制备型薄层色谱的制备与分离

制备型薄层色谱的制备与分离
卢红升商文秀
（武汉工业学院武汉）
摘要：介绍常规薄层色谱和几种高效薄层色谱分析方法，及薄层色谱与联用检测技术在医药、生物制品、毒物、环境有害物质、食品及其他领域定性定量分析中的应用,并对其前景进行了展望。

薄层色谱( thin layer chromatography, TLC)是一种快速、简便、高效、经济、应用广泛的色谱分析方法。

薄层色谱的特点是可以同时分离多个样品,分析成本低,对样品预处理要求低对固定相、展开剂的选择自由度大,适用于含有不易从分离介质脱附或含有悬浮微粒或需要色谱后衍生化处理的样品分析。

TLC广泛地应用于药物、生化、食品和环境分析等方面,在定性鉴定、半定量以及定量分析中发挥着重要作用。

常规的TLC法存在展开时间长、展开剂体积需求大和分离结果差等缺点。

高效薄层色谱法是近年来迅速发展的一种高效、快速、操作简便、结果准确、灵敏度高和重现性好的薄层色谱新技术,已广泛用于各个领域。

下面对薄层色谱方法、薄层色谱检测技术和薄层色谱应用的新进展进行介绍。

1 薄层色谱法的原理
薄层色谱法（TLC），系将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片上，成一均匀薄层。

待点样、展开后，根据比移值（Rf）与适宜的对照物按同法所得的色谱图的比移值（Rf）作对比，用以进行药品的鉴别、杂质检查或含量测定的方法。

薄层色谱法是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，也用于跟踪反应进程。

薄层色谱法是一种吸附薄层色谱分离法，它利用各成分对同一吸附剂吸附能力不同，使在移动相（溶剂）流过固定相（吸附剂）的过程中，连续的产生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附，从而达到各成分的互相分离的目的。

Rf=溶质移动的距离/溶液移动的距离。

表示物质移动的相对距离。

各种物质的Rf 随要分离化合物的结构，滤纸或薄层板的种类、溶剂、温度等不同而不同，但在条件固定的情况下，Rf对每一种化合物来说是一个特定数值。

2 高效薄层色谱
高效薄层色谱(HPTLC)采用更细、更均匀的改性硅胶和纤维素为固定相,对吸附剂进行疏水和亲水改性,可以实现正相和反相薄层色谱分离,提高了色谱的选择性。

C2、C8和C18化学键合硅胶板为常见反相薄层板。

高效板厚平均100～250μm、点样量0. 1～0. 2μL,展距3～6cm,展开时间3～20min,最小检测量0. 1～0. 5μg,较常规TLC可改善分离度,提高灵敏度和重现性,适用于定量测定。

2 .1 棒状薄层色谱
棒状薄层色谱( TLC2F ID)是用石英棒作支持物涂上硅胶,点样、溶剂展开。

样品在色谱棒上分离后,将棒通过适当的机械传动装置穿过氢火焰离子化检测器火焰中心,使化合物燃烧裂解,形成离子碎片和自由电子,再由电极收集并产生与化合物量成正比的电流信号,从而测出各物质的含量(图1) 。

该方法优点是灵敏度高,操作简便,薄层棒可反复使用,通用性好,可用于非挥发性、没有可见及紫外吸收、没有荧光以及衍生化困难的有机化合物的定性定量分析,被广泛地应用于工业、食品、药物及医学等领域。

杜国华等[ 2 ]利用TLC2F ID方法测定了不同来源、不同种类的催化裂化原料油的烃族组成。

将重油样品用甲苯溶解后点在SIII型色谱棒上,正庚烷和甲苯分次展开后,转移到氢火焰上扫描,得到试样中饱和烃、芳烃、胶质以及沥青质的分离薄层色谱图。

图1 棒状薄层氢焰扫描仪示意图
2. 2 加压薄层色谱
加压薄层色谱(OPLC)是指在水平的薄层色谱板上施加一弹性气垫。

展开剂不是靠毛细作用力,而是靠泵压被强制流动,因此可以采用更细颗粒的吸附剂和更
长的色谱板,分离所需时间缩短,扩散效应减小,分离效果更好。

2. 3 离心薄层色谱
离心薄层色谱(CTLC)又叫旋转薄层色谱,是一种离心型连续洗脱的环形薄层色谱分离技术,主要是在经典的薄层色谱基础上运用离心力促使流动相加速流动。

离心力用于分离,可以减少破坏,对沸点高、分子量大的化合物有利,可用于分离100mg左右的样品。

使用商品化生产的离心薄层色谱仪,仪器结构简单。

尽管其分辨率低于制备型HPLC,但操作简便,分离时间短,并且无须将吸附剂刮下即可将产物洗脱下来,广泛应用于合成和天然产物的制备分离。

徐晨等[ 3 ]采用离心薄层色谱法提取大豆磷脂酰胆碱( SPC) ,速度快,溶剂消耗量少,制备样品量大,成本低。

用硅胶GF254、和CaSO4 ·12H2O,加聚丙烯酸钠水溶液混合均匀,铺制薄层盘,烘干,薄层盘可重复使用5次以上,洗脱液: CHCl32CH3OH2H2O
2. 4胶束薄层色谱
Armstrong 在1979 年首次研究了胶束薄层色谱(miceller thin laychromatography,M2TLC) 。

胶束薄层色谱分正相胶束薄层色谱和反相胶束薄层色谱两种。

正相胶束薄层色谱是在聚酰胺、氧化铝或硅胶薄层上用低浓度表面活性剂的水溶液为展开剂;反相胶束薄层色谱是在硅烷化的硅胶薄层上用低浓度含少量水的非极性有机溶剂为展开剂。

胶束薄层色谱能使一些结构相似、难溶于水的化合物得到较好分离。

微乳液与胶束同属于低粘度的缔合胶体,同
样存在表面活性。

与胶束相比,微乳液是由表面活性剂、助表面活性剂、油和水等在一定配比下自发形成的无色透明、低粘度的热力学稳定体系,具有更大的增溶量和超低界面张力。

微乳液作为展开剂,对待测成分具有独特的选择性和富集作用,更有利于提高色谱效率,可同时分离亲水物质、疏水物质、带电成分、非带电成分等。

胶束薄层和微乳液薄层主要用于三次采油、痕量金属离子的回收和生物碱分析。

胶束薄层色谱的最大优点是很少使用有毒、易挥发、易燃、易造成污染的有机溶剂,并且使用方便、操作简单和经济廉价。

闻璃毓等[ 4 ]探讨了微乳薄层色谱法用于同时分离鉴定中成药中多种有效成分,以十二烷基硫酸钠( SDS) 2正丁醇2正庚烷2水微乳液为展开剂,聚酰胺薄膜为固定相,通过一次点样展开,分别检测出抗感冒颗粒剂和防风通圣丸中黄芩甙、绿原酸、防风、大黄素、大黄酚等多种成分。

用含水量75%的此微乳液为展开剂还可分离和检测13种黄连药材、
饮片及中成药[ 5 ] 。

操作简便,分离效果理想,检出灵敏。

2. 5 包合薄层色谱( ICC)
1983年, Fujimura等首次把环糊精键合到硅胶表面,制成键合固定相,并用于薄层色谱,以后关于环糊精固定相的合成、改性、应用有了不少报导。

β2环糊精(β2CD)是由7个葡萄糖分子通过α21, 4糖苷键连接而成的环状低聚糖。

由于其特殊的结构,能够在它的疏水空腔中选择性地包结各种客体分子,形成具有不同稳定性的包结配合物,从而达到分离效果。

β2环糊精还可作为薄层色谱的展开剂和增敏剂。

这种包合薄层避免了使用有毒、易挥发、易燃的有机溶剂,具有较高的选择性,适用于分离普通化合物,同分异构体及光学异构体。

方艳红等[ 6 ]用β2环糊精(β2CD)作为流动相手性添加剂,流动相组成为β2CD饱和溶液2甲酸2甲醇在反相C18薄层色谱板上分离了d、l2色氨酸。

王小萍等[ 7 ]以环糊精水溶液为流动相,聚酰胺薄膜为固定相,反相薄层色谱法研究了中药大黄有效成分大黄素、芦荟大黄素与环糊精的包结作用,测定了包结常数。

朱全红等[ 8 ]设计并制备了3, 52二硝基苯甲酰基取代的β2环糊精薄层色谱键合固定相,用于拆分丹磺酰化氨基酸对映体。

该键合相合成方法简单,性能稳定,适用于正相和反相液相色谱。

以乙腈21% (φ)乙酸三乙胺2乙酸为展开系统,可使8对丹磺酰化氨基酸对映体都能得到良好分离。

2. 6 二维薄层
二维薄层(2D TLC)是分离多组分复杂混合物的一种有效方法,基于在薄层板两个垂直的方向上进行相同或不同机理的展开。

将样品点在薄层板的一个角上,展开至适当距离后取出,挥干溶剂,再将板以与原展开方向成90°的方向展开,第一次展开被分离的组分组斑点,成为第二次展开的原点。

二维薄层的优点在于可以用不同的流动相二次展开,并且在二次展开前,
可以用其他方式处理薄层和已实现组分离的样品。

例如二维薄层SRS (分离2反应2分离)技术,就是在第一次展开后,进行板上反应,再进行二次展开分离。

在二次展开前,还可以点加标准样。

周漩等[ 9 ]用二维薄层色谱分离人参皂苷,点样后,将薄层板先沿Y轴方向以不同比例的氯仿2甲醇为流动相进行展开,展开后吹干,将板置于密闭容器中抽真空以除去残留在板上的展开剂,然后沿X轴方向以不同比例的正丁醇2乙酸乙酯为流动相进行二维展开,结果比一维展开分离出了更多
新的皂苷组分。

Pyka[ 10 ]在硅胶60F254铝板上分别用正己烷2乙酸乙酯2乙酸和氯仿2正丁醇2乙酸2水二维展开分离了7种胆汁酸。

Amanda综述了一维薄层和二维薄层的区别以及二维薄层应用的优点。

3 薄层色谱的实验步骤
3.1吸附剂的选择
薄层色谱的吸附剂最常用的是氧化铝和硅胶。

薄层色谱用的吸附剂和支持剂：薄层吸附色谱的吸附剂最常用的是氧化铝和硅胶；分配色谱的支持剂为硅藻土和纤维素。

硅胶是无定形多孔性物质，略具酸性，适用于酸性物质的分离和分析。

薄层色谱用的硅胶分为：“硅胶H”—不含粘合剂；“硅胶G”—含煅石膏粘合剂；“硅胶HF254”—含荧光物质，可用于波长为254nm紫外光下观察荧光；“硅胶GF254”—既含煅石膏又含荧光剂等类型。

与硅胶相似，氧化铝也因含粘合剂或含荧光剂而分为氧化铝G、氧化铝GF254及氧化铝HF254。

粘合剂除上述的煅石膏（半水合硫酸钙：2CaSO4·H2O）外，还可用淀粉、羧甲基纤维素钠。

1）、硅胶：
“硅胶H”—不含粘合剂；
“硅胶G”—含煅石膏粘合剂；
其颗粒大小一般为260目以上。

颗粒太大，展开剂移动速度快，分离效果不好；反之，颗粒太小，溶剂移动太慢，斑点不集中，效果也不理想。

化合物的吸附能力与它们的极性成正比，具有较大极性的化合物吸附较强，值较小。

因而R
f
酸和碱 > 醇、胺、硫醇 > 酯、醛、酮 > 芳香族化合物 > 卤代物、醚 >烯 > 饱和烃
2、薄层板的制备（湿板的制备）
薄层板制备的好坏直接影响色谱的结果。

薄层应尽量均匀且厚度要固定。

否则，在展开时前沿不齐，色谱结果也不易重复。

在烧杯中放入2g硅胶G，加入5—6ml 0.5%的羧甲基纤维素钠水溶液，调成糊状。

将配制好的浆料倾注到清洁干燥的载
玻片上，拿在手中轻轻的左右摇晃，使其表面均匀平滑，在室温下晾干后进行活化。

通常将薄层板分为硬板（加粘合剂）和软板（不加粘合剂）薄层吸附色谱和柱吸附色谱一样，化合物的吸附能力与它们的极性成正比，具有较大极性的化合物吸附较强，因而Rf值较小。

因此利用化合物极性的不同，用硅胶和氧化铝薄层色谱可将一些结构相近或順、反异构体分开。

薄层板制备的好坏直接影响色谱的结果。

薄层应尽量均匀且厚度（0.25—
1mm）要固定。

否则，在展开时前沿不齐，色谱结果也不易重复。

（1）平铺法：用薄层涂布器涂布，它适合于科研工作中数量较大要求较高的需要
（2）浸渍法：把两块干净的玻片叠合，浸入调制好的吸附剂浆料中，取出后分开、凉干。

（3）简易平铺法（倾注法）：将配制好的浆料倾注到清洁干燥的载玻片上，拿在手中轻轻的左右摇晃，使其表面均匀平滑，在室温下凉干后进行活化。

3.2 薄层板的活化
将涂布好的薄层板置于室温凉干后，放在烘箱内加热活化，活化条件根据需要而定。

硅胶板一般在烘箱中渐渐升温，维持105—110℃活化30min。

氧化铝板在200℃烘4h可得到活性为Ⅱ级的薄板，在150—160℃烘4h可得活性为Ⅲ—Ⅳ级的薄板。

氧化铝板与硅胶板的活性测定见
3.3 点样
通常将样品溶于低沸点溶剂（丙酮、甲醇、乙醇、氯仿、苯、乙醚和四氯化碳）配成1%的溶液，用内径小于1mm管口平整的毛细管点样：
（1）先用铅笔在距薄层板一端1cm处轻轻划一横线作为起始线，然后用毛细管吸取样品，在起始线上小心点样，斑点直径一般不超过2mm。

（2）若因样品溶液太稀，可重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，而影响分离效果。

（3）若在同一板上点几个样，样点间距离应为1—1.5cm。

（4）点样要轻，不可刺破薄层。

在薄层色谱中，样品的用量对物质的分离效果有很大影响，所需样品的量与显色剂的灵敏度、吸附剂的种类、薄层的厚度均有关系。

样品太少，斑点不清楚，难以观察，但样品量太多时往往出现斑点太大或拖尾现象，以至不易分开。

3.4 展开
薄层色谱的展开，需要在密闭容器中进行。

为使溶剂蒸气迅速达到平衡，可在展开槽内衬一滤纸。

常用的展开槽有：长方形盒式和广口瓶式。

展开方式有：（1）上升法将色谱板垂直于盛有展开剂的容器中，适合于含粘合剂的色谱板。

（2）倾斜上行法色谱板倾斜10—15°角；色谱板倾斜45—60°角，适用于含有粘合剂的色谱板。

（3）下降法，用滤纸薄层色谱展开剂的选择和柱色谱一样，主要根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素来考虑。

凡溶剂的极性越大，则对一化合物的洗脱能力也越大，即Rf值也越大（如果样品在溶剂中有一定溶解度）。

薄层色谱用的展开剂绝大多数是有机溶剂.
（4）双向色谱法将样品点在方形薄层板的角上，先向一个方向展开，然后转动90°角的位置，再换另一种展开剂展开。

适合于成分复杂的化合物分离。

影响展开的因素
A 相对湿度的影响
B 溶剂蒸汽的影响（a 展开室的饱和 b预吸附）
C 温度的影响
D 展距的影响与分离度仅正比与展距的平方根。

3.5 显色
A光学检出法
a自然光（400~800nm）
b 紫外光（254nm或365nm）
c 荧光一些化合物吸收了较短波长的光，在瞬间发射出比照射光波长更长的光，而在纸或薄层上显出不同颜色的荧光斑点（灵敏度高、专属性高）
B 蒸汽显色法
多数有机化合物吸附碘蒸气后显示不同程度的黄褐色斑点，这种反应有可逆及不可逆两种情况，前者在离开碘蒸气后，黄褐色斑点逐渐消退，并且不会改变化合物的性质，且灵敏度也很高，故是定位时常用的方法；后者是由于化合物被碘蒸气氧化、脱氢增强了共轭体系，因此在紫外光下可以发出强烈而稳定的荧光，对定性及定量都非常有利，但是制备薄层时要注意被分离的化合物是否改变了原来的性质。

C 物理显色法
用紫外照射分离后的纸或薄层后，使化合物产生光加成，光分解、光氧化还原及光异构等光化学反应，导致物质结构发生某些变化，如形成荧光发射功能团。

发生荧光增强或淬灭及荧光物质的激发或发射波长发生移动等现象，从而提高了分析的灵敏度和选择性。

D 试剂显色法
广泛应用的定位方法。

用于纸色谱的显色剂一般都适用于薄层色谱，还有防腐剂的显色剂不适合用于纸色谱及含有有机黏合剂薄层的显色，又时喷显色剂后续加热，这也不是用于纸色谱。

显色方法a喷雾显色：显色剂溶液以气溶胶的形式均匀的喷洒在纸和薄层。

b 浸渍显色：挥去展开剂的薄层板，垂直的插入盛有展开剂的浸渍槽中，设定浸板及抽出速度和规定在显色剂中浸渍的时间。

3.6测定比移值
在一定的色谱条件下，特定化合物的Rf值是一个常数，因此有可能根据化合物的Rf值鉴定化合物。

4. 结束
薄层色谱因其设备简单、操作方便、适用性广,可以快速给出可靠、准确的结果等特点,一直被很多分析工作者所关注,并被用于许多领域。

随着新的固定相和高速发展的仪器技术的引入,薄层色谱已成为一种灵敏、高效的分离与分析方法。

今后,薄层色谱法仍将是可供选择的经济、可靠、快速的重要分析方法之一,并会有更加广阔的应用前景。

参考文献
1. 何华，倪坤仪等. 现代色谱分析.北京.化学工业出版社.2004
2. 叶振华，宋清，朱建华等. 工业色谱基础理论和应用.中国石化出版社1998
3.付若农等.色谱分析概论. 化学工业出版社.2003
4.汪正范,杨树民,岳卫华. 色谱联用技术. 北京:化学工业出版社, 2001。