高效液相色谱法测定人血清中氯氮平浓度

高效液相色谱法测定人血清中氯氮平浓度
【摘要】目的建立测定人血清中氯氮平药物浓度的高效液相色谱法。

方法采用SHIMADZU高效液相色谱系统,ODS.柱,SPD-10A检测器,C-R6A记录仪,SK-I型快速混匀器,SB2200型超声波清洗器,BHw-I型电热恒温水箱,LC-10A 泵。

流速:1 ml/min;检测波长:254 nm;柱温:25 ℃;流动相:甲醇/水(66.6 ∶33.3),以乙醚为提取剂。

结果低、中、高浓度(100、200、400 μg/L)含药血清样品作日内、日间测定,回收率均＞90%,精密度RSD均＜5%。

【关键词】氯氮平;血清药物浓度;高效液相色谱法
氯氮平是国内常用的第2代抗精神病药,于20世纪60年代中期试用于临床。

我国于20世纪70年代中期开始应用氯氮平。

到上世纪90年代,在某些精神病院,氯氮平的使用已上升到第一位。

氯氮平对精神病阳性和阴性症状均有良好的疗效,且抗精神病作用和镇静作用强,较少引起锥体外系反应(EPS)。

但随着精神科临床的广泛使用,其不良反应也随之增多[1]。

氯氮平一般不良反应如心动过速、低血压、镇静等随着治疗时间的延续会产生耐受性而逐渐减轻或消失。

其严重不良反应主要为粒细胞缺乏症和癫痫发作[2]。

它所引起的粒细胞缺乏可能因继发感染导致死亡,已引起临床重视。

氯氮平作为一种疗效相对突出,较易耐受,加之价格低廉,受到许多医生的青睐,但其存在的诸多不良反应,又使其备受争议。

通过密切监测血药浓度和血象,可以预测其疗效和不良反应的发生。

氯氮平血药浓度个体差异很大[3],对其进行监测,为临床合理用药提供可靠依据是完全必要,且非常重要的[3]。

尤其对于那些由于浓度低而疗效不好的患者是有帮助的。

1 仪器和试剂
1.1 仪器采用SHIMADZU高效液相色谱系统,ODS.柱,SPD-10A检测器,C-R6A记录仪,SK-I型快速混匀器,SB2200型超声波清洗器,BHW2-I型电热恒温水箱,LC-10A泵。

1.2 试剂甲醇为色谱纯,氢氧化钠和乙醚为分析纯,水为超纯水。

氯氮平对照品(Sigma公司,含量＞99%),内标物为安定(广州化学试剂厂,含量＞99%)。

1.3 对照品和内标溶液精密称取氯氮平10.0 mg加甲醇溶解并定容至10.0 ml,置冰箱4℃保存。

此为工作母液,临用时用甲醇稀释成所需浓度的氯氮平对照品溶液。

配制浓度为1 mg/ml的安定甲醇溶液作为工作内标液。

2 方法与结果
2.1 色谱条件流速:1 ml/min;检测波长:254 nm;柱温:25℃;流动相:甲醇/水(66.6∶3
3.3),每次检测前新鲜配制,超声脱气10 min。

2.2 标准应用液的配制取氯氮平对照品溶液适量以甲醇稀释成200 ng/10 μl 的标准应用液。

取安定标准品溶液适量配成500 ng/10 μl的安定标准应用液。

2.3 样品处理方法取服用氯氮平一周后的患者血清500μl,加0.5 mol/l的NaOH溶液100 μl,加内标安定10μl,乙醚3 ml,旋涡混匀2 min,自然分层30 min,吸取乙醚层2.5 ml,60 ℃水浴挥干,加100μl甲醇充分溶解残留物,取5μl进样分析。

2.4 计算方法本法是采用高度内标法定量的色谱分析方法,以欲测组分氯氮平和内标安定的峰高之比来定量计算血清中氯氮平浓度。

2.5 标准曲线的绘制分别取6支带磨口塞的提取管,各加入10 μg/ml内标安定标准品10 μl,并依次加入10 μg/ml(即10 ng/μl)氯氮平标准品液0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 μl,再分别加入正常人空白血清0.5 ml,0.5 mol/l NaOH 100 μl。

如上述方法提取、挥干、溶解,取10 μl进样。

以氯氮平峰高与内标安定峰高之比值作为纵坐标,氯氮平浓度作为横坐标绘成标准曲线。

不同浓度氯氮平峰高与内标安定峰高之比值(Hc/Hv)和氯氮平浓度(C)的关系见表1。

用线性相关与回归方程计算得:y=0.002142 x-0.02065,r=0.99979。

回归方程线性拟合图见图1。

表1
峰高比(Hc/Hv)和氯氮平浓度(C)的关系
氯氮平浓度(μg/L)501002004008001600
峰高比(Hc/Hv)0.107400.214940.396370.789561.702803.41349
图1 回归方程线性拟合图
2.6 精密度与回收率取低、中、高浓度(100、200、400 μg/L)含药血清样品各5份标本作日内测定,得日内误差。

三种浓度每天各测1份,共测5 d,作日间测定,得日间误差。

得到的相对提取回收率均大于90%。

结果表明,该方法符合生物样品分析要求(见表2)。

表2
相对回收率与日内、日间精密度(n=5)
浓度(μg/L)回收率(%)
日内日间
平均测得量(μg/L)RSD(%)
平均测得量(μg/L)RSD(%)
100101.71101.711.97103.320.46
200100.52201.040.38202.681.51
40099.39397.542.59400.253.66
3 讨论
HPLC法具有高效快速、灵敏度高、选择性好的特点,在氯氮平血药浓度研究中已被广泛采用。

本实验以氯氮平标准系列浓度为横坐标,不同浓度值所对应的氯氮平峰高与内标安定峰高之比值为纵坐标,求得回归曲线r=0.99979,线性关系良好。

另以低、中、高浓度(100、200、400 μg/L)含药血清样品作日内、日间测定,回收率均大于90%,精密度RSD均＜5%。

该方法简单、易行,适用于临床,结果可靠。

参考文献
[1] 崔日玲.氯氮平的严重不良反应.药物研究,2006,3(5):61.
[2] 何斌,丁跃庆,王传跃.国内氯氮平引起白细胞减少和粒细胞缺乏文献回顾.中国医院用药评价与分析,2003,3(5):307-311.
[3] 唐亚芳,周淑茹.高效液相色谱法测定氯氮平血药浓度的改进.现代实用医学,2001,13(12):621-622.。