握免疫细胞化学染色的基本原理和步骤；
2、对成笼蛋白有被小泡在细胞内的形态和分布有直观认识。

二、实验原理：
免疫细胞化学（immunocytochemistry）是将免疫学基本原理与细胞化学技术相结合所建立起来的新技术，根据抗原与抗体特异性结合的特点，检测细胞内某种多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。

免疫细胞化学染色技术在分析有机体、细胞及亚细胞水平上特定分子的定位及相互联系时是一个有力的工具，在细胞生物学研究中有着广泛的应用。

它利用了抗原与抗体之间特异性结合的性质，即某种抗体仅能与刺激其产生的抗原物质结合，故当发生抗原抗体反应时，可用已知抗体去追踪和鉴定未知的抗原。

一般而言，发生在固定组织或细胞内的抗原抗体反应是不可见的，但如将荧光素、酶等标记在抗体分子上，就能凭借荧光或酶与底物的颜色反应在某一部位的有无，来判断是否发生了特异的抗原抗体反应及研究抗原物质的定位。

标记抗体与抗原结合方式主要有两种：
1、直接法：用标记抗体与抗体中的相应抗原直接结合，操作方法简便，特异性高，但敏感性较差，此法可用于检定未知抗原；
2、间接法：先用未标记的具有特异性的第一
抗体与样品中的相应抗原结合，然后再以标记的第
二抗体与特异性的第一抗体结合；第二抗体是用第
一抗体作为抗原注入另一动物体内诱导产生的抗
体，然后再结合以标记物。

通过这样的放大作用，
使抗原分子上的标记物大大增多，故间接法较直接
法的敏感性大为增高，约高5～10倍，故应用更为
广泛。

间接法中较常用的有荧光标记法、过氧化物
酶标记法等。

本实验所用的即为辣根过氧化物酶标
记的二抗，然后用DAB作为辣根过氧化物酶的作用
底物来显色抗原存在部位，可见棕黄色产物。

三、实验用品：
1、材料：体外培养的HeLa细胞。

2、试剂：
1）甲醇、丙酮、牛血清白蛋白（BSA）、37％甲醛、第一抗体（抗微管抗体）、第二抗体（异硫氰酸荧光素标的抗球蛋白抗体）
2）PBS缓冲盐溶液：在800ml蒸馏水中融解8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4。

用盐酸调pH至7.2，加水定容至1L。

3）10％Triton X－100：吸取10ml Triton X－100，再加入90ml蒸馏水，充分混合均匀。

4）10％吐温20：吸取10ml 吐温20，再加入90ml蒸馏水，充分混合均匀。

5）50％甘油－PBS溶液：取50ml甘油，加入50ml PBS缓冲液，充分混合均匀。

3、器材：荧光显微镜、恒温箱、染色缸、移液器、吸管、镊子、培养皿、滤纸、载玻片、盖玻片。

四、实验方法：
1、在HeLa细胞进行传代培养时，将消毒的盖玻片条放入24孔培养板中，培养48小时后细胞密度达70-80%时，可取出盖玻片进行染色。

2、将长有细胞的盖玻片放入盛有PBS的小染色缸中漂洗，以洗去培养液，然后用滤纸吸去盖片周缘多余的PBS。

3、将盖片移入盛有3mL含3.7%甲醛的PBS溶液的小染色缸中固定10分钟。

4、取出盖片，分别用3mL PBS洗两次，每次10分钟。

5、取出盖片，吸去多余PBS。

用3mL 0.5%的Triton X－100透化处理10分钟。

6、取出盖片，分别用3mL PBS洗两次，每次10分钟。

7、在3mL含有10％BSA的PBS里室温下温育盖玻片10分钟（BSA是用来封闭非特异性蛋白结合位点的）。

8、将盖片有细胞的一面向上，水平地放入湿盒中，滴加3mL稀释好的第一抗体液（一般稀释比例为1:100或1:200）在细胞面上，盖好湿盒，平稳地放入37℃温箱中温育30分钟。

9、取出盖片，用滤纸吸干第一抗体液，放入盛有3mL含0.1%吐温20的PBS的小染色缸中室温洗2次，每次10分钟，以洗去未结合的抗体。

10、吸去残留的PBS，再次放入湿盒，加稀释好的第二抗体3mL（一般稀释比例为1:100或1:200），在37℃温箱中温育30分钟。

11、吸去第二抗体液，用3mL含0.1%吐温20的PBS室温换洗2次，每次10分钟。

12、用移液枪吸取2760μL水+120μL B液+120μL A液，加入到培养皿中。

13、滴一滴50％甘油－PBS混合液于载玻片上，将盖片有细胞的一面向下进行封片，防止产生气泡。

14、将制好的片子放在普通显微镜下观察。

五、实验结果：
在光学显微镜下可见棕黄色的小泡分布在细胞中，在不同细胞中小泡的大小和分布位臵有所差别。

（如图中标注所示棕黄色小泡即为有被小泡）
六、分析与讨论：
1. 实验过程中所使用的一抗和二抗的浓度如果过高或者过低会出现什么样的实验结果？
答: ①如果一抗浓度太低，则不能使抗原与一抗充分结合，使荧光效果不明显；二抗浓度太低，荧光素标记不能结合于一抗-抗原复合物，荧光观察不清楚，可能只在细胞中观察到少数棕黄色小泡，不便于观察。

②如果一抗浓度过高，会损害细胞骨架的结构，使骨架变形，观察不清楚；或在洗涤时，可能会使未结合的一抗未完全洗掉，导致再加入二抗和酶后，整个细胞中都是棕黄色，无法分辨出有被小泡的位臵及分布情况；如果二抗浓度过高，同样在洗涤时可能会导致未与一抗结合的二抗未完全洗掉，造成细胞内物质荧光标记不只结合于细胞骨架，视野会被环境干扰，分辨不出来有被小泡的位臵及分布情况。

2. 请总结免疫细胞化学实验过程中的注意事项。

答: ①注意在HeLa 细胞传代培养的时候，注意灭菌和防止杂菌污染，一定要保证无菌条件；
②应先固定在透化，防止有被小泡透过细胞膜渗出；
③在各步漂洗的过程中，都要洗干净防止干扰实验；
④配臵的一抗和二抗浓度要适中，不要过高或过低，保证一抗与样品，一抗与二抗充分结合；
⑤染色要注意时间，这是决定染色好坏的关键；
有被小泡。