牛诱导型热休克蛋白72多克隆抗体的制备
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对 表 达产 物 用 ＨＴ ａ ｈｌｔ ｇ｝ ｉｒｐＣ ｅ ｉ ｜ ａ ｎ Ｐ亲 和层 析 柱纯 化 ， 冷
冻 干燥 。 以健 康 家 兔 作 为 免 疫 对 象 ， 疫 前 采 血 制 备 血 清 作 免
为 对 照 。 用 纯 化 的 融 合 蛋 白 作 为 免 疫 原 ， 下 多 点 注 射 皮
・
４・
《 上海 畜牧 兽 医通讯》 ２ １ ０ ０年 第 ３期
牛诱 导型 热休 克蛋 白 ７ ２多克 隆抗 体 的制 备
姜 斐 斐 田 文 儒 高善 颂 王 恺 王 小 伟 ２ ６０ ６ １ ９） （青 岛 农 业 大 学 动 物 科 技 学 院 山 东 青 岛
【 要 】 扩 增 的诱 导 型 Ｈ ｐ ２的 部 分 基 因 片段 克隆 到 ｐ 摘 将 ｓ７ ＭＤ一１ Ｔｖｃ ｒ ８ ｅｔ 中测 序 。将 阳性 克 隆 的 Ｐ Ｒ产 物 克 隆 ｏ Ｃ
（ 进 行 双 酶 切 ， 回 收切 开后 的 载 体 。将 目的基 因 及 载体 ＋） 胶
用 Ｔ Ｎ 连 接酶 进 行 连 接 构 建 出 表 达 载 体 ｐ Ｔ一３ ａ ４Ｄ Ａ Ｅ ２ —Ｃ
产生 的一 类 蛋 白质 ， 遍 存 在 于 真核 和 原 核 细 胞 中 。研 究 发 普 现 ， 菌 、 物 和 全 部 动 物 细胞 内 ， 受 到 热应 激 刺 激 后 均 有 细 植 纯 度 的 Ｈｓ７ 获 ｐ２并 免 疫 兔 子 ， 得 效 价 获 高 、 异 性 高 的抗 Ｈ ｐ２多 克 隆 抗 体 血 清 ， 研 究 Ｈｓ７ 特 ｓ７ 为 ｐ２的
相 关 功 能提 供 条 件 。
１５ 融 合 蛋 白 多克 隆 抗 体 的 制 备 ．
Ｐ ＡＧＥ电 泳 ， １ ５ ０ ０稀 释 的 Ｓ ｒｓｇ ｎ诱 导 型 Ｈｓ ７ 以 ： ０ ｔｅｓ ｅ ｐ ０抗
体 （ ． ／ ） １ ０ｍｇ ｍ１为一 抗 ， １ ３ ０ ０稀 释 的 Ｈ Ｐ标 记 羊 抗 兔 以 ： ０ Ｒ ＩＧ ２ ０ ｍｇ ｍ１为 二 抗 进 行 Ｗ ｅ ｅｎ—ｂ ｔ ｎ ｇ （ ／ ） ｓｒ ｔ ｌ ｔ ｇ检 测 抗 体 的 ｏｉ
—
并在 应 激 中 发挥 分 子 伴 侣 作 用 的 重 要 蛋 白质 【 。研 究 指 出 ： ３
Ｈ ｐ ２能 够保 护 细 胞 免 受 热 和 （ ） 血 诱 导 的 细 胞 凋 亡 和 ｓ７ 或 缺 细 胞 坏 死 ， 细 胞 蛋 白质 恢 复 原 有 的 功 能 ’ ； 核 细胞 的胞 使 单 内 Ｈ ｐ２ ￣ 诱导 能够抑制炎症 因子释 放 ， Ｖ 维护细胞 基本生存 ］ 。 本研 究 旨在 构 建 一 个 能 够 在 原 核 细 胞 高 效 表 达 Ｈ ｐ ２ ｓ ７
１ｍｌ蛋 白 和佐 剂 各 半 ， １ 免 疫 一 次 ， ， 每 ０ｄ ３次 免疫 后 制 备 血 清进 行 检测 。
１ 材 料 和 方 法 １ １ 材 料 ．
Ｔｑ 、 ａ 酶 限制 性 内 切 酶 Ｅ ｏ ｃ ＲＩ和 Ｈ ｎ ｌ和 Ｔ Ｎ 连 ｉｄ Ｉ ｌ ４Ｄ Ａ
接 酶 均 购 自大 连 宝 生 物 工 程 有 限 公 司 ， Ｎ 提 取 试 剂 盒 购 Ｄ Ａ
司， Ｒ Ｈ Ｐ标 记 羊抗 兔 ＩＧ 购 自武 汉 博 士 德 公 司 ， Ｃ ＭＷｅｔ ｇ Ｋ Ｔ ｓ．
ｅｎ ｌ 检 测 试 剂 盒 购 于 Ｋ Ｇ Ｈ Ｎ 公 司 ， 白 质 Ｍａｋ ｒ —ｂ ｔ ｏ ＡＮ Ｃ Ｅ 蛋 ｒ 购 自 Ｉ ｖ ｒｇ ｎ 司 ， 染 蛋 白 质 分 子 质 量 标 准 购 自碧 云 天 ｎ ｉｏｅ 公 ｔ 预 生 物 技 术 有 限 公 司 ， ｉ ｒｐ Ｃ ｅ ｔ ｇ ＨＰ亲 和 层 析 柱 购 自 Ｈ Ｔ ａ ｈ ｌ ｉ ａｎ
反 应原 性 。Ｗｅｔｒ ｓｅｎ～ｂｏ 检 测 证 明 ， ｌｔ 所制 备 的 多克 隆 抗 体 可 以 与 Ｈｓ ７ ｐ ２特 异 性 结 合 。
关 键 词 ： 导 型 热休 克蛋 白 ７ ； 体 构 建 ； 核表 达 ； 诱 ２载 原 多克 隆抗 体 血 清 热 休 克 蛋 白 （ ｅ ｔ ｈ ｃ ｒ ｔ ｎ ， ｓ ｓ 是 细 胞 受 应 激 后 ｈ ａ ｓｏ ｋ ｐｏｅ ｓ Ｈ ｐ ） ｉ
到 质 粒 ｐ Ｔ一３ ａ （ 中 ， 将 重组 表 达 载 体 转 化 Ｅ ｃｌ Ｂ ２ （ Ｅ ） Ｅ ２ —ｃ ＋） 并 ．ｏ Ｌ １ Ｄ ３ 。重 组表 达 载 体 酶 切 鉴 定 ， 大肠 杆 菌 中 经 ｉ 在 ＩＴ Ｐ Ｇ诱 导表 达 有 活性 的 可 溶性 蛋 白 。采 用纯 化 后 的 Ｈ ｐ ２免 疫 家兔 ， 备 抗 血 清 ， ｅｔ ｎ ｌ 检 测 重 组抗 原 的 ｓ７ 制 Ｗ ｓ ｒ —ｂ ｔ ｅ ｏ
自 Ｐ ｏ ｇ 公 司 ， 回 收 试 剂 盒购 自北 京 赛 百 盛 生 物 有 限 公 ｒｍｅ ａ 胶
１ ６ 免 疫 后 兔 血 清 的 特 异 性 检 测 ．
将 重 组 蛋 白 经 Ｓ Ｓ—Ｐ Ｇ 后 ， 模 ， 闭 ， 制 备 的 Ｄ Ａ Ｅ 装 封 以 Ｈ ｐ ２ １ ５ ０ ０ 为 一 抗 ， 抗 兔 ＩＧ—ＨＲ （ ： ０ ） 二 ｓ７ （ ： ０ ） 羊 ｇ Ｐ １ ３０ ０ 为
Ｈ Ｐ的 表 达… 。热 休 克 蛋 白中 最重 要 的 、 度 保 守 的 一 类 是 Ｓ 高 Ｈ ｐ ０ 不 同生 物 的 Ｈ ｐ ０的 氨 基 酸 序 列 有 ５ ％ ～９ ％ 的 同 ｓ７ ， ｓ７ Ｏ ０ 源性 【ｊ ｓ Ｔ ２。Ｈ ｐ ０家族 中 的 Ｈ ｐ ２是 一 个 可 以 被 应 激 所 诱 导 ｓ７
（ 一Ｃ Ｅ ＋） 。ｐ Ｔ一３ ａ—ｃ 十） ２ （ 一Ｃ转 化 Ｅ．ｏ ５ 感 受 态 细 ｃｉＤＨ ａ ｌ
胞 ， 取 阳性 菌 液 中 的质 粒 （ 姆 布 鲁 克 等 ，０ ２ ， 提 萨 ２ ０ ） 进行 Ｐ Ｒ Ｃ
和酶 切 鉴 定 。
１ ４ Ｗ ｅｔｒ ． ｓｅ ｎ—ｂｏ 检 测 重 组 蛋 白 ｌｔ 将诱导表达菌和未诱 导 表达对 照菌全 菌体蛋 白经 Ｓ Ｓ Ｄ
冻 干燥 。 以健 康 家 兔 作 为 免 疫 对 象 ， 疫 前 采 血 制 备 血 清 作 免
为 对 照 。 用 纯 化 的 融 合 蛋 白 作 为 免 疫 原 ， 下 多 点 注 射 皮
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《 上海 畜牧 兽 医通讯》 ２ １ ０ ０年 第 ３期
牛诱 导型 热休 克蛋 白 ７ ２多克 隆抗 体 的制 备
姜 斐 斐 田 文 儒 高善 颂 王 恺 王 小 伟 ２ ６０ ６ １ ９） （青 岛 农 业 大 学 动 物 科 技 学 院 山 东 青 岛
【 要 】 扩 增 的诱 导 型 Ｈ ｐ ２的 部 分 基 因 片段 克隆 到 ｐ 摘 将 ｓ７ ＭＤ一１ Ｔｖｃ ｒ ８ ｅｔ 中测 序 。将 阳性 克 隆 的 Ｐ Ｒ产 物 克 隆 ｏ Ｃ
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用 Ｔ Ｎ 连 接酶 进 行 连 接 构 建 出 表 达 载 体 ｐ Ｔ一３ ａ ４Ｄ Ａ Ｅ ２ —Ｃ
产生 的一 类 蛋 白质 ， 遍 存 在 于 真核 和 原 核 细 胞 中 。研 究 发 普 现 ， 菌 、 物 和 全 部 动 物 细胞 内 ， 受 到 热应 激 刺 激 后 均 有 细 植 纯 度 的 Ｈｓ７ 获 ｐ２并 免 疫 兔 子 ， 得 效 价 获 高 、 异 性 高 的抗 Ｈ ｐ２多 克 隆 抗 体 血 清 ， 研 究 Ｈｓ７ 特 ｓ７ 为 ｐ２的
相 关 功 能提 供 条 件 。
１５ 融 合 蛋 白 多克 隆 抗 体 的 制 备 ．
Ｐ ＡＧＥ电 泳 ， １ ５ ０ ０稀 释 的 Ｓ ｒｓｇ ｎ诱 导 型 Ｈｓ ７ 以 ： ０ ｔｅｓ ｅ ｐ ０抗
体 （ ． ／ ） １ ０ｍｇ ｍ１为一 抗 ， １ ３ ０ ０稀 释 的 Ｈ Ｐ标 记 羊 抗 兔 以 ： ０ Ｒ ＩＧ ２ ０ ｍｇ ｍ１为 二 抗 进 行 Ｗ ｅ ｅｎ—ｂ ｔ ｎ ｇ （ ／ ） ｓｒ ｔ ｌ ｔ ｇ检 测 抗 体 的 ｏｉ
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并在 应 激 中 发挥 分 子 伴 侣 作 用 的 重 要 蛋 白质 【 。研 究 指 出 ： ３
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１ｍｌ蛋 白 和佐 剂 各 半 ， １ 免 疫 一 次 ， ， 每 ０ｄ ３次 免疫 后 制 备 血 清进 行 检测 。
１ 材 料 和 方 法 １ １ 材 料 ．
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反 应原 性 。Ｗｅｔｒ ｓｅｎ～ｂｏ 检 测 证 明 ， ｌｔ 所制 备 的 多克 隆 抗 体 可 以 与 Ｈｓ ７ ｐ ２特 异 性 结 合 。
关 键 词 ： 导 型 热休 克蛋 白 ７ ； 体 构 建 ； 核表 达 ； 诱 ２载 原 多克 隆抗 体 血 清 热 休 克 蛋 白 （ ｅ ｔ ｈ ｃ ｒ ｔ ｎ ， ｓ ｓ 是 细 胞 受 应 激 后 ｈ ａ ｓｏ ｋ ｐｏｅ ｓ Ｈ ｐ ） ｉ
到 质 粒 ｐ Ｔ一３ ａ （ 中 ， 将 重组 表 达 载 体 转 化 Ｅ ｃｌ Ｂ ２ （ Ｅ ） Ｅ ２ —ｃ ＋） 并 ．ｏ Ｌ １ Ｄ ３ 。重 组表 达 载 体 酶 切 鉴 定 ， 大肠 杆 菌 中 经 ｉ 在 ＩＴ Ｐ Ｇ诱 导表 达 有 活性 的 可 溶性 蛋 白 。采 用纯 化 后 的 Ｈ ｐ ２免 疫 家兔 ， 备 抗 血 清 ， ｅｔ ｎ ｌ 检 测 重 组抗 原 的 ｓ７ 制 Ｗ ｓ ｒ —ｂ ｔ ｅ ｏ
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１ ６ 免 疫 后 兔 血 清 的 特 异 性 检 测 ．
将 重 组 蛋 白 经 Ｓ Ｓ—Ｐ Ｇ 后 ， 模 ， 闭 ， 制 备 的 Ｄ Ａ Ｅ 装 封 以 Ｈ ｐ ２ １ ５ ０ ０ 为 一 抗 ， 抗 兔 ＩＧ—ＨＲ （ ： ０ ） 二 ｓ７ （ ： ０ ） 羊 ｇ Ｐ １ ３０ ０ 为
Ｈ Ｐ的 表 达… 。热 休 克 蛋 白中 最重 要 的 、 度 保 守 的 一 类 是 Ｓ 高 Ｈ ｐ ０ 不 同生 物 的 Ｈ ｐ ０的 氨 基 酸 序 列 有 ５ ％ ～９ ％ 的 同 ｓ７ ， ｓ７ Ｏ ０ 源性 【ｊ ｓ Ｔ ２。Ｈ ｐ ０家族 中 的 Ｈ ｐ ２是 一 个 可 以 被 应 激 所 诱 导 ｓ７
（ 一Ｃ Ｅ ＋） 。ｐ Ｔ一３ ａ—ｃ 十） ２ （ 一Ｃ转 化 Ｅ．ｏ ５ 感 受 态 细 ｃｉＤＨ ａ ｌ
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和酶 切 鉴 定 。
１ ４ Ｗ ｅｔｒ ． ｓｅ ｎ—ｂｏ 检 测 重 组 蛋 白 ｌｔ 将诱导表达菌和未诱 导 表达对 照菌全 菌体蛋 白经 Ｓ Ｓ Ｄ