拟南芥 CRY1 基因在转基因甘蓝型油菜中的遗传及表达研究

拟南芥CRY1基因在转基因甘蓝型油菜中的遗传及表达研究
农学院植物科学与技术02-1 畅乃迪
（指导教师牛应泽教授）
摘要：采用卡那霉素抗性鉴定、PCR技术研究了拟南芥CRY1基因在转基因甘蓝型油菜中的遗传行为，同时应用GUS组织染色和花色素苷积累量的比较研究了CRY1基因在转基因油菜中的表达。

结果表明，拟南芥CRY1基因多以杂合、少数以单拷贝形式整合到转基因油菜的基因组中，目的基因的遗传行为呈现非孟德尔遗传现象，但能够稳定地遗传给后代。

转基因植株T11、T12、T13、T14、T15的GUS检测结果均呈阳性，其中T11、T12、T13的花色素苷积累量增加，说明目的基因在转基因油菜中得到了表达，但T14、T15的花色素苷积累量与对照相当，几乎没有变化，说明目的基因在转基因油菜中出现了沉默现象。

关键词：floral-dip CRY1基因转基因油菜遗传表达
The inheritance and expression research of Arabidopsis thaliana CRY1 gene in the transgenic Brassica napus L.
Chang Naidi
Abstract: Km fastness authentication, PCR technology were adopted to study the genetic behavior of A.thaliana CRY1 gene in B.napus, and comparasion between GUS assay and anthocyanin accumulation quantity was also applied to research its experssion. The results indicated that A.thaliana CRY1 gene integrated into rape genome generally in form of integrate, but seldom in form of single copy, and its genetic behavior was abMendelian model. Objective gene can stably transmit to progeny except for some losing. GUS assay results of the transform palnts T11，T12，T13，T14，T15 were positive. There into the anthocyanin accumulation quantity of T11，T12，T13 increased,which showed that objective gene had expessed in transform rape, but the anthocyanin accumulation quantity of T14，T15 were similar to comparasion, which indicated that objective gene had silenced in transgenic rape.
Key Words：floral-dip，CRY1 gene，transgenic rape，inheritance，expression
1 前言
1.1 植物基因工程与转基因油菜
自1983年第一个转基因植物问世以来只有23年的时间，但植物基因工程的发展却是日新月异、硕果累累。

迄今为止，全世界已分离目的基因达几百个，获得转基因植物近200种。

经过多年的探索，基因转化技术日臻成熟，目前已形成了以农杆菌介导转化和以基因枪转化技术为主体的两大植物基因转化系统。

这两种转化系统机理清楚、证据确凿，成功的例子最多，约占转基因植物的90%以上。

前者主要应用于双子叶植物，后者主要应用于单子叶植物，尤其是重要的禾谷类作物。

植物基因工程有着得天独厚的优势——植物细胞的“全能性”，这是动物细胞所不能比拟的。

另外植物基因工程也不会像动物和人类基因工程那样遇到较多的社会、伦理、道德等问题[1]。

植物基因工程的一系列重要的研究进展向人们昭示着它在作物抗性、品质和育性改良等多方面的巨大潜力。

在植物基因工程研究中，油菜是近十年来在转基因研究方面取得重大进展的少数几种作物之一。

首先是甘蓝型油菜(Brassica napus)和白菜型油菜(Brassica campestris)获得了转基因植株（Ooms，1985）。

随着农杆菌介导转化原理和体系的系统化，芥菜型油菜(Brassica juncea)的转基因开始有了报道。

自1986年V. H. Mathews等利用根癌农杆菌介导法将npt-Ⅱ标记基因转入芥菜型油菜以来，油菜的遗传转化方法取得了很大的进步[2]。

目前应用于油菜转基因中的遗传转化方法多以农杆菌介导转化法为主，此外还有基因枪法、电击法、激光穿刺法、子房注射法、依赖于原生质体培养的PEG介导法和脂质体法等[3,4,5]。

油菜的分子克隆和转基因研究已经在世界范围内取得了令人瞩目的成果，迄今，已有39个基因转移到油菜中[6]。

转基因油菜的研究使得油菜的抗性、品质和育性得到改良，诞生一批了抗病、抗虫、抗除草剂及高产量、高品质的转基因油菜，部分品种已进入商业化或大田实验阶段，开始在加拿大等国大面积应用于生产[2]。

1.2 农杆菌介导的Floral-dip转化法的研究进展
在众多的遗传转化方法中，农杆菌介导的Floral-dip转化法是一种崭新的转基因方法。

Feldmann(1987)最先在拟南芥中应用原位渗透法获得了转基因的成功。

Chang等(1990)利用摘下的幼嫩花序和受伤的拟南芥植株进行农杆菌接种感染，获得转基因植株，但遗传转化率相对较低，而且遗传转化不稳定。

Bechtold等(1993)研究发现将活体拟南芥植株浸泡在农杆菌菌液中的同时，将菌液和植株进行抽真空处理，可明显提高基因的转移频率，转化
率可达0.4%。

Clough（1998）[7]把真空渗透转化法（vacuum infiltration）（Bechtold，1993）[8]演变成为更加简便的农杆菌介导的floral-dip转化法，该法只需将农杆菌菌液与植株的花接触，而不需要进行真空处理。

所不同的是在菌液中加入了一种表面活性剂SilwetL-77(OSi Specialties，Inc1，Danbury，CT，USA)。

在继Clough（1998）[7]应用floral-dip转化法转化拟南芥获得成功后，近几年有不少学者也应用floral-dip转化法进行基因转移，但成功的例子较少。

目前仅在拟南芥、萝卜、油菜及苜蓿上有成功的报道（Clough et al.，1998；Tague，2001；Curtis et al.，2001和2005；徐光硕等，2004；付绍红等，2004）[7,9,10,11,12,13]。

目前拟南芥功能基因组的研究多以该法获得突变体（Lawrence，2003；Gspar，2004；Clough,2005）[14,15,16]。

Chung(2000)[17]对拟南芥花序进行了农杆菌菌液直接喷雾(floral-spray)处理，同样获得了转化株，这是比floral-dip更为简便的转基因方法。

Curtis（2005）[13]把苜蓿作为遗传受体材料用floral-dip 转化法进行了转化，也获得了转化株，这说明floral-dip转化法不仅仅适用于十字花科植物。

这是对floral-dip转化法受体材料的一个突破。

农杆菌介导的floral-dip转化法与其它转基因方法相比，优越性在于：1）不受宿主植物基因型的影响，可以将外源基因导入难以建立再生系统的植物中；2）操作简单，无需经过繁琐的组织培养阶段，大大减少了产生体细胞无性系变异的可能性；3）对精密仪器和昂贵药品的依赖较小，所投入的人力、物力、财力很少；4）可在短期内获得大量的转基因植株，创造大量的突变株。

大量突变体的获得是功能基因组研究的基础，功能基因组研究又是基因工程研究的核心，由于floral-dip转化方法可以在短期内获得大量的转基因植株，创造大量的突变株，因此对植物功能基因组的研究意义重大。

利用我国丰富的油菜基因资源，克隆和鉴定具有自主知识产权的功能基因和转录因子，对我国油菜基因工程育种研究和产业的可持续发展具有关键作用[18]。

1.3 外源基因的遗传特性及影响其表达的因素
1.3.1 外源基因的遗传规律
转基因后代的遗传分离特点受转化方法、载体、环境条件因素的影响而呈现出复杂的分离情况，表现遗传的多样性。

大量转基因遗传研究结果表明，在大多数转化植株中，转基因后代呈单基因显性的孟德尔式分离。

Peng(1995)将gusA和neo基因转入水稻AR株
系中，其T1代的GUS和npt-II的表型分离系数为3:1，同孟德尔的单个显性基因分离规律一致，并且被R2代植株的酶活性分析进一步证实。

转化的外源基因在T1代的分离比呈现孟德尔遗传现象这是常见的现象，但是并非都如此。

Akama等在拟南芥上发现T1代植株中有10个株系的抗性分离比为3R:1S，有3个株系是15R:1S，一个株系是63R:1S，说明多数情况下为单位点插入，但也有多位点插入。

多个转基因在转化植株后代的分离规律与其整合特性密切相关，如果多个基因以连锁形式整合到一个位点上，那么就符合单基因的孟德尔分离规律。

如果多基因分别整合到不同位点，那么每个基因分离符合孟德尔分离规律，各个基因间不影响。

一般外源基因在自交一代中发生分离，在自交二代中能够得到纯合体。

但由于外源基因的丢失、纯合体致死效应及一些未知的原因，转基因后代的分离比一般会明显小于3:1，呈现非孟德尔分离规律。

Deroles（1998）报道，转基因矮牵牛的后代出现非孟德尔分离规律，后代的显性个体比明显少于3:1。

少数转化个体发生复杂的转基因分离。

转基因植株的遗传稳定性包括转化细胞培养过程的稳定性和外源基因在转基因植株的繁殖过程中的遗传传递稳定性。

转化细胞培养过程的稳定性主要是在愈伤培养阶段，因为组织培养过程中存在较高的无性系变异，这会引起外源基因的稳定性下降，floral-dip没有经过组织培养，因此其后代的稳定性比以组织培养为基础获得的后代高。

bra[19]为了研究用floral-dip转化法获得后代的遗传稳定性，对5个不同群体（a.80株经floral-dip 转化获得抗卡那霉素的T1代植株；b.80株经floral-dip转化获得具有gfp荧光标志的T1代植株；c.80株与a、b群体一样的非转基因植株作对照；d.25株单独的非转基因的植株作对照；e.18株从愈伤组织分化出来的后代）进行了AFLP和RAMP分析。

结果表明，用10对不同引物进行AFLP和RAMP分析，获得了524条多态性条带，其中e群体有31条（6％）呈现多态性，a、b、c、d群体几乎不呈现多态性（0.6％），说明用floral-dip转化获得的后代基本上可以排除或降低受体自身DNA变异、遗传稳定性很高，排除了出现转化细胞培养过程的不稳定性的情况。

但转基因后代的在繁殖过程中也可能出现外源基因丢失，因为T-DNA可能减数分裂过程中丢失。

1.3.2 影响外源基因表达的因素
进行基因转化后，外源基因能否在受体中稳定表达是转基因植物应用的重要条件。

在生产中要求导入的外源基因能够高水平地表达并且稳定遗传，这就要求所使用的转基因方法遵循外源基因的遗传稳定性和后代分离规律。

外源基因的表达的受到诸多因素的影响，
主要有：1）甲基化。

植物DNA链上胞嘧啶的第5位碳原子经常被甲基化，导致基因表达强度减弱，甚至丧失。

由于生物体自身的免疫反应特性，这种排斥性的甲基化作用对外源基因的抑制更明显一些。

2）导入的外源基因的拷贝数不同。

大多数情况下，外源基因以单拷贝在受胞染色体上某一位点整合，但也有在单一位点上呈串联式多拷贝的插入。

单一位点的插入导致孟德尔显性单因子遗传，多位点的插入导致比较复杂的遗传。

3）转录后调节。

外源基因的转录产物会被降解，在转化细胞内产生不完整的mRNA，这一点被一些作者用分子杂交方法证明。

外源基因的长度与其在受体内的稳定性呈负相关。

连锁着的不同外源基因在受体内表达不一致可能与它们的长度不一致有关。

特别是当T-DNA插入到植物的沉默基因区域时，由于基因互作等原因，使外源基因失活。

4）转基因沉默。

转基因沉默已经成为近来分子生物学领域研究的一个主要方向，其主要原因为DNA甲基化、重复序列或多拷贝数、位置效应、共抑制、环境条件等。

外源基因的遗传和表达是转基因研究的重要方面，它涉及从基因的分离、改造、表达载体的构建到转基因的介导、复制、转录、翻译等各个环节的准确组合，需要多学科的合作，其成果将最终解决生物基因表达调控的科学难题。

1.4 拟南芥CRY1基因的功能
拟南芥CRY1基因（也称hy4基因）编码的是一种黄素蛋白受体[20] cryptochrome，其突变体（cry1）缺乏由蓝光刺激引起的下胚轴伸长抑制反应（野生型拟南芥幼苗在蓝光刺激下会发生下胚轴伸长的抑制反应，即下胚轴短）。

当在蓝光中生长时，CRY1缺失突变体下胚轴伸长的蓝光抑制效应明显降低，这是由于CRY1基因的突变引起的；而在蓝光照射条件下，过量表达拟南芥CRY1的转基因烟草或拟南芥幼苗的下胚轴比野生型的更短，这表明在下胚轴伸长的蓝光抑制过程中CRY1 的数量起着限速作用。

在转基因烟草中，拟南芥CRY1的过量表达导致短下胚轴表型出现，表明CRY1的信号转导过程存在于不同的植物种中。

在研究拟南芥CRY1基因在促进花周期时发现，CRY1突变体均比野生型开花时间延迟，蓝光诱导的花色素苷积累也大大下降[21,22]。

CRY1基因还能影响植物的花期，根据环境改变而推迟或加快植物开花[23]。

另外CRY1还参与了植物时钟节律的调节。

研究发现C端区域对拟南芥CRY1的功能起了决定作用[24]。

1.5 目的与意义
转基因的成功与否在于外源基因能否在转化体中遗传和表达，随着大量转基因植株的
获得和田间实验，科学家认识到外源基因在受体植株中的遗传行为是非常复杂的，在许多方面有别于经典的遗传规律。

因此研究外源基因在转化体后代的遗传规律及其稳定性是当前植物基因工程育种的重要内容。

本实验以四川农业大学油菜研究中心所提供的转基因甘蓝型油菜westar的自交后代（T1）为材料，探讨拟南芥CRY1基因在转基因甘蓝型油菜中的遗传及表达，从而为验证农杆菌介导的floral-dip法是否是一种有效的油菜遗传转化新方法提供坚实的理论依据。

2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1植物材料
供试植物材料是转拟南芥CRY1基因的双低甘蓝型油菜westar的自交后代（T1）。

该材料由四川农业大学油菜研究中心提供。

2.1.2 目的基因及选择标记基因和报告基因
目的基因为拟南芥蓝光受体基因CRY1基因，以及与其连锁的选择标记基因卡那霉素（Km）抗性基因和报告基因GUS。

2.2 方法
2.2.1转化植株的卡那霉素抗性鉴定
选择健康饱满的种子，经洗涤，使其充分吸水后，用75%的酒精表面消毒40s，再用0.1%HgCl2浸泡消毒10min，经无菌水冲洗3次，均匀种植于含Km浓度为270mg/L的1/4MS （无糖）培养基上进行萌发（25℃，光照12h/d）。

5~6天后，萌发的幼苗中转入外源基因者具有卡那霉素抗性，可以正常存活；未转入外源基因的幼苗不具有卡那霉素抗性，子叶边缘褐化，在子叶及第一片真叶表面出现白斑，叶柄呈紫色，最终死亡。

记录抗卡那霉素与不抗卡那霉素的植株数目。

如果抗卡那霉素与不抗卡那霉素植株数目比率为3:1，则外源基因是单拷贝整合，否则以多拷贝整合。

2~3周后，将长出根系的绿色苗移栽到土壤中。

2.2.2 转基因植株后代的PCR检测
油菜的DNA提取方法参照李佳[25]的方法进行。

目的基因PCR扩增引物根据CRY1基因C末端利用primer 5.0软件设计，5’-GAGTTCCCAAGGGACATT-3’，
3’-ACCATAACCTCCTCCTTC-5’（上海英骏生物技术有限公司合成）。

PCR反应体系（25μl）为：2.5μl（10×）Buffer，2.0μl（25Mm）MgCI2，2.0μl（25mM）dNTP，1.0μl（0.02μM）的引物，2.0μl（200ng）DNA模板，1U DNA聚合酶。

反应程序为：94℃变性1min，53.5℃退火2min，72℃延伸2min，共35次循环，完成最后一次循环后，72℃延伸8min，扩增出目的DNA条带为413bp。

2.2.3 CUS报告基因的活性检测
分别在卡那霉素抗性鉴定中抗性植株比不抗植株较高的5个株系中各选取一株，共5株且PCR检测呈阳性植株叶片，参照Jefferson 等[26]方法，进行GUS报告基因表达稳定性检测，将叶片置于X-gluc缓冲液（含100mmol/L pH7的磷酸钠缓冲液，EDTA 10 mmol/L，亚铁氰化钾0.5 mmol/L，高铁氰化钾0.5 mmol/L，20%甲醇（V/V）和0.1%X-Gluc）中，抽真空10min 后置于37℃保温24h，用70%乙醇脱色后镜检。

2.2.4 转基因植株的花色素苷积累量的比较
参照Deikman和 Hammer[27]，Noh 和Spalding[12]的方法。

将进行GUS染色的5个材料进行花色素苷的提取。

①.剪取经蓝光照射12h后的转基因油菜叶片，迅速称重（0.3g左右）；
②.剪碎后置于含提取液（各组分的体积比：propanol : HCl : H2O=18:1:18）的5ml eppendorf 管中，封住管口，沸水浴3 min，温室过夜；
③.提取花色素苷：5800r/min离心3 min，取上清液，用721型分光光度计测定波长在535nm、650nm处的吸光值（A），花色素苷的相对含量为（A535- A650）g-1FW。

3 结果与分析
3.1转化植株的卡那霉素抗性鉴定
种子在1/4MS（无糖）培养基上发芽，长出4种苗：白色、紫色，无根系的绿色苗和有根系的绿色苗（图1），只有最后一种是卡那霉素抗性植株，有可能含有目的基因CRY1基因。

对T1代22个单株共5548粒种子进行筛选，获得抗卡那霉素植株323株。

对每个单株进行数据统计，单株T11筛选了200颗种子获得了142株抗性植株，58株非抗性植株，抗性植株比不抗植株基本接近3:1。

经X2测验，它符合一对基因分离的预期比例。

这说明目的基因是以单拷贝方式整合到油菜基因组中，另外21株单株抗卡那霉素植株比不抗卡
那霉素植株明显低于3:1，初步说明目的基因的整合发生在两个连锁的基因位点，不是单拷贝而是以杂合形式整合进油菜基因组中。

表1 转化植株卡那霉素抗性鉴定结果 Table 1 the result of Km fastness authentication
植株 抗性植株数 敏感植株数
抗性植株比率（%）植株抗性植株数敏感植株数 抗性植株比率（%）T1 142
58 38.7 T127 143 4.7 T2 9
186 4.6 T1322 527 4.0 T3 8 170 4.5 T1410 433 2.3 T4 2 204 1.0 T15
9 276 3.2 T5 6
191 3.1 T1631 262 10.6 T6 5 161 3.2 T1729 332 8.0 T7 9 202 4.3 T18
22 92 19.3 T8 9 167 5.1 T1926 300 7.9 T9 23 158 12.7 T20
15 169 8.2 T10 4 488 0.8 T2118 189 8.7 T11 13 268 4.6 T22
10 143 4.1
3.2 转基因植株后代的PCR 检测 对经过卡那霉素筛选获得的抗性植株进行PCR 检测，几乎所有的植株都获得了拟南芥
CRY1
基因的特异扩增条带（图
2），表明CRY1基因在转基因植株中能稳定遗传给后代。

Negative plant
Positive plant
图1 获得的具有Km 抗性的转基因油菜幼苗 图2 1 阴性CK ，2 质粒DNA ，3-6转基因植株DNA Figure 1 the Km fastness plants of transgenic rape Figure2 1 Negative CK , 2 plasmid DNA , 3-6 transgenic DNA
3.3 GUS报告基因表达稳定性检测
选取5株卡那霉素抗性比较高且PCR检测呈阳性植株，在GUS报告基因表达稳定性检测中均出现阳性，即出现了蓝斑，而对照未出现。

这说明了拟南芥CRY1基因在转基因油菜中能稳定遗传（图3）。

在检测的叶片中大部分细胞都染成了蓝色，并不是每一个细胞都染上色，可以初步确定目的基因是以杂合的方式整合进油菜基因组的。

图3 叶片GUS检测的稳定表达结果
Figure 3 the leaf GUS lasting expression
3.4 花色素苷积累量的比较
从图4可以看出，转基因植株T11、T12、T13的花色素苷含量都比对照高，说明目的基因在转基因油菜中表达了，而T14和T15的花色素苷含量与对照相当，几乎没有变化。

PCR和GUS检测都呈阳性，说明目的基因存在于转基因油菜中，但转基因油菜的的花色素苷含量没有变化，这是目的基因沉默的结果。

图4 转基因植株花色素苷相对含量
Figure 4 the anthocyanin accumulation quantity of trangenic
4 讨论
不同转化方法对外源基因遗传稳定性有明显影响，一般来说，农杆菌介导的遗传转化后代多呈现孟德尔遗传，而一些直接转化方法，如基因枪法后代遗传方式较复杂。

而近年来许多科学家对种质转化产生了兴趣，所谓的种质转化(germ line transformation) 就是在植
物合子胚中具有将来发育成为植株特定器官或部位的特定细胞，利用这些特定的功能细胞实现目的基因的转化。

这些分生组织的特定细胞被转化以后，即可使将来分化发育的特定器官带来有外源基因，从而获得转基因植株。

种质转化的外源DNA能够稳定遗传，但相对也比较复杂，插入的拷贝数，位点等均变化较大。

农杆菌介导的floral-dip转化法也属于种质转化法的一种，它的转化机理是转化是发生在植株发育的后期，也就是配子体形成后，因此利用这种方法获得的转基因植株具有种质转化的特性。

本实验的结果也与此吻合。

本实验中用卡那霉素抗性鉴定转基因后代时，抗性与不抗植株的比值明显小于3:1，呈现非非孟德尔分离规律，这可能是：1）整合发生在两个连锁基因位点；2）出现了外源基因丢失情况。

本次实验造成外源基因丢失的原因不是转基因方法的本身，而是受体材料，因为甘蓝型油菜是异源四倍体，外源基因能同时整合到同源染色体相同位点的机率很小，因而获得的第一代转基因植株常常是杂合体，在后代的分离过程中，外源基因很容易丢失；3）在油菜的繁育过程中T-DNA在减数分裂过程中丢失，环境条件也会影响启动子从而影响转基因的稳定性。

目的基因能在转基因植株中稳定表达的前提是其能稳定遗传给后，floral-dip法获得的后代遗传稳定性高，这是它优越于其它转化法重要的一方面。

然而外源基因沉默在转基因植株中是不可避免的现象，其主要原因为DNA甲基化、重复序列或多拷贝数、位置效应、共抑制、环境条件等。

本实验出现的目的基因在转基因油菜中沉默现象可能是由于：1）目的基因以杂合形式整合；2）环境条件，据报道，在转基因中CaMV 35S启动子对光周期的缩短非常敏感，他们将CaMV 35S同GUS基因转入烟草，将光周期从16:8h降低到8:16h （光:暗），GUS活性明显提高。

本实验中转基因油菜生长在光周期为14:10h的自然条件，因此启动子没有达到高表达状态。

在众多的环境因素中，移栽也是一个重要因素，有研究表明：将转基因植株在组培条件下萌发、成苗再移栽到土中，目的基因沉默的比例比直接播种的高很多，本实验经过卡那霉素抗性鉴定这一步，这是导致基因沉没一个重要因素。

综上所述，农杆菌介导的floral-dip转化法获得的后代遗传稳定性高，并且其操作简单，适应于大规模的大田转基因。

但利用该方法转化时我们还需找到减少外源基因丢失、沉默的对策，并且更深入研究农杆菌介导的floral-dip法的转化机理，能为外源基因单位点、单拷贝定量的整合到受体植株提供理论帮助。

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致谢
弹指四年的大学生活就要结束，仍记得初入学时那不安又渴望的心情。

四年，我学会了很多，也感动了很多。

特别感谢我的指导老师牛应泽教授。

牛老师严谨的治学态度、渊博的科学知识、开拓创新的学者风范以及对生活豁达的态度，都使我受益无穷，终身难忘。

在此，感谢牛老师对我的培养，并献上我最诚挚的敬意!
衷心感谢韦献雅师姐，以及油菜研究中心的各位师兄师姐，感谢他们在我实习期间的指导和帮助。

他们乐于助人、博学好思的精神将是我今后学习的楷模!特别是韦献雅师姐不但对我的实习实验进行指导，还向好朋友一样关心我，给了我许多有益的帮助！
感谢农学院全体老师的关怀和培养，感谢四年来同学习、共进步的同学们，深深的感激你们对我的关心和帮助!
值此毕业之际，感谢我的母亲，四年来，是您给了我莫大的关爱和支持，您的鼓励、您的爱是我完成学业和今后人生道路上远行的不竭动力！
最后向所有给予我关心和帮助的老师、亲人和朋友们致谢。

我将永远珍惜这段宝贵的经历!
畅乃迪
2006年6月。