真核生物三种RNA聚合酶的特点

1．简述真核生物三种RNA聚合酶的特点？
下边是详细的
RNA聚合酶Ⅰ的转录产物是45SrRNA，经剪接修饰后生成除5SrRNA 外的各种rRNA。

rRNA与蛋白质组成的核糖体是蛋白质合成的场所。

RNA聚合酶Ⅱ在核内转录生成hnRNA，经剪接加工后生成的mRNA被运送到胞质中作为蛋白质合成的模板。

RNA聚合酶Ⅲ的转录产物是tRNA，5SrRNA,snRNA，其中snRNA参与RNA的剪接。

2．简述乳糖操纵子的调控原理？
答：答：（1）乳糖操纵子的组成：大肠杆菌乳糖操纵子含Z、Y、A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰转移酶，此外还有一个操纵序列O,一个启动子P和一个调节基因I. （2）阻遏蛋白的负性调节：没有乳糖存在时，I基因编码的阻遏蛋白结合于操纵序列O处，乳糖操纵子处于阻遏状态，不能合成分解乳糖的三种酶；有乳糖存在时，乳糖作为诱导物诱导阻遏蛋白变构，不能结合于操纵序列，乳糖操纵子被诱导开放合成分解乳糖的三种酶。

所以，乳糖操纵子的这种调控机制为可诱导的负调控。

（3）CAP的正调节：在启动子上游有CAP结合位点，当大肠杆菌从以葡糖糖为碳源的环境转变为以乳糖为碳源的环境时，cAMP浓度升高，与CAP结合，使CAP发生变构，CAP结合于乳糖操纵子启动序列附近的CAP结合位点，激活RNA聚合酶活性，促进结构基因转录，调节蛋白结合于操纵子后促进结构基因的转录，对乳糖操纵子实行正调控，加速合成分解乳糖的三种酶。

（4）协调调节：乳糖操纵子中的I基因编码的阻遏蛋白的负调控与CAP的正调控两种机制，互相协调、互相制约。

3．简述DNA聚合酶和DNA连接酶在DNA复制中的作用？
答：DNA聚合酶（DNA polymerase）是细胞复制DNA的重要作用酶。

DNA聚合酶 , 以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。

DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。

真核细胞有5种DNA聚合酶，分别为DNA聚合酶α（定位于胞核，参与复制引发具5－3外切酶活性），β（定位于核内，参与修复，具5－3外切酶活性），γ（定位于线粒体，参与线粒体复制具5－3和3－5外切活性），δ（定位核，参与复制，具有3－5和5－3外切活性），ε（定位于核，参与损伤修复，具有3－5和5－3外切活性）。

原核细胞有3种DNA聚合酶，都与DNA链的延长有关。

DNA聚合酶I是单链多肽，可催化单链或双链DNA 的延长；DNA聚合酶II 则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关；DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多，是促进DNA链延长的主要酶。

DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的，最初是在大肠杆菌细胞中发现的。

它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH
生成磷酸二酯键。

但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。

DNA连接酶在大肠杆菌细胞中约有300个分子，和DNA聚合酶Ⅰ的分子数相近，这也是比较合理的现象。

因为DNA连接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合，填满双链DNA 上的单链间隙后封闭DNA双链上的缺口。

这在DNA复制、修复和重组中起着重要的作用，连接酶有缺陷的突变株不能进行DNA复制、修复和重组。

4．简述真核生物基因时空表达的意义？
答：所有生物的基因表达都具有严格的规律性，即表现为时间特异性和空间特异性。

基因表达的时间特异性是指某一特定基因的表达按一定的时间顺序发生。

如编码甲胎蛋白的基因在胎儿肝细胞中活跃表达，因此合成大量的甲胎蛋白。

在成年后该基因的表达水平很低，几乎检测不到ATP。

但是，当肝细胞发生转化形成肝癌细胞时，编码ATP的基因又重新被激活，大量的AFP被合成。

空间特异性是指多细胞生物个体在某一特定生长发育阶段，同一基因在不同的组织器官表达不同。

在多细胞生物个体某一发育、生长阶段，同一基因产物在不同的组织器官表达水平是不一样的。

在个体生长、发育过程中，一种基因产物在个体的不同组织或器官表达，即在个体的不同空间出现，这就是基因表达的空间特异性。

5．已知一个编码蛋白质的cDNA序列，如何才能得到相应的蛋白质？
1、从基因文库或cDNA文库中分离目的基因或通过pcr扩增得到目的基因；
2、体外构建重组DNA分子，选择合适的克隆载体如PBV220，用限制型内切酶分别加工外源基因与载体DNA，再用T4DNA连接酶连接外源基因与载体DNA，构建出重组质粒DNA分子；
3、重组质粒DNA导入宿主细胞：制备感受态大肠杆菌宿主细胞DH5α，将重组题分子导入宿主细胞，涂布在含有Amp的LB固体平板上，37℃培养；
4、挑选单菌落，提取质粒，用限制性内切酶酶切鉴定，如果酶切产物的大小为2.7kb左右，则通过测序确认序列的正确性；
5、表达：将所得阳性克隆在30℃培养适当时间，使得菌密度较高以后，升温42℃诱导基因的表达，2~3小时以后，离心收集菌体，用SDS-PAGE检测目的基因的表达；
6、纯化：破细胞后用适当的方法纯化出目的蛋白。

6．结合你的课题，举例说明你的硕士阶段可能会用到的3种分子生物学技术（如果研究领域不涉及分子生物学技术，可简单谈谈自己研究领域的前景）
答：（1）Western Blot，所谓免疫印迹是一种将凝胶电泳与固相免疫结合起来的分子生物学技术。

就是把正常的细胞打碎，分离出
各种蛋白质抗原，经特殊的电泳(SDS-PAGE)方法分离并转移到一张硝酸纤维薄膜(NC)或PVDF膜上固定。

由于各种抗原分子量大小不同，所以在电场中泳动的速度不同，在硝酸纤维薄膜上所占据的位置也不同，各种抗原有它相应固定的位置。

然后把标记的特异性抗体与薄膜上的抗原结合，通过标记的抗原抗体反应就能显示出可见的结果。

（2）ELISA的基础是抗原或抗体的酶标记。

结合在固相载体表面的抗原或抗体仍然保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。

在测定时，受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。

用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。

再加入酶标记的抗原或抗体，加入没反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据成色的深浅进行定性或定量分析。

由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

（3）PCR：PCR技术又称聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction）技术，是一种在体外（试管、切片…）扩增核酸的技术。

该技术模拟体内天然DNA的复制过程。

其基本原理是在模板、引物、4种dNTP 和赖热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。

每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。

每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次，介于两个引物之间的新生DNA片段理论上达到230拷贝（约为109个分子）。

PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性。

RNAi与miRNA介导的调控
非编码RNA：rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，RNAi，siRNA，miRNA
核仁小分子RNA（snoRNA）是一类广泛分布于真核生物细胞核仁的小分子非编码RNA，具有保守的结构元件.分为3大类：boxC／D snoRNA 、boxH／ACA snoRNA 、MRP RNA。

研究发现，snoRNA除了在核糖体RNA的生物合成中发挥作用之外，还能够指导snRNA、tRNA 和mRNA的转录后修饰。

此外，还有相当数量的snoRNA功能不明，被称为sn0RNA（orphansnoRNA）。

在哺乳动物的snoRNA中，印迹snoRNA（imprintedsnoRNA）是最为特殊的一群，由基因组印迹区编码，具有明显的组织表达特异性。

原核生物古细菌中类snoRNA 的鉴定表明这些非编码RNA家族成员的古老起源；而哺乳动物中大量的snoRNA反转座子的存在更为人们探索snoRNA在基因组中扩增和功能进化提供了新的思路。

小核RNA(small nuclearRNA，snRNA)。

它是真核生物转录后加工过程中RNA剪接体（spilceosome）的主要成分，参与mRNA前体的加工过程。

现在发现有五种snRNA，其长度在哺乳动物中约为100-215个核苷酸。

snRNA一直存在于细胞核中，与40种左右的核内蛋白质共同组成RNA剪接体，在RNA转录后加工中起重要作用。

另外，还有端粒酶RNA(telomeraseRNA)，它与染色体末端的复制有关；以及反义RNA(antisenseRNA)，它参与基因表达的调控。

RNA干涉（RNAi）：①RNAi 是指通过反义RNA与正链RNA 形成双链RNA 特异性地抑制靶基因的现象,它通过人为地引入与
内源靶基因具有相同序列的双链RNA(有义RNA 和反义RNA) ,从而诱导内源靶基因的mRNA 降解,达到阻止基因表达的目的。

② RNAi是指体外人工合成的或体内的双链RNA（dsRNA）在细胞内特异性的将与之同源的 mRNA降解成21nt～23nt 的小片段，使相应的基因沉默。

③ RNAi是将与靶基因的mRNA 同源互补的双链RNA(dsRNA ) 导入细胞,能特异性地降解该mRNA ,从而产生相应的功能表型缺失, 属于转录后水平的基因沉默(post - transcriptional gene silence , PTGS)。

小的干涉RNA（siRNA）是在RNA干涉过程中人工体外合成的小片段RNA，由约20个碱基对组成，包括5个磷酸盐，2个核苷和3个悬臂。

SiRNA在RNA沉默通道中起中心作用，是对特定信使RNA （mRNA）进行降解的指导要素。

小的干涉RNA（siRNA）是在RNA干涉过程中人工体外合成的小片段RNA，由约20个碱基对组成，包括5个磷酸盐，2个核苷和3个悬臂。

SiRNA在RNA沉默通道中起中心作用，是对特定信使RNA （mRNA）进行降解的指导要素。

miRNAs是一种21－25nt长的单链小分子RNA，其结构特征如下：广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，它本身不具有开放阅读框（ORF）；成熟的miRNA，5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。

成熟的miRNA 5’端的磷酸基团和3´端羟基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。

miRNA独有的特征是其5＇端第一个碱基对U有强烈的倾向性，而对G却有抗性，但第二到第四个碱基缺乏U，一般来讲，除第四个碱基外，其他位置碱基通常都缺乏C。

MiRNAs具有高度的保守性、时序性和组织特异性。

RNAi（RNA干涉）技术及其应用
RNAi技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA 从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。

RNAi的命名来源于安德鲁·法尔1998年在《自然》杂志上的论文。

研究发现，双链RNA是RNAi的触发物，引发与之互补的单链RNA （ssRNA, single- stranded RNA）的降解。

经过Dicer（一种具有RNAase III活性的核酸酶）的加工，细胞中较长的双链RNA（30个核苷酸以上）首先被降解形成21～25个核苷酸的小分子干扰核糖核酸（siRNA，short interfering RNA ），并有效定位目标mRNA。

siRNA是引发转录后基因沉默中序列特异性RNA降解的重要中间媒介，它具有特殊的结构特征，即5’端磷酸基团和3’端的羟基，其两条链的3’端各有两个碱基突出于末端。

由siRNA中的反义链参与指导合成被称为RNA诱导的沉默复合体（RISC）的核蛋白体，再由RISC介导切割目的mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而实现干扰靶基因表达的功能。

PCR 及分子标记
三步：变性，低温退火，延伸。

PCR循环：95度去变性双链DNA，55度去使引物结合，72度聚合延伸。

Mg2+,dNTPs，模板引物，缓冲液，酶，是必须得。

历史
60s-70s：基因的体外分离技术。

Khorana（1971）：美国MIT教授、1968年诺贝尔医学奖得主“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。

核酸体外扩增最早设想遗忘:
当时很难进行测序和合成寡核苷酸引物；
当时(1970)Smith等发现了内切酶，体外克隆基因成为可能
Kary Mullis(1985)
发明过程
Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到:
“这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA片段的方法是在不可想象的情况下，•即驾车行驶在月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。

发展过程：
开始使用大肠杆菌•DNA聚合酶Klenow片段，该酶不耐热，每次加热变性DNA后都要重新补加。

耗时、费力、易出错。

耐热DNA聚合酶的应用使得自动化。

原理
类似于DNA的体内复制。

首先待扩增DNA•模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。

•这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR 就是在合适条件下的这种循环的不断重复。

•程序：template(DNA or RNA),模板
•primers,引物
•Taq enzyme,
•10×PCR buffer,
•Mg++,
•5mmol/L dNTPs
Primer design引物的设计原则（大家写英文）
Most imp.
(1)length: 20～30bp
(2)G+C contents:ATCG random distributed随机分布
(3)primers : no complementary sequence
(4)3‘end of the primer: no modification
(5)5‘end of the primer:product length，can be modified
(6) specificity:less than 70% homology with non-specific
amplification sequence, or 8bp continuous complementary base
PCR reaction components and their functions
template：ssDNA, dsDNA
mRNA needed to be RT as cDNA
samples：from blood,sperm or any other tissue,from older forensic specimens法院, from ancient biological samples or in the lab实验室的生物标本. From bacterial colonies 细菌or phage plaques.
噬菌体
DNA：very stable
Primes引物Store:纯化引物在25％乙腈溶液中4℃；冻干引物于-20℃可保存1-2年，液体状态于-20℃可保存6个月。

不用时应-20℃保存。

Buffer:10-50mmol/L Tris-HCl(pH8.3-8.8, 20℃)。

Mg2+：for Taq polymerase activity
conc.:Low:low activity
high: non-specific amplification
dNTPs：贮备dNTP液：1 mol/L NaOH 调pH至中性。

贮备浓度为5-10mmol/L，终浓度为20-200umol/L，分装-20℃保存。

4种dNTP浓度应相同。

Taq DNA polymerase：
from thermophilic bacteria.
Taq polymerase from Thermus aquaticus.
other thermostable DNA polymerase with greater accuracy used for certain applications.
mineral oil
Selection for DNA polymerase
Klenow酶
早期采用
该酶不耐热，缺点有
①温度要求低(37℃)，受热即失活；
②产物特异性不高；
③积累大量的失活残酶，使反应产物纯度大大降低；
④扩增的最长序列约400bp（Taq酶则能扩增10kb）
Taq DNA聚合酶
•分离:1969年，美国黄石国家公园温泉
•分子量:94KDa
•活性：在几种水生栖热菌中活性最高，200 000U/mg
离子需要：对Mg2+、单价离子性质和浓度较敏感。

最适浓度为50mmol/L。

忠实性:没有校正单核苷酸错配功能--致命弱点。

一般出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环，利用PCR克隆、测序时尤应注意。

抑制剂:尿素、乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、SDS•及许多其他化学药剂。

内源DNA:不同来源的酶可能由于制备过程中残留的原细菌DNA 或PCR产物的污染而含有不明来源的DNA。

在使用扩增保守序列的通用引物时，会在无模板对照管出现扩增带。

保存:在-20℃至少6个月。

PCR optimization优化
变性温度和时间
92-95℃，富含G和C的序列，可适当提高，但过高或时间过长都会导致酶活性损失。

退火温度与时间
引物中G、C含量高、•长度长并与模板完全配对时，应提高温度。

温度越高，产物特异性越高。

通常37-55℃、1-2分钟。

延伸温度和时间
温度：72℃，接近Taq酶的最适75℃
时间：过长会导致产物非特异性增加。

但对低浓度的目的序列，则可适当增加时间。

循环次数
循环过多，非特异性产物大量增加
PCR污染及其对策
强大扩增能力+检测的敏感性
极微量的污染便可导致假阳性
污染源的追踪
①点样器和加样器;②离心机;③微解剖刀;④浓缩用具、真空瓶;⑤电泳装置;⑥紫外灯箱;⑦乙醇或水浴锅;⑧冰箱门把手、实验台面等
污染的预防
(1)隔离不同操作区
(2)分装试剂
(3)改进实验操作
(4)专用加样器
(5)结果的重演
PCR技术的应用
遗传性疾病
地中海贫血的基因诊断
血友病
苯丙酮尿症
传染性疾病
法医学
个人识别、亲子鉴定
1985年，英国遗传学家Jeffreys采用DNA
指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。

•
有时犯罪物证量很少，不足以用来进行DNA指纹分析，PCR有效解决这些问题。

对于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性别鉴定中PCR技术被普遍采用。

植物遗传育种
构建遗传图谱、分离目的基因、基因定位
分子标记辅助育种了解不同品种间的亲缘关系、系统进化
畜牧
畜禽病诊断:猪伪狂犬病毒、猪口蹄疫病毒、猪瘟病毒、牛白血病毒、牛病毒、性腹泻病毒、免疫缺陷病毒等检测
性别鉴定：牛、绵羊Y染色体上特异DNA片段
构建基因图谱
检测基因整合与表达：转基因鱼
植物保护
杀虫病原微生物的基因型鉴定
植物病原微生物分类:形态学上相似性和潜在的血清学交互反应，用常规方法难以区分，采用反转录PCR（RT-PCR）可准确快速区分
其他
①考古学
②植物分类学
③群体生态学
Molecular marker
Introduction
形态标记、细胞学标记、生化标记
数十种技术问世。

万变不离其宗：分子杂交、PCR扩增
第一类：电泳、分子杂交为核心
代表：RFLP、DNA指纹
第二类：电泳、PCR为核心
代表：RAPD、SSR、AFLP
第三类：DNA序列为核心
代表：ITS测序分析
优点：数量丰富、信息量大；与生长发育无关，取材不受限制；
较多共显性，信息量完整
在真核生物中，基因组DNA多态性要远远多于各种基因的遗传多态性，因为基因组中存在着大量的不编码的DNA序列，它们的变异不受或较少地受自然选择的制约
•应用：种质资源研究
•品质纯度鉴定（包括DNA指纹鉴定）
•构建遗传连锁图
•基因定位（QTL）
•标记辅助选择
•比较基因组研究
•基因克隆（图位克隆）
•生物起源、进化、医学及法医学
RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)
by Botstein(1980)
基本原理：物种的基因组DNA在限制性内切酶作用下，产生相当多的大小不等的片段，用放射性同位素标记的DNA作探针，把与被标记DNA相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱。

优点:共显性，非常稳定
缺点：检测步骤多，周期长，费时、费钱；
用作探针的DNA克隆制备、保存不方便；
放射性同位素
自从人的RFLP图谱构建后，又分别构建了果蝇、牛、大豆、小麦、水稻等多种生物的RFLP图谱。

与常规PCR的不同
A.引物长度短
常规PCR中需要两个引物，长度20-30个核苷酸。

•RAPD只需一个引物，长度9-10个核苷酸，而且是随机引物。

B.退火温度低
RAPD引物短，因此退火温度要低，一般为35-37℃。

通用性
--实验步骤少，省工、省力、进度快
--不需先知道基因组的任何分子信息
--所用材料不需有性世代，可用任何单一亲本、任何部位的材料，在没有有性世代的线粒体、叶绿体•DNA研究中也可使用；
--引物没有严格的种属界限，同一套引物可用于任何一种植物的研究，具有广泛性和通用性。

植物分子生物学中的应用
用于种属特异性鉴定
外源导入基因的追踪
遗传作图
RAPD标记从理论上讲是无限的，而且在端粒及重复顺序上可以找出RAPD标记位点，因此可以做出很密集、很详细的遗传图来。

鉴定染色体上特异的DNA片段，进行基因定位和分离RAPD易发现多态性，敏感性高。

可找出与靶基因连锁的RAPD 标记，进行基因定位。

AFLP(Amplified Restriction fragment polymorphism)
瑞士Zabeau等1992年发明
结合了RFLP和PCR技术的特点，具有RFLP技术的可靠性和PCR•
技术高效性。

基本原理：对基因组DNA进行酶切，连上双链人工接头，根据接头的核苷酸序列和酶切位点设计引物，进行选择性扩增。

它将RAPD随机性和专一性扩增巧妙结合，再选用内切酶以达选择的目的。

三个步骤
(1)DNA•酶切及人工接头连接，对提取DNA质量要求较高，需避免其它DNA•污染和抑制物质的存在；
(2) 扩增反应；
(3) 通常在4％-6％的变性聚丙烯酰胺凝胶上分离
特点
--理论上，可以采用的限制性内切酶及选择碱基的种类、数目很多，所以标记数目是无限的。

--每次谱带在50-100条之间，多态性检测非常有用
--呈典型的孟德尔方式遗传
--可用于作为遗传图谱和物理图谱的位标。

--可用于分析基因组DNA、克隆的DNA大片段，
—对模板浓度不敏感，即使模板浓度存在差异，也会得到强度一致的谱带。

缺点
专利技术，试剂盒价格贵
需要同位素或非同位素标记引物，须具特殊防护措施、配套仪器设备
基因组的不完全酶切会影响实验结果，所以实验对DNA纯度和内切酶的质量要求较高。

SSR（Simple sequence Repeat ）
=(microsatellite)
=(Short Tandem Repeat,STR)
Satellite DNA：真核生物基因组酶切、离心后，在主带附近会出现（AT）含量很高的简单高度重复序列。

Microsatellite DNA：一类由几个核苷酸（一般1-5个，基序很短）为重复单位串联而成的DNA序列。

继RFLP之后的第二代分子标记
多态性好、重复好、共显性标记
特点
微卫星DNA广泛存在：人和动物（TG）n，
植物（A T）n
微卫星DNA长度的多态性
微卫星DNA两端多是高度保守的单拷贝序列
原理
根据两端序列的保守性，设计引物；进行
PCR，电泳分离，染色显带以检测微卫星序
列多态性。

applications
构建遗传连锁图
种质资源鉴定
标记辅助育种
基因诊断与治疗：一些人类基因病的产生与三核苷酸重复序列动态有关
其他：简单序列重复区间（Inter-simple Sequence Repeat, ISSR)
•序列标记位点（Sequence-Tagged Sites,STS)
•小卫星DNA（Minisatellite DNA)
•单链构型多态性（Single-strand Comformation Polymorphism,SSCP)
变性梯度凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,DGGE) Section 3 Transposition（转座）
A specific form of genetic recombination that moves certain
genetic elements from one DNA site to another.
Movement can occur with or without duplication（复制）of
the element.
Transposons（转座子）can insert within genes or the regulatory sequences
基因组是相对稳定的，基因组中的序列通常处于恒定的位
置。

因此，我们可以通过构建遗传图谱(genetic map)来鉴
定已知基因的基因座。

在分子水平上，每个个体基因组之间的差异主要由重组引
起，但转座元件（transposable element）或转座子
（transposons）的存在也可以造成基因组的改变。

转座子的概念及发现
转座子(transposon 或transposable element)是基因组内
相对独立的、可移动序列，它们不必借用噬菌体或质粒的
形式就可以从基因组的一个部位直接转移到另一个部位，
这个过程称为转座（transposition）。

转座子每次移动时携带着转座必需的基因一起在基因组
内跃迁，所以转座子又称跳跃基因（jumping gene）。

转座子是基因组的正常组成成分，不以独立的形式存在
（如噬菌体或质粒DNA）。

转座的发生不依赖于转座子和
靶位点之间任何的序列同源性，在基因组内由一个部位直
接转移到另一个部位。

转座以很低的频率发生，而且转座子的插入是随机的，
转座子有时插入到一个结构基因或基因调节序列内，引起
基因表达的改变。

转座子也可以引起基因组序列的重排，它们的移动也和进
化有关。

转座元件首先是由Barbara McClintock于40年代在玉米的
遗传学研究中发现的，她称之为控制元件（controlling
element），因为它不仅能够在基因组内转移，而且还能够
改变基因的活性并引起功能的改变。

现在认为转座子存在于地球上所有的生物。

转座子的分类
转座子分为两个基本类型：
一种是以编码蛋白质的DNA序列的形式存在，其编码的
蛋白能直接操作DNA，从而使转座子能够在基因组内繁
殖其自身。

另一种与反转录病毒有关，并且它们可移动的特性来自于
它们能由RNA转录物产生DNA拷贝，这种DNA拷贝然
后被整合到基因组的新位点。

转座子的作用
转座元件可直接或间接地促进基因组的重排。

转座子的间歇的活动性似乎为自然选择提供了一个不确
定的靶部位。

转座子是位于基因组内的一个独立的实体。

转座子与基因
组的这种关系相当于寄生虫与宿主的关系。

转座子的扩增
可能通过产生有害的结果而得到平衡。

在原核和真核细胞内都发现了通过DNA移动的转座子的
存在。

插入序列
最简单的转座子被称为插入序列IS（insertion sequences,
IS）。

IS元件是细菌染色体和质粒的正常组成部分。

最早被鉴定的转座元件是细菌操纵子中的自主插入序列。

这种插入阻止了插入部位基因的转录和/或翻译。

IS元件是独立的结构单位，每个元件只编码为自身转座所
需要的蛋白质。

IS元件的末端为短的反向末端重复序列（inverted terminal
repeats），通常这两个拷贝密切相关，但并不完全一样。

在插入部位，IS DNA总是和很短的正向重复序列（direct repeats）相连。

但在插入之前靶部位只有这两个重复序列中的一个。

转座后在转座子的两侧各存在一个此序列的拷贝。

转座的结果是靶部位序列形成了两个正向重复序列
IS元件具有一个典型的结构，它的末端为反向重复序列，
而与其相连的宿主DNA的末端为短的正向重复序列。

当在一段DNA序列中见到这种结构类型时，可被用来鉴
别转座子。

反向重复序列标明了转座子的末端。

所有类型转座子的转
座皆需转座酶（transposase）对末端的识别。

阻止转座的“顺式作用”（cis-acting）突变位于末端。

除IS1之外，所有的IS元件皆含有一个单一的长编码区，其起始于一端的反向重复序列之内，而刚好终止于另一端的反向重复序列之前或之内，它编码转座酶。

复合型转座子
因为臂由IS组成，每个IS具有通常的反向重复末端结构，
因此复合型转座子具有同样的短的反向重复末端。

一个功能性的IS结构单位能转座它本身或整个转座子。

对于复合型转座子来说，随着中央序列的增长，转座的频
率降低。

所以长度的依赖性是决定普通复合型转座子大小
的一个因素。

支持复合型转座子转座的一个主要的动力是对中心区所
携带的标志的选择。

转座发生的机制
转座子插入到一个新的部位的通常步骤是：在靶DNA上
制造一个交错的切口，然后转座子与突出的单链末端相连
接，并填充切口。

交错末端的产生和填充解释了在插入部位产生靶DNA正
向重复的原因。

链的切口之间的交错决定了正向重复的长
度。

三种不同类型的转座
（1）复制型转座（replicative transposition）作为自身移动
的一个部分，转座子被复制，一个拷贝仍然保留在原来的
位置上，而另一个则插入到一个新的部位，这样转座过程
伴随着转座子拷贝数的增加。

2）非复制型转座
转座元件作为一个物理实体直接由一个部位转移到另一个部位。

3）保守型转座
保守型转座是另一种非复制型的转座过程，该过程中转座
元件从供体部位被切除并通过一系列的过程插入到靶部
位，在该过程中每个核苷键皆被保留。

该转座过程与λ的整合机制类似，并且转座酶与λ整合酶
家族有关。

除了引起在新部位序列插入的简单分子间转座之外，转座子还能促进其他类型的DNA重排。

任何一对正向重复序列之间的重组会导致它们的序列的缺失；而一对反向重复序列之间的交互重组可能使重复序列之间的序列被倒位，而重复序列本身被保留
反转座子和反转录病毒
转座元件或转座子是基因组中可移动的独立的DNA序
列，一个转座子可由基因组的一个位置移到另一个位置。

从DNA到DNA的转移过程称为转座。

从DNA到RNA
再到DNA的过程称为反转座。

反转座是经RNA介导的转座过程
必须经过RNA中间体的转座过程是真核生物所特有的。

一些真核细胞的转座子和反转录病毒的原病毒的一般组
成结构相关，并且通过RNA中间体进行转座，这一类结
构单位称为反转座子（retroposons）。

反转座子共有的可鉴定的特性为：插入位点会产生短的靶
序列的正向重复。

反转录病毒首先被观察到的是以传染性病毒颗粒的形式存在，并能在细胞间传播；而反转座子是被当作基因组中的一部分而被发现的，它们可以在基因组内进行转座，但不能在细胞间迁移
酵母双杂交系统应用：
•鉴定新的蛋白与蛋白相互作用
•鉴定蛋白级联底物
•鉴定突变对蛋白与蛋白结合的影响
•在已知的相互作用中鉴定干扰蛋白质(反向双杂交系统)
酵母双杂交的原理：
•利用酵母作为真核蛋白相互作用的模型
•利用诱饵质粒筛选文库或者单个已知蛋白
•通过报告基因的转录鉴定蛋白的相互作用
•使用不同的培养基筛选阳性克隆
•酵母双杂交是用于识别与蛋白质相互影响。

文库筛选的步骤：
•将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构建诱饵质粒
•将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞株中，选择被转化的酵母
•再将文库质粒转化到酵母中
•通过报告基因的功能筛选相互作用的蛋白
序列分析：从酵母中分离质粒然后转化E. coli
•从大肠杆菌中提取质粒并测序
•在数据库中比对所测定序列与已知蛋白的同源性。