谷氨酰胺合成酶活性的测定

谷氨酰胺合成酶活性的测定
谷氨酰胺合成酶活性的测定
一．试剂
（1）酶提取缓冲液（0.05mol/L Tris- HCl，pH 8.0；内含2mmol/L Mg2+、2mmol/L DTT、0.4mol/L蔗糖）
称取Tris[三（羟甲基）氨基甲烷]1.5295 g，MgSO4·7H2O 0.1245g，DTT（二硫苏糖醇）0.1543 g和蔗糖34.23 g，去离子水溶解后，用0.5~1.0 mol/L HCl调至pH 8.0，最后定容至250 mL。

（2）酶反应液
1.对照反应液A（0.1mol/L Tris- HCl缓冲液，pH 7.4；内含80mmol/L Mg2+、20mmol/L谷氨酸钠盐、20mmol/L半胱氨酸和2mmol/L EDTA-Na2）称取1.2236 g Tris、1.9918 g MgSO4·7H2O、0.3451 g谷氨酸钠盐、0.2422 g半胱氨酸、0.0744 g EDTA-Na2，分别用去离子水浴解后，用0.5~1.0mol/L HCl调至pH 7.4，定容至100mL。

2.完全反应液B（含盐酸羟胺、pH 7.4的0.1mol/L Tris- HCl缓冲液）
除了反应混合液A的成分外，再添加80mmol/L盐酸羟胺（每100 mL 中含0.5560 g盐酸羟胺）。

（3）显色剂（0.2mol/L TCA、0.37mol/L FeCl3和0.6mol/L HCl混合液）
称取3.3176 g TCA（三氯乙酸）和10.1021 g FeCl3·6H20，用去离子水溶解后，加5mL浓盐酸，定容至100mL。

（4）40mmol/L ATP溶液
称取0.2420 g ATP溶于10 mL去离子水中（临用前配制）。

二．实验步骤
（1）粗酶液的提取
取10mL藻液，在4500r/min离心15分钟，去掉上清液，加5mL酶提取液，超声波破碎10min，4℃,12000g离心20min,上清液
即为粗酶提取液
（2）GS活性的测定
取1.0mL完全反应液B于10mL离心管中，加入0.5mL粗酶液和0.5mL ATP溶液，混匀，于37℃下保温0.5 h，加入1mL显色剂终止反应，摇匀，室温下放置5min后，于3500r/min下离心10min，取上清液于540nm下测定吸光度，以加入1.0mL对照反应液A的为对照。

三．结果处理及计算
GS活性[A540/(g·h）]=
A540为540nm处的吸光度；
m 为样品质量（g）；
Vt为粗酶液总体积（mL）；
Vs为反应体系中加入的粗酶液体积（mL）；
t 为反应时间（h）。