维生素B2的含量测定
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维生素B 维生素B2的分子荧光测定 一、目的要求
１、了解分子荧光分析法的原理。 了解分子荧光分析法的原理。 掌握用荧光法测定维生素的分析方法。 ２、掌握用荧光法测定维生素的分析方法。 掌握荧光光度计的基本操作方法。 ３、掌握荧光光度计的基本操作方法。
二、方法原理
维生素B2又称核黄素,溶于水,在W为0.05的乙酸溶 0.05的乙酸溶 维生素B 又称核黄素,溶于水, 液中是一个强荧光物质，在中性和酸性溶液中， 液中是一个强荧光物质，在中性和酸性溶液中，对热稳 在碱性溶液中较易被破坏。 定，在碱性溶液中较易被破坏。通过实验确定它的最佳 激发波长（370nm和440nm）和发射波长（560nm）， 激发波长（370nm和440nm）和发射波长（560nm）， 在所确定的波长条件下，测定维生素B2 B2标准系列溶液 在所确定的波长条件下，测定维生素B2标准系列溶液 的荧光强度和浓度的工作曲线。 的荧光强度和浓度的工作曲线。用标准曲线法测定生物 样品（蔬菜）中的维生素B 含量。 样品（蔬菜）中的维生素B2含量。
三、实验步骤 1．标准系列溶液的配制 用吸管移取维生素B 标准贮备溶液10.00mL 用吸管移取维生素B2标准贮备溶液10.00mL 100mL容量瓶中 容量瓶中， 0.05的乙酸稀释至 于100mL容量瓶中，用W为0.05的乙酸稀释至 刻度，摇匀。吸取该稀释溶液(10.0mg (10.0mg·L 刻度，摇匀。吸取该稀释溶液(10.0mg L-1) 0,0.50,1.00,2.00,3.00和4.00mL， 0,0.50,1.00,2.00,3.00和4.00mL，分别放入六 100mL容量瓶中 容量瓶中， 0.05的乙酸稀释至 只100mL容量瓶中，用W为0.05的乙酸稀释至 刻度，摇匀， 刻度，摇匀，此标准系列溶液的浓度分别为 0,0.050,0.10,0.20,0.30和 mg·L 0,0.050,0.10,0.20,0.30和0.40 mg L-1。
四、结果处理 1.在坐标纸上绘制I ~C的工作曲线 1.在坐标纸上绘制If~C的工作曲线 在坐标纸上绘制 2.根据测定的I 2.根据测定的If.x，从工作曲线上查出溶液中维 根据测定的 生素V mg/L） 生素VB2的Cx（mg/L） 3.由下式计算出样品（新鲜蔬菜）中的维生素 3.由下式计算出样品（新鲜蔬菜） 由下式计算出样品 的含量（mg/100g） VB2的含量（mg/100g） mg/100g） 25.00× VB2 （mg/100g）= Cx ×25.00×10-3 100/10） × （100/10）×（1/WS）×100
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
五、实验注意事项
配制标准系列溶液采用5 HAc溶液定容 溶液定容， 1、配制标准系列溶液采用5% HAc溶液定容，配制样 品溶液采用蒸馏水定容。 品溶液采用蒸馏水定容。 mL移液管量取 移液管量取2 mL溶液时必须先吸到满 2、用5mL移液管量取2、3、4mL溶液时必须先吸到满 刻度； 刻度； 用浓度最大的标准溶液找出最佳荧光发射波长， 3 、 用浓度最大的标准溶液找出最佳荧光发射波长 ， 并确定测定时仪器工作条件（ 并确定测定时仪器工作条件（ 选择合适的灵敏度值 与纵坐标放大值）； 与纵坐标放大值） 过滤时先将样品液分批倒入小布袋， 用漏斗接液， 4 、 过滤时先将样品液分批倒入小布袋 ， 用漏斗接液 ， 漏斗下端直接用100mL容量瓶接液 100mL容量瓶接液； 漏斗下端直接用100mL容量瓶接液； 提取液中加10 10% 5 、 提取液中加 10% 双氧水应逐滴加入使高锰酸钾刚 好颜色褪去（边滴边摇） 好颜色褪去（边滴边摇）； 样品液测定条件与标准曲线测定条件一致（ 6 、 样品液测定条件与标准曲线测定条件一致 （ 测定 时所用灵敏度值与纵坐标放大值一致） 时所用灵敏度值与纵坐标放大值一致）；
2.样品溶液制备 2.样品溶液制备 称取50g新鲜蔬菜， 40mL水压汁， 称取50g新鲜蔬菜，加40mL水压汁，将菜 50g新鲜蔬菜 水压汁 汁加入20mL1mol.L HCl和10mL水煮沸1h， 水煮沸1h 汁加入20mL1mol.L-1HCl和10mL水煮沸1h， 冷却，不断搅拌滴加2mol.L NaOH， 冷却，不断搅拌滴加2mol.L-1NaOH，调节 pH为 再用稀HCl调节pH 4.5，过滤， HCl调节pH至 pH为6，再用稀HCl调节pH至4.5，过滤，用 水洗涤样品， 水洗涤样品，洗涤液和过滤液合并定量转移 至100mL容量瓶中，加水稀释至刻度。 100mL容量瓶中，加水稀释至刻度 容量瓶中
3.工作曲线绘制 3.工作曲线绘制 取标准系列溶液之一，试验实验条件， 取标准系列溶液之一，试验实验条件，找 出最佳荧光发射波长。在所确定的波长条件 出最佳荧光发射波长。 下测定标准系列溶液的荧光强度， 下测定标准系列溶液的荧光强度，绘制荧光 强度与浓度的工作曲线。 强度与浓度的工作曲线。 4.测定 4.测定 分别吸取10.00mL样品溶液三份， 10.00mL样品溶液三份 分别吸取10.00mL样品溶液三份，依次置 于三只25.00mL容量瓶中，加入1.25mL冰醋 于三只25.00mL容量瓶中，加入1.25mL冰醋 25.00mL容量瓶中 1.25mL 再加入KMnO 溶液(3%)0.5mL (3%)0.5mL， 酸，再加入KMnO4溶液(3%)0.5mL，放置 2min，边摇边滴H (30%)， 2min，边摇边滴H2O2(30%)，使KMnO4刚 好褪色，用纯水稀释至刻度， 好褪色，用纯水稀释至刻度，在荧光光度计 上分别测定其荧光强
１、了解分子荧光分析法的原理。 了解分子荧光分析法的原理。 掌握用荧光法测定维生素的分析方法。 ２、掌握用荧光法测定维生素的分析方法。 掌握荧光光度计的基本操作方法。 ３、掌握荧光光度计的基本操作方法。
二、方法原理
维生素B2又称核黄素,溶于水,在W为0.05的乙酸溶 0.05的乙酸溶 维生素B 又称核黄素,溶于水, 液中是一个强荧光物质，在中性和酸性溶液中， 液中是一个强荧光物质，在中性和酸性溶液中，对热稳 在碱性溶液中较易被破坏。 定，在碱性溶液中较易被破坏。通过实验确定它的最佳 激发波长（370nm和440nm）和发射波长（560nm）， 激发波长（370nm和440nm）和发射波长（560nm）， 在所确定的波长条件下，测定维生素B2 B2标准系列溶液 在所确定的波长条件下，测定维生素B2标准系列溶液 的荧光强度和浓度的工作曲线。 的荧光强度和浓度的工作曲线。用标准曲线法测定生物 样品（蔬菜）中的维生素B 含量。 样品（蔬菜）中的维生素B2含量。
三、实验步骤 1．标准系列溶液的配制 用吸管移取维生素B 标准贮备溶液10.00mL 用吸管移取维生素B2标准贮备溶液10.00mL 100mL容量瓶中 容量瓶中， 0.05的乙酸稀释至 于100mL容量瓶中，用W为0.05的乙酸稀释至 刻度，摇匀。吸取该稀释溶液(10.0mg (10.0mg·L 刻度，摇匀。吸取该稀释溶液(10.0mg L-1) 0,0.50,1.00,2.00,3.00和4.00mL， 0,0.50,1.00,2.00,3.00和4.00mL，分别放入六 100mL容量瓶中 容量瓶中， 0.05的乙酸稀释至 只100mL容量瓶中，用W为0.05的乙酸稀释至 刻度，摇匀， 刻度，摇匀，此标准系列溶液的浓度分别为 0,0.050,0.10,0.20,0.30和 mg·L 0,0.050,0.10,0.20,0.30和0.40 mg L-1。
四、结果处理 1.在坐标纸上绘制I ~C的工作曲线 1.在坐标纸上绘制If~C的工作曲线 在坐标纸上绘制 2.根据测定的I 2.根据测定的If.x，从工作曲线上查出溶液中维 根据测定的 生素V mg/L） 生素VB2的Cx（mg/L） 3.由下式计算出样品（新鲜蔬菜）中的维生素 3.由下式计算出样品（新鲜蔬菜） 由下式计算出样品 的含量（mg/100g） VB2的含量（mg/100g） mg/100g） 25.00× VB2 （mg/100g）= Cx ×25.00×10-3 100/10） × （100/10）×（1/WS）×100
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
五、实验注意事项
配制标准系列溶液采用5 HAc溶液定容 溶液定容， 1、配制标准系列溶液采用5% HAc溶液定容，配制样 品溶液采用蒸馏水定容。 品溶液采用蒸馏水定容。 mL移液管量取 移液管量取2 mL溶液时必须先吸到满 2、用5mL移液管量取2、3、4mL溶液时必须先吸到满 刻度； 刻度； 用浓度最大的标准溶液找出最佳荧光发射波长， 3 、 用浓度最大的标准溶液找出最佳荧光发射波长 ， 并确定测定时仪器工作条件（ 并确定测定时仪器工作条件（ 选择合适的灵敏度值 与纵坐标放大值）； 与纵坐标放大值） 过滤时先将样品液分批倒入小布袋， 用漏斗接液， 4 、 过滤时先将样品液分批倒入小布袋 ， 用漏斗接液 ， 漏斗下端直接用100mL容量瓶接液 100mL容量瓶接液； 漏斗下端直接用100mL容量瓶接液； 提取液中加10 10% 5 、 提取液中加 10% 双氧水应逐滴加入使高锰酸钾刚 好颜色褪去（边滴边摇） 好颜色褪去（边滴边摇）； 样品液测定条件与标准曲线测定条件一致（ 6 、 样品液测定条件与标准曲线测定条件一致 （ 测定 时所用灵敏度值与纵坐标放大值一致） 时所用灵敏度值与纵坐标放大值一致）；
2.样品溶液制备 2.样品溶液制备 称取50g新鲜蔬菜， 40mL水压汁， 称取50g新鲜蔬菜，加40mL水压汁，将菜 50g新鲜蔬菜 水压汁 汁加入20mL1mol.L HCl和10mL水煮沸1h， 水煮沸1h 汁加入20mL1mol.L-1HCl和10mL水煮沸1h， 冷却，不断搅拌滴加2mol.L NaOH， 冷却，不断搅拌滴加2mol.L-1NaOH，调节 pH为 再用稀HCl调节pH 4.5，过滤， HCl调节pH至 pH为6，再用稀HCl调节pH至4.5，过滤，用 水洗涤样品， 水洗涤样品，洗涤液和过滤液合并定量转移 至100mL容量瓶中，加水稀释至刻度。 100mL容量瓶中，加水稀释至刻度 容量瓶中
3.工作曲线绘制 3.工作曲线绘制 取标准系列溶液之一，试验实验条件， 取标准系列溶液之一，试验实验条件，找 出最佳荧光发射波长。在所确定的波长条件 出最佳荧光发射波长。 下测定标准系列溶液的荧光强度， 下测定标准系列溶液的荧光强度，绘制荧光 强度与浓度的工作曲线。 强度与浓度的工作曲线。 4.测定 4.测定 分别吸取10.00mL样品溶液三份， 10.00mL样品溶液三份 分别吸取10.00mL样品溶液三份，依次置 于三只25.00mL容量瓶中，加入1.25mL冰醋 于三只25.00mL容量瓶中，加入1.25mL冰醋 25.00mL容量瓶中 1.25mL 再加入KMnO 溶液(3%)0.5mL (3%)0.5mL， 酸，再加入KMnO4溶液(3%)0.5mL，放置 2min，边摇边滴H (30%)， 2min，边摇边滴H2O2(30%)，使KMnO4刚 好褪色，用纯水稀释至刻度， 好褪色，用纯水稀释至刻度，在荧光光度计 上分别测定其荧光强