流体压力对骨髓间充质干细胞软骨向分化影响的体外实验研究

流体压力对骨髓间充质干细胞软骨向分化影响的体外实验研究易飞舟;赵萤;张旻
【摘要】目的：探讨持续性与周期性流体静压力对骨髓间充质干细胞（ BMSCs）软骨向分化潜能的影响。

方法采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs，并采用成骨成脂分化鉴定。

细胞随机分为5组，分别为对照组，持续性静压力45 kPa、90 kPa组，周期性动压力0～45 kPa、0～90 kPa作用组，压力刺激组细胞采用每天1 h连续2 d的加载方式。

采用Real⁃time PCR对细胞成软骨分化标志基因Sox9、Aggrecan及Col⁃Ⅱ表达水平进行检测。

结果45 kPa、90 kPa的静压力及0～45 kPa、0～90kPa动压力作用下，BMSCs中Sox9的基因表达量显著高于对照组（ P＜0．05）；45 kPa，90 kPa，0～90 kPa组中Aggrecan mRNA的表达量
明显升高（ P＜0．01）；90 kPa，0～90 kPa压力作用组中Col⁃Ⅱ的表达量显
著高于对照（ P＜0．01）。

结论压力微环境刺激可明显促进BMSCs成软骨标志
基因的表达，且持续90 kPa的压力作用下BMSCs成软骨分化效果显
著。

%Objective To investigate the different effects of continuous and cyclic hydrodynamic pressure on marker gene expression of chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells ( BMSCs ) . Methods BMSCs were obtained by whole bone marrow adherent separation culture method and identified by osteogenic and adipogenic induction assays. BMSCs were randomly divided into a control group and four experimental groups which were treated by continuous hydrostatic pressure at 45kPa or 90kPa, and cyclic hydrostatic pressure at 0~45kPa or
0~90kPa. The experimental groups were treated with pressure 1h per day for 2 days. The expression of Sox9, Aggrecan and Col⁃Ⅱwas detected by
Real⁃time PCR. Results Real⁃time PCR showed that under pressure, the expression of Sox9 was significantly enhanced compared to that in the control group ( P<0.05) . The expression of Aggrecan in the cells under 45, 90 and 0~90kPa was significant higher than that of control group
( P<0.01) . The expression of Col⁃Ⅱgene was significantly increased un⁃der 90 and 0~90 kPa ( P<0.01) . Conclusion Hydrodynamic pressure could promote the chondrogenic differentiation of BMSCs. The effect of 90 kPa on the chondrogenic differentiation is remarkable.
【期刊名称】《口腔医学》
【年(卷),期】2016(036)006
【总页数】4页(P481-484)
【关键词】流体压力;骨髓间充质干细胞;成软骨分化
【作者】易飞舟;赵萤;张旻
【作者单位】安徽合肥解放军第 105 医院，口腔科，安徽合肥 230001;第四军医大学口腔医学院急诊与综合临床科，军事口腔医学国家重点实验室，陕西西安710032;第四军医大学口腔医学院急诊与综合临床科，军事口腔医学国家重点实验室，陕西西安 710032
【正文语种】中文
【中图分类】R393
基础研究
关节在机体运动过程中传输伸展力、剪切力、压缩力、扭转力。

而承受力的关键组
织关节软骨是由致密结缔组织的胶原纤维构成，是一种异向性、非均质、具有粘弹性的组织结构，这种特殊的组织结构在维持关节软骨营养、保持机械性能中起重要作用。

但关节软骨无神经支配及血供，其营养成分只能从关节液获取，因此关节软骨一旦损伤很难自我修复。

目前临床上修复关节软骨的方法有很多，但效果均不理想。

目前组织软骨工程技术是近年来提出的最有应用前景的新方法。

骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是软骨组织工程中最理想、最常用的种子细胞[1]。

但目前由软骨组织工程获得的软骨只能在组织形态及生化成分上达到正常软骨水平，其机械性能与关节软骨有很大差异[2-3]。

研究发现，干细胞在体内生长的微环境是由包括细胞外基质、细胞因子在内的基质微环境和复杂的力学微环境共同组成，干细胞比成体细胞有着更强的力学敏感性，且生物力学信号对于调节干细胞的表型分化十分重要[4-9]，而组织工程软骨细胞在培养过程中缺乏力学刺激。

这提示软骨组织工程中力学微环境可能对干细胞的分化调控起非常重要作用。

为了探讨力学微环境对软骨组织工程种子细胞BMSCs软骨向分化的影响，并探讨周期性与持续性静态力学环境对BMSCs分化的不同效应，本研究采用自主研发的细胞液压加载装置对体外培养的BMSCs施以持续性及周期性流体压力刺激，探讨不同形式压力微环境对干细胞体外成软骨分化特性的影响，为进一步优化组织工程软骨培养条件提供实验基础。

SD大鼠(第四军医大学动物中心提供);α-MEM培养基(Hyclone公司，美国)；胰蛋白酶(Hyclone公司，美国)；胎牛血清(杭州四季青公司，中国)；倒置相差显微镜(OLYMPUS公司，日本)； Real-time PCR 试剂盒(Takara公司，日本)；自行设计制作的细胞液压加载装置。

本实验采用课题组自主研发的细胞液压加载装置[10-11]，对BMSCs施加周期及持续流体静压力，观察不同种类压力对BMSCs成软骨相关基因表达的影响。

取RNA溶液进行反转录，反应体系(20 μL)：5×反转录缓冲液4 μL；反转录酶1 μL；OligodT Primer 1 μL；Random 6 mers 1 μL；模板RNA(加入量=1 000/
浓度)；剩余的反应体系液体量由RNase Free H2O补充。

反应结束，cDNA置-
20 ℃保存备用。

根据GenBank中大鼠来源Sox-9、Aggrecan、Col-Ⅱ、β-actin基因的序列，由上海生工生物工程公司设计并合成PCR引物(表1)，以β-actin为内参。

采用CFX Manager实时定量PCR仪对软骨标志基因进行定量检测。

结果采用CFX Manager software(Version 2.1)进行分析，检测样本的Ct值并计算2-ΔΔCt值，计算各组mRNA的相对表达量。

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行单因素方差分析，两两比较用Dunnet’t检验，检验水准α=0.05。

BMSCs经成脂诱导，油红O染色显示细胞胞浆内出现红色串珠状脂滴(图2A) ;而成骨诱导14 d后，茜素红染色可见钙盐沉积(图2B) 。

以上结果说明本实验分离
的细胞为间充质来源的干细胞。

Real-time PCR结果显示，BMSCs加载持续静压力45 kPa、90 kPa及周期性动
压力0～45 kPa、0～90 kPa后，Sox9 mRNA的表达量显著高于对照(P<0.05)；
45 kPa、90 kPa、0～90 kPa三组中Aggrecan mRNA的表达量高于对照组
(P<0.01)；90 kPa、0～90 kPa两组中Col-Ⅱ的表达量较之对照组上调明显
(P<0.01)。

组间比较三种成软骨基因的表达量，90 kPa静压力作用组最高。

静压
与动压相比，90 kPa静压作用下Sox9及Aggrecan基因的表达量显著高于0～
90 kPa压力组 (P<0.01)。

而0～45 kPa压力促Sox9及Col-Ⅱ基因上调的作用
则高于45 kPa压力作用组(P<0.01)(图3)。

关节软骨在关节活动中有重要的作用，该组织的损伤将导致关节活动不便。

而组织工程软骨技术
研究发现力学微环境可弥补传统组织工程中的不足，例如补充干细胞在分化过程中营养物质，从而减少因营养不良导致的干细胞生长分化的迟滞甚至死亡。

研究证实，力学刺激可以影响软骨细胞的增殖及分化。

对体外培养的BMSCs施加周期性流体静压力可促进其成软骨向分化[12-17]。

BMSCs 成软骨诱导过程中力学刺激可促
进细胞分泌具软骨特性的细胞外基质，促进BMSCs 软骨标志基因表达[18]。

在缺乏成软骨诱导因子TGF-β3的条件下，对BMSCs施加流体静压力，其成软骨标志基因Sox9、Aggrecan及Col-Ⅱ表达量仍上调[19]。

将BMSCs接种至三维支架
上后，加载离心力，持续8周后，发现力学加载下形成的软骨组织具有典型的软
骨陷窝结构形成并具有大量软骨特异性细胞外基质、Ⅱ型胶原和大量的聚合蛋白多糖分泌[20]。

以上研究结果说明力学微环境可促进BMSCs软骨向分化。

本研究结果同样显示，周期或持续压力可显著上调BMSCs中包括Sox9、Aggrecan以及Ⅱ型胶原在内的成软骨分化标志基因表达，且周期及持续压力对BMSCs成软骨分化标志基因表达的影响具有一定的差异，说明在不同的力学微环境下BMSCs成软骨分化的水平也不尽相同。

由该结果推测，在不同的力学微环境下所构成的组织工程软骨可能在组织结构与生物力学特性上可能有所不同，但具体压力大小、时间，频率以及作用方式以及其中的机制尚不清楚，需要进一步的研究，以期找出合适的生物力学条件诱导BMSCs成软骨，以期构建在生物相容性及力学性能上更符合体内环境中的组织工程软骨。