种子的扩大培养 (2)

学习目标
了解基本概念、种子培养的一般过程及培养各阶段 的目的要求；
理解种子培养的各种影响因素； 掌握接种方法、种子质量控制方法、种子培养中的
问题分析及处理手段。
1
第一节 基本概念
◆种子培养 指提供给种子适宜的生长繁殖条件，使种子能够 迅速生长成合格的菌体的过程。
◆种子的扩大培养 休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后， 再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质 量纯种的过程。
22
3.菌丝结团 （现象？） ◆主要原因：①搅拌；②通气；③孢子量小；④
泡沫大等 ◆处理方式：分析原因，对症解决
4.种子罐泡沫大 ◆主要原因：①玉米浆的质量有波动； ②消沫剂的质量有问题； ◆处理方式：间歇搅拌，提高罐压，加大空气翻
腾液面压泡，待菌丝长起来后泡沫即可减小
23
养易于被菌体直接吸收和利用，成分适当，氮源、维 生素含量较高。
②营养成分要尽可能和发酵培养基接近，且略稀 薄为宜。 （2）培养条件
①温度 温度高，细胞中的生化反应快，生长速率 快；菌体蛋白质、核酸等对温度较敏感，温度过高可 能被破坏。微生物生长温度在-10～95℃。发酵菌株 生长最适温度为20～40℃。
19
②pH值 影响微生物对营养物质的吸收、酶的形成及 其活力等。大多数为pH4～9，少数在pH<2或>10。
③通气量 保证菌种代谢对氧的需求，提高种子的质 量。
④搅拌 保证溶氧及种子罐内各处条件均一，利于种 子的培养。可避免菌丝结团、粘壁等现象发生。
20
二、常见问题及其处理手段
1.种子生长缓慢： ◆主要原因：①原材料质量的波动； ②接种孢子量不足；
利用两端压力差，液体从高压流向低压的接种方法。 ①孢子悬液接种 ②种醪接种
（2）注射接种 用于种子罐接种，在罐顶接种管口压 盖一层橡胶膜，将注射器针嘴插入橡胶膜进行接种。
（3）摇瓶直接进罐法 适合种子罐接种，一般需三人 配合操作。
15
二、注意事项
（1）按照无菌操作 （2）毒灭菌一定要彻底、干净 （3）在接种操作中，一定要严格按照无菌操作进行，规范生
生产上多以大接种量和丰富培养基作为高产措施
多数抗生素发酵接种量为7％～15％，有时可加大到20％～ 25％。
☆（3）接种龄的确定 接种龄以处于生命力旺盛的对数 生长期的菌丝最为合适，实验确定。
10
（4）种子质量的判断方法 测定的参数有 ① pH； ②培养基灭菌后的糖、氨基氮、磷的含量； ③菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观(色素、颗 粒等)； ④其他参数。如转种前的抗生素含量、某种酶 活力等。
◆种子及发酵级数 孢子(或菌丝)接入到体积较小的种子罐 中，经培养后形成大量的菌丝——一级种子；把一级种子转入 发酵罐内发酵，称为二级发酵。
如果将一级种子接入体积较大的种子罐内，经过培养形成更 多的菌丝——二级种子；将二级种子转入发酵罐内发酵，称为 三级发酵。
使用三级种子的发酵，称为四级发酵。
2
◆接种 将孢子或菌落，或试管、三角瓶或种子罐中 菌体接入培养容器的操作过程。
16
（6）在种子制备过程中，要特别加强对影响种子质 量的各种因素的调控。
（7）对已有的优良生产品种的菌种，要采取相应的 方法，使其在尽量长的时间内保持生产性能稳定、 死亡率低、变异少。
（8）已经退化的菌种，要及时进行分离纯化，通过 复状，恢复菌种的优良性能。
（9）种子通过接种管道进行移种时，移种过程中要 防止接受罐表压降至零，否则会引起染菌。
◆种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，并减 少由于多次转种而带来的染菌机会。
8
种子罐工艺控制： ①孢子量； ②罐温； ③罐压；④通气量； ⑤搅拌 ⑥pH、离心等参数控制； ⑦种龄；⑧培养基； ⑨灭菌及降温时间
9
☆（2）接种量的确定 ◆与该菌在发酵罐中生长繁殖的速度、种子质量和发酵条件 等有关。 a.接种量过多，菌丝生长过快、过稠，培养液粘度增加， 营养基质缺乏或溶解氧不足，影响产物的合成。 b.接种量过小，引起发酵前期菌体生长缓慢，使发酵周期 延长，菌丝量少，还可能产生菌丝团，导致发酵异常。
②三角瓶液体培养（摇瓶种子）
5
6
2.生产车间种子制备 ☆（1）种子罐级数的确定 指制备种子需逐级扩大培 养的次数。
◆种子罐级数主要决定于菌种的生长特性，孢子发 芽及菌体生长繁殖速度，以及所采用的发酵罐容积。
◆种子制备目的 形成一定数量和质量的菌体。孢 子发芽和菌体开始繁殖时，菌体量很少，在小型罐内 即可进行。
17
第三节 问题分析及处理手段
☆一、种子培养过程中影响因素 1．孢子培养过程中的影响因素 （1）原材料质量 无机离子（如微量元素Mn2+、Cu2+、Ba2+）
能刺激孢子的形成，磷含量也会影响孢子的质量。
（2）培养温度 过低菌种生长发育缓慢；过高菌体代谢活动 加快，缩短培养时间，使孢子成熟早，易老化，引起菌丝过 早自溶。
11
（5）种子质量的控制措施 ①菌种稳定性检查 定期考察和挑选菌种；对菌种
进行自然分离；摇瓶发酵，测定其生产能力，从中 挑选具有较高生产能力的高产菌株。 ②适宜的生长环境 包括营养丰富的培养基、适宜 的培养温度和湿度、合理的通气量等。 ③种子无杂菌检查 每移种一步均需要进行无菌检 查，并对种子液进行生化分析。
12
米孢子质量
①无菌状况必须保证（无菌室操作，无菌样监测，无 菌室的管理， 灭菌锅温度和压力的校验）
②菌落形态的挑选 ③原材料的质量保证（玉米浆/小米等有机氮源质量易
波动，产地/厂家/摇 瓶） ④培养基（配方，灭菌，孢子数量需求） ⑤接种量适当 ⑥培养过程温度和湿度（空调及恒温
恒湿机的保障） ⑦培养时间
◆发酵目的 获得大量的发酵产物。产物是在菌体 大量形成并达到一定生长阶段后形成的，需要在大型 发酵罐内才能进行。同时许多发酵产物的产生菌，其 不同的生长阶段对营养和培养条件的要求有差异。
7
◆生长缓慢的菌种，如果没有经过多级种子扩大培养 就接种到发酵罐，将延长发酵周期，使生产能力下 降。进行多级种子扩大培养后再移种至发酵罐是工 业化生产所必须的。
◇专性好气菌 只有在空气或氧O2存在的条件下才 能生长的菌体，氧为呼吸过程中的最终受氢体。
◇专性厌气菌 只有在没有空气或无氧条件下才能生 长的菌体，分子态氧对它们有毒害作用，如丙酮丁醇 梭状芽孢杆菌。
◇兼性好气菌或兼性厌气菌 既能在空气或有氧条件 下生长，又能在没有空气或缺氧条件下生长的菌体。 包括酵母菌及部分细菌。
◆接种量 移种的种子液体积和培养液体积之比。
◆接种龄 种子罐中培养的菌体开始移种到下一级种 子罐或发酵罐的培养时间。
双种法 2个种子罐的种子接人1个发酵罐的接种方法。 倒种法 以适宜的发酵液倒出部分对另一发酵罐作为 种子的接种方法。 混种法 以种子液和发酵液混合作为发酵罐的种子的 接种方法。
3
◇种醪 接入至种子罐中的种子经培养后所得的含有 一定菌体浓度的种子液。
4
第二节 种子培养过程
包括：孢子制备过程，种子制备过程
一、种子制备工艺 ——实验室阶段和种子罐生产培养阶段
1．实验室种子制备 （1）斜面种子培养 活化菌种，同时也培养一定数量的斜面 种子。 （2）液体培养 包括液体试管和三角瓶摇床震荡或回旋式培 养。
①液体试管培养 无菌条件下，用接种针自斜面试管挑取 一环斜面种子菌体，接入装有液体培养液的试管，摇匀后，置 培养箱培养，待培养成熟后，再接入三角瓶培养。
产操作，严禁误操作带来的杂菌污染，经常提醒，建立严格 的无菌概念，避免出现二次污染。 （4）生产中使用的斜面菌种不宜多次移接，一般只移接三次 (三代)，以免由于菌种的自然变异引起菌种不纯。因此，要 经常进行菌种的分离纯化，不断提供新的斜面菌株供生产使 用。 （5）按不同菌种的不同生理特征，选用不同的工艺来生产发 酵所用的种子。即使是相同的发酵生产，也要根据本单位的 具体条件对工艺操作方法加以调整。
13
种子罐生长的好坏
①无菌状况必须保证（罐体本身、各系统设备及管 线的灭菌）
②培养基（配方，灭菌及降温过程） ③原材料质量的稳定（玉米浆/蔗糖及无机盐的质量
控制） ④接种孢子数量控制 ⑤工艺控制：罐温；罐压；空气；pH；搅拌；离心
量；移种周期控制
14
3．接种方法 （1）压差接种
（3）湿度 湿度小，孢子生长快；湿度大，孢子生长慢。 （4）斜面冷藏时间 孢子成熟，不易导致菌体自溶，冷藏时间
可长；反之，应缩短冷藏时间。 （5）接种量 接种后菌落均匀分布整个斜面，隐约可分菌落者
为正常。过小，菌落稀疏；过大，菌落密集一片。
18
2．种子罐培养过程中的影响因素
（1）原料 ①选择有利于孢子发芽和菌丝生长的培养基，营
③灭菌温度/ 时间过长或降温时间过长
④罐温、通气量、搅拌等不符合要求； ⑤其它异常情况 ◆处理方式：①适当升温控制 ②空气流量加大 ③适当延长种子周期
21
2.种子罐染菌： ◆主要原因 ①罐内有死角；
②灭菌不彻底； ③接种失误； ④孢子本身 带菌； ⑤种子罐空气系统、移种管线、 相关管线及阀门出现问题等 ◆处理方式：放弃种子，实施倒种