胆红素试剂的探讨

胆红素试剂的探讨
发布时间02年11月08日14时11分
四川迈克科技有限责任公司赵瑜周方银
胆红素测定是临床上常用的检测项目，作为肝功能诊断的重要指标，对临床胆红素分析的质量控制值得我们重视。

但直到今天，国内总/直接胆红素测定的标准化依然是临床化学分析的一道难题，尤其是直接胆红素分析。

分析原因除了目前国内尚缺乏合格的商品参考物或校准品外，还有一个重要的因素就是试剂。

不同方法学的试剂其准确度、精密度、测定线性范围、稳定性及抗干扰性等直接决定了临床结果的可靠性。

目前胆红素测定方法根据类型可分为高效液相色谱法（HPLC）、导数分光光度法、直接分光光度计法、经皮胆红素测定法（TCB）、重氮法、氧化法等。

临床常用商品试剂为重氮法及氧化法。

重氮法包括改良J-G法、二甲亚砜法（DMSO法）、二氯苯重氮盐法（DPD法）、2，5-二氯苯重氮四氟硼酸盐法（2，5DCB-4FB法）、改良2，5DCB-4FB法等；氧化法包括氧化酶法、化学氧化法，其中化学氧化法又有钒酸盐氧化法、亚硝酸盐氧化法、过硫酸盐氧化法、综合氧化剂法、复合有机包结氧化法等之分。

HPLC法可从样品中同时分离出胆红素各组分，包括非结合胆红素（Bu）、胆红素单葡萄醛酸酯（mBc）、胆红素双葡萄醛酸酯（dBc）、δ胆红素（Bδ）、以及光照射后产生的光胆红素，并加以准确定量，该法灵敏度高、特异性强，是目前胆红素测定的最可靠方法。

但该法仪器昂贵，技术要求高，在梯度浓度有机溶剂中各组分吸光系数的波动等问题也有待解决。

导数分光光度法可消除血红蛋白、β-胡萝卜素的干扰，但该法不能测定Bc（结合胆红素或直接胆红素），样品和标准需预稀释，不适合临床大批量样品自动化分析。

直接分光光度计法是专用于新生儿血清总胆红素测定，采用双波长比色避免溶血干扰，方法简单，不需要样品空白，但该法不适合自动化大批量分析。

经皮胆红素测定方法（TCB）具有操作简单、非损伤性等优点，特别适用于婴幼儿及新生儿黄疸筛查，但该法影响因素多，不能完全代替血清总胆红素测定。

在各种重氮试剂法中，改良J-G法为推荐方法，其灵敏度、准确度和特异性均较高，但显色时间相对较长；测定直接胆红素时需要严格控制时间（1分钟），用手工或半自动分析仪操作相对误差较大是其不足，在一些自动分析仪上使用也不方便。

目前J-G法国内外均有不少商品试剂盒，但所接触的商品试剂盒稳定性尚存在一些问题，血红蛋白＞3.5g/L时，干扰较明显，对严重脂血抗干扰性也较差。

DMSO法的最大优点为反应时间短，呈色后稳定性极佳（可稳定近2小时）、对脂血抗干扰
性较强，受溶血干扰较轻，但血红蛋白＞3.5g/L时依然有较大的干扰，只能测定总胆红素。

DPD法商品试剂多为干粉/冻干品单一试剂，复溶后保存时间较短，在自动生化分析仪使用不方便。

该法测定总胆红素呈色为红色，易受溶血的干扰，对脂血的抗干扰性较好。

2，5-DCB-4FB法商品试剂为液体双试剂，重复性好，但易受溶血的干扰；经改良的2，
5-DCB-4FB法对溶血的抗干扰增强（Hb≤5g/L），但该法易受尿蓝毋干扰，试剂开瓶稳定性不及氧化法。

氧化酶法是胆红素测定较好的一种方法，由于胆红素氧化酶（BOD）在碱性环境中可氧化所有胆红素成分，包括大部分（＞85%）的Bδ，这一特性可用于总胆红素测定；而在酸性条件下，mBc、dBc和大部分Bδ均被氧化，只有Bu不被氧化，这一特性可用于Bc（结合胆红素或直接胆红素）的测定；故可根据不同胆红素反应的最适pH差别，可分别定量测定总/直胆。

该法特异性强、灵敏度高、重复性好，对溶血、脂血等抗干扰性强，操作简单，适用于自动化测定等。

但该法所涉及的工具酶价格昂贵，故商品试剂价格昂贵。

同时在酶法测定中胆红素氧化酶容易受到血清蛋白，尤其是白蛋白的影响，这主要由于作为底物的胆红素在掺入血清白蛋白的α螺旋链时，底物便不能接近酶分子中的活性中心（这一现象称为立体障碍）。

从这一点考虑，也可推测与血清白蛋白结合的δ胆红素在保持白蛋白α螺旋链的pH范围内对胆红素氧化酶的作用有抵抗性。

自1990年日本学者Kondo向欧洲的专利中提到：低分子量的无机氧化剂、过渡元素等在一定条件下都可氧化胆红素，因而可用来开发测定胆红素的方法后，化学氧化法开始得到长足发展。

在化学氧化法中，反应分子与酶不同，属小分子，因此δ胆红素立体障碍所致的反应降低，与重氮法反应程度相类似，相关性良好，这也是开发化学氧化测定试剂的原因。

在化学氧化法中，总胆红素测定需要选择适合的氧化剂、反应促进剂、非特异反应抑制剂、抗干扰剂；而结合胆红素的测定来在反应体系中还必需具有非结合胆红素反应抑制剂和吸收剂。

近年国外学者在这方面做了不少报道。

1993年日本和光株式会社Kuniaki Tokuda等率先开发出商品钒酸盐胆红素氧化法试剂，并在临床推广应用，它继承了氧化酶法的抗溶血、抗黄疸、抗脂血等许多优点，能够测定总胆红素和直接胆红素；同时该试剂具有良好的稳定性，试剂开瓶稳定性极佳，总胆红素试剂可室温存放。

国内不少学者对该试剂也做了不少系统的评价。

随着钒酸盐氧化法试剂在临床的应用推广，2001年日本东洋纺绩株式会社又推出亚硝酸盐氧化法，其与改良J-G法、改良2，5DCB-4FB法、钒酸盐氧化法相关较好，弥补了钒酸盐氧化法的某些不足，如个别干扰样品会出现直接胆红素比总胆红素高的现象，但溶血样品对直胆测定有较明显干扰。

与此同时，
国内不少学者先后开发出过硫酸盐氧化法、综合氧化剂法等。

综合氧化剂法是国内最近开发的一种方法，反应速度快、线性范围宽。

但目前尚无配套总/直胆校准品，如以重氮法校准品替代则结果偏低，抗溶血能力相比钒酸盐氧化法试剂低、直胆反应特异性尚待提高。

从目前来看，国产试剂在这些方面解决得尚不理想，存在一定问题，尤其是直接胆红素测定更为突出。

复合有机包结氧化法是迈克科技公司正在研发的新一代胆红素测定方法，反应体系选用国外新型材料有机复合包结氧化剂—HBBA、反应促进剂—CCLTⅠ、非特异反应抑制剂—TCHA、非结合胆红素反应抑制吸收剂—NODT和高效抗干扰剂—IPE。

它借鉴了胆红素氧化酶法反应机理和化学氧化法诸多优点，呈色反应类似氧化酶法，特异性强；同时又继承了化学氧化法立体障碍小，反应程度与重氮法相类似，线形范围广的特性；与国外知名品牌商品试剂具有良好相关性。

这里对该法作简单介绍：
测定原理：
在pH3.0附近，样品中胆红素被复合有机包结氧化剂（HBBA）迅速氧化，在450nm附近处吸收峰消失，在非结合胆红素反应抑制吸收剂（NODT）存在下则仅直接胆红素被氧化，反应前后吸光度下降值与样品中总/直接胆红素含量成正比。

试剂性能：
检测线性范围
取1400μmol/L总胆红素及700μmol/L直接胆红素高值血清，在日立7060全自动分析仪上进行梯度浓度测定，曲线如下：
取340μmol/L非结合胆红素高值血清，在日立7060全自动分析仪上与直接胆红素试剂实验，反应曲线如下：
从上可以看出，总胆红素浓度1400.0μmol/L下，直接胆红素浓度700.0μmol/L 下，在4分钟内即可达到反应完全，以浓度为340μmol/L纯品非结合胆红素与直接胆红素试剂实验，经计算被氧化不足3%，显示本方法具有良好的反应完全性、反应特异性和极高的检测范围。

直接胆红素测定在加入第一试剂后，吸光度有一明显的下降趋势，表明试剂具有良好的去非特异性干扰作用。

γ2＝0.9999
总胆红素0.0～1400.0
（μmol/L）
直接胆红素0.0～ 700.0
γ2＝0.9968
（μmol/L）
精密度检查
分别取高低两个水平临床新鲜血清做总胆红素和直接胆红素精密度检查，结果如下表：
共存物质的基质效应
溶血
将已知值的100g/L血红蛋白样品，作0，1/2，1/4，1/8，1/16稀释后，分别按1:9加入高低两个水平临床新鲜血清中进行分析，结果如下：
血红蛋白浓度≤10g/L对总胆红素测定无干扰，对直接胆红素基本无干扰。

脂质
在高低两个水平临床新鲜血清中分别加入0-5%的脂肪乳剂观察脂质对测定的影响，结果如下：
5%以下的脂质对总胆红素测定无影响，对直接胆红素测定基本无影响。

维生素C
将1.0g/L的Vt.C作0，1/2，1/4，1/8，1/16倍比稀释后，分别按1：9加入高低两个水
平临床新鲜血清中进行分析，结果如下：
维生素B2和β-胡萝卜素类物质
将0.5g/L的Vt.B2和β-胡萝卜素类物质混合物作0，1/2，1/4，1/8，1/16倍比稀释后，
分别按1：9加入高低两个水平临床新鲜血清中进行分析，结果如下：
Vt.B2和β-胡萝卜类物质混合物浓度小于500mg/L对胆红素测定几乎无影响。

相关性试验
取50份临床新鲜血清以本法试剂和罗氏J-G法试剂、德国Diasys改良2，5DCB-4FB法液体试剂、日本和光钒酸盐氧化法试剂进行比对试验，结果如下：
试剂密闭避光贮存2～8℃稳定12个月，室温总胆红素试剂稳定6个月，直接胆红素试剂稳定3个月以上。

试剂开瓶后置2～8℃保存可稳定60天
胆红素测定目前尚没有权威的标准，临床上仍推崇重氮法。

但近年来氧化法逐渐被更多的学者所认识，它具有良好的抗干扰性，试剂开瓶稳定性佳，尤其适合全自动生化分析仪使用。

从我们的开发研究中也发现质量好的氧化法与重氮法具有极好相关，合理的调整体系后可产生类似氧化酶法的呈色反应（关于这方面的现象我们将做进一步的研究），试剂生产批间差小，是一种综合性能较好的方法。

随着越来越多的厂商加大这方面的开发力度，氧化法在临床的应用前景将更加广阔。