植酸酶活性测定方法

Ｗ×３０
式中： Ｐ— ——由样品吸收度根据二次曲线方程求得的反应
总磷量， μｍｏｌ
Ｗ— ——样品重量， ｇ
Ｆ— — — 样 品 总 稀 释 倍 数
３０— ——反应时间， ｓ
６ 结果
·４４·
６．１ 方法的重复性 抽取了 ３ 个批次的样品， 每个样品进行 ３ 次不 同日期的测定， 结果见表 ２。
表 ２ 植酸酶产品中植酸酶含量的测定结果
·４３·
广东饲料 第 １５ 卷第 ５ 期 ２００６ 年 １０ 月
检测分析
５ 操作方法 ５．１ 磷标准溶液及样品溶液配制 ５．１．１ 磷标准溶液： 称取基准磷酸二氢钾适量 于 １０５℃干 燥 ２ｈ， 置 干 燥 器 中 冷 却 至 室 温 后 ， 精 确 称取 ０．３４１５ｇ 于具塞锥形瓶中， 加入约 １００ｍＬ 醋酸 缓冲液并称量， 准确至 ０．０００１ｇ， 得 ２５．００５５μｍｏｌ／ｇ 磷标准液。用移液器准确移取磷标准液 ０．１ｇ、０．２ｇ、 ０．３ｇ、０．５ｇ、０．８ｇ、１ｇ， 置于 １０ｍＬ 刻度试管中， 加醋酸缓 冲液至 ５ｇ（ 精确至 ０．０００１ｇ） ， 配制成系列浓度的磷 标 准 液 ： ０．５００１μｍｏｌ／ｇ、１．０００２μｍｏｌ／ｇ、１．５００３μｍｏｌ／ｇ、 ２．５００６μｍｏｌ／ｇ、４．００１０μｍｏｌ／ｇ、５．００１１μｍｏｌ／ｇ。备用。 ５．１．２ 样品溶液： 称取 １ｇ 植酸酶样品于具塞三 角 瓶 中 ， 加 醋 酸 缓 冲 液 至 １００ｇ 并 称 量 （ 准 确 至 ０．０００１ｇ） ， 搅拌 ３０ｍｉｎ 后取上清液于 ４ ０００ｒ／ｍｉｎ 离 心 １０ｍｉｎ（ 或用玻璃滤纸过滤） ， 称取上清液 ０．１ｇ， 加 醋酸缓冲液稀释至 １００ｇ， 使得到酶活为 ０．０５ＦＴＵ／ｇ 左右的样品溶液， 所有称量均需精确至 ０．０００１ｇ。 ５．２ 酶活反应及测定 称 取 磷 标 准 溶 液 、样 品 溶 液 、空 白 醋 酸 缓 冲 液 各 １ｇ（ 精 确 至 ０．０００１ｇ） 于 试 管 （ １８ｍｍ×１８０ｍｍ） 中 ， 按表 １ 进行反应。样品反应操作间隔时间为 ３０ｓ。
４．８２
０．０８
２ ０．５５１０ ６９９７．４６ １１０．７２
１０．７２
０．１７
３ ０．５４５６ ６３８０．３５ １００．９６
０．９５
０．０２
４ ０．５５２４ ６３２４．０１ １００．０６
０．０６
０
５ ０．５５４６ ７００９．９７ １１０．９２
１０．９２
０．１７
６ ０．５４６７ ６３７８．１０ １００．９２
［收稿日期］２００６－ ０７－ １７ ［作 者 简 介］谭 宝 玲（１９７６－ ）， 女 ， 本 科 ， 主 要 从 事 饲 料 检 测 方面的工作。
３．２ 紫外分光光度计 ３．３ 恒温水浴锅（ 能控制在 ３７．０±０．１℃） ３．４ 实验室用秒表 ３．５ 移液枪： ０．１～１ｍＬ 移液枪、２ｍＬ 移液枪 （ 适 配相应枪头） ３．６ 磁力搅拌器 ３．７ 离心机（ ４ ０００ｒ／ｍｉｎ） ３．８ 电热恒温干燥箱 ３．９ 玻 璃 试 管 ： １０ｍＬ 刻 度 试 管 （ １３ｍｍ × １２０ｍｍ） 、试管（ １８ｍｍ×１８０ｍｍ） 、１０ｍｌ 离心管。 ４ 试剂与溶液 ４．１ 醋酸缓冲液（ ０．２５ｍｏｌ／Ｌ， ｐＨ５．５０） ： 称取三水 合乙酸钠 ３０．０２ｇ 于 １ ０００ｍＬ 烧杯中， 加双蒸水约 ９００ｍＬ 溶解， 用冰醋酸调节 ｐＨ 至 ５．５０±０．０５， 再 加 ３ 滴吐温－ ２０， 用双蒸水定容至 １ ０００ｍＬ， 摇匀。本 溶液最好为现配现用。 ４．２ 植酸钠溶液（ ０．００７６１ｍｏｌ／Ｌ， ｐＨ５．５０） ： 准确称 取植酸钠 ０．７０３ｇ（ Ｓｉｇｍａ 产品） ， 溶于约 ８０ｍｌ 醋酸缓冲 液中， 用冰乙酸或氢氧化钠调 ｐＨ 至 ５．５０±０．０３， 再用 醋酸缓冲液定容至 １００ｍｌ。本溶液临用时新配。 ４．３（ １＋２） 硝酸溶液： １ 体积浓硝酸与 ２ 体积双 蒸水混合。 ４．４ 钼 酸 铵 溶 液 （ １００ｇ／Ｌ） ： 取 四 水 合 钼 酸 铵 １００ｇ， 加双蒸水约 ８００ｍＬ 溶解， 加 ２５％氨水 １０ｍＬ， 再用双蒸水定容至 １ ０００ｍＬ， 摇匀。本溶液室温下 避光保存， 有效期 ３ 个月。 ４．５ 钒酸铵溶液 （ ２．３５ｇ／Ｌ） ： 取偏钒酸铵 ２．３５ｇ 于烧杯中， 加双蒸水 ５００ｍｌ 溶解， 待完全溶解后， 搅 拌条件下缓缓加入稀硝酸 ２０ｍＬ， 待冷却至室温后 用 双 蒸 水 定 容 至 １ ０００ｍＬ。 本 溶 液 室 温 下 避 光 保 存， 有效期 ３ 个月。 ４．６ 终 止 液 ： 取 钼 酸 铵 溶 液 和 钒 酸 铵 溶 液 各 ２５０ｍＬ 于 １ ０００ｍＬ 容量瓶中， 用（ １＋２） 硝酸溶液定 容。本液临用时新配。
４．６５
乐多仙
２ ６６８９．１２
０．３５
６６９１．２０ ０．０３
５
１．４５
１ ５８１７．７９
１．８３
０．４０
星湖酶 ２ ５７１２．１１
０．１８
５７９４．６３ １．４２
３ ５８５４．００
０．２５
１．０２
６．２ 试验的回收率
取用丹尼斯克提供的液体标准酶产品， 酶活性
值为 ６３２０．０ＦＴＵ／ｇ， 分别取 ０．５ｍＬ 标酶进行两次 ６
个 平 行 测 定 ， 回 收 率 在 １００．０６％～１１０．９２％， 结 果 见
表 ３。
表 ３ 回收率
标酶量 测定值 回收率 相对标准偏差 变异系
编号
（ ｇ） （ ＦＴＵ／ ｇ） （ ％）
（ Ｒ ＳＤ％） 数（ ％）
１ ０．５４３５ ６６２４．７７ １０４．８２
１ 酶活定义 在 ３７．０℃、ｐＨ５．５０ 条件下， 每分钟从 ０．００５ｍｏｌ／Ｌ 的植酸钠溶液中释放出 １μｍｏｌ 的无机磷所需要的 酶量， 即为 １ 个酶活单位， 以 ＦＴＵ／ｇ 表示。 ２ 植酸酶样品 本方法采用的植酸酶样品为本公司购进的罗 氏公司乐多仙植酸酶产品和星湖科技公司星湖酶 产品， 标示量均为≥５ ０００ＦＴＵ／ｇ。 ３ 仪器设备 ３．１ 分析天平（ 精确至 ０．０００１ｇ）
广东饲料 第 １５ 卷第 ５ 期 ２００６ 年 １０ 月
检测分析
植酸酶活性测定方法
谭宝玲， 陈 丽， 冯建文
（ 广东温氏食品集团有限公司， 云浮 ５２７４３９）
［中图分类号］Ｓ ９６５．１
［文 献 标 识 码 ］Ｃ
［文章编号］１００５－ ８６１３（ ２００６） ０５－ ００４３－ ０２
［摘 要］饲 用 植 酸 酶 酶 活 性 的 定 量 分 析 至 今 没 有 普 遍 公 认 的检测方法， 本测定方法是在 ＢＡＳＦ 公司 １９９１ 提出的植酸 酶活性的测定方法的基础上进行研究改进， 建立了更适合 于普通实验室条件下植酸酶产品酶活性的测定。本方法采 用绝对法， 取二次曲线方程计算， 其线性相关性（ Ｒ ２） 匀能够 达到 ０．９９９～１， 同一样 品 同 一 时 间 平 行 测 定 实 验 结 果 相 对 误 差 均 ＜ ２％， 同 一 样 品 不 同 时 间 测 定 结 果 相 对 标 准 偏 差 （ Ｒ ＳＤ％） ＜ １０％（ ｎ＝ ３） 。
０．９２
０．０１
７ 讨论 ７．１ 本方法采用称量质量来计算稀释倍数， 除 去了移液器存在的误差， 提高了实验的准确性。 ７．２ 在醋酸溶液中可适当加入氯化钙作为表面 活性物质， 增加酶的活性， 对测定结果影响较小， 加 入量为每 １ ０００ｍＬ 加无水氯化钙 ０．１４５ｇ。 ７．３ 实验中水浴的温度是影响酶反应的重要因 素， 一定要控制好， 最好能采用循环水流， 振荡水浴 亦可， 维持水温的均衡。 ７．４ 本方法每次实验均要求在相同条件下同时做 标准曲线， 否则会增加实验误差。笔者用同一实验数 据采用不同的实验标准曲线计算， 植酸酶产品酶活性 结果可相差 ９７６．６５ＦＴＵ／ｇ， 相对标准偏差为 １６．０９％。
样品
测定 次数
测定结果 （ ＦＴＵ／ ｇ）
每次测定两 个平行相对
误 差（％）
平均值 （ ＦＴＵ／ ｇ）
各次测定 相对标准 偏差（ ％）
１ ６４７３．７０
０．９９
４．５８
乐多仙
２ ５８９９．２９
１．４８
６１９０．１４ ４．７０
（ 第 １ 批）
３ ６１９７．４２
０．９５
０．１２
１ ６６６０．０９
１．８３
［关键词］植酸酶 测定方法 植酸酶是催化植酸水解成为肌醇与磷酸的一 类酶的总称， 商品植酸酶已在饲料中应用。植酸酶 产品的质量鉴定和饲料中植酸酶的添加量是饲料 生产厂家和质量检测机构都要面临的工作。商品植 酸酶质量及在饲料中的添加量的定量分析至今没 有世界公认的测定方法， 被广泛认可和使用较多的
方 法 是 Ｇｉｓｔｂｒｏｃａｄｅｓ 和 ＢＡＳＦ 公 司 １９９１ 年 提 出 的 植酸酶活性的测定方法， 但此方法在操作上仍存在 不简便， 方法稳定性不够， 测定结果误差相对较大 等缺点。经笔者研究摸索， 对 ＢＡＳＦ 公司的植酸酶 活性测定方法进行改进， 建立了经济、简便、快速、 准确度较高、更适合普通实验室的植酸酶产品酶活 性测定方法。
５ｍＬ
５ｍＬ
反 应 完 毕 后 静 置 １０ｍｉｎ ， 再 将 反 应 溶 液 于
４ ０００ｒ／ｍｉｎ 离心 １０ｍｉｎ。取上清液于波长 ４１５ｎｍ 测
定其吸收度。根据磷标准液的反应总磷量和吸收度
绘制标准曲线并求取二次曲线方程， 再根据下式计
算样品酶活：
酶活（ ＦＴＵ／ ｇ） ＝
Ｐ×Ｆ — — — — — — —
表 １ 反应步骤
反应步骤
磷标准溶液、样品溶 空白醋酸 液、空白饲料样品溶液 缓冲液
１．３７．０℃预热 ５ｍｉｎ
√
√
２． 依 次 加 入 植 酸 钠 溶 液
２ｍＬ
２ｍＬ（ 第 ２步）
３． 混 合
√
√
４．３７．０℃反应 ３０ｍｉｎ
√
√
５．依次加入显色／ 终止液
２ｍＬ
２ｍＬ（ 第 １步）
６． 混 合
√
√
总体积