麦胚谷胱甘肽提取与含量测定方法研究

麦胚谷胱甘肽提取与含量测定方法研究
刘千;陈黎;胡用军;叶凤琴;陈强
【摘要】旨在建立用反相高效液相色谱(RP-HPLC)法同时检测小麦胚中谷胱甘肽(glutathione)还原型(G-SH)和氧化型(G-S-S-G)含量的方法.为了更高效地提取谷胱甘肽,在水作溶剂条件下,考察了不同浸泡时间、超声时间、料液比、超声温度、溶剂pH和沉淀剂比例对谷胱甘肽提取效率的影响.并在2种色谱柱上,考察了5种流动相下谷胱甘肽含量测定结果.最终确定最适提取条件为:提取溶剂pH4.0,料液比1∶30,浸泡1h后在0℃下超声10min,沉淀剂比例为1∶2.0；色谱条件为:Fusion-RP柱(150×4.6mm,4μm,8nm)；流动相:水(0.08％辛烷磺酸钠+0.24％磷酸二氢钠,以磷酸调pH2.5)-乙腈(体积比为82∶8)；检测波长为210nm;流速为
1.0mL·min-1；柱温为25℃.测定了19份不同来源麦胚中谷胱甘肽的含量,发现谷胱甘肽含量差异显著,最高达180.71mg·(100g)-1.%This study is to establish the RP - HPLC method to determine the content of GSH and GSSG simultaneously. Using distilled water as solvent, the effect of the time of soak, time of ultrasonic extraction, material liquid ratio , temperature of ultrasonic extraction, solvent pH, and precipitating agent proportion on the the extracted efficiency of Glutathione were determined. The contents of glutathione were determined by using 2 chromatogram columniations and 5 mobile phases. Finally,the optimal conditions were determined. The solvent pH was 4.0,the material liquid ratio was 1: 30,the time of soak was 1 h,ultr asonic extraction 10 min in 0℃ ,and precipitating agent proportion was 1:
2.0. Chromatogram conditions were Fusion - RP column (4. 60 × 150 mm, 4 μm, 8 nm) at 25 ℃ , the mobile phase were both a mixture of 0. 08%
octanesulfonic acid sodium salt and 0. 24% Sodium dihydrogen phosphate in water and acetonitrile(82: 8, V/V) , adjusted to pH 2. 5 with phosphoric acid. The UV detection wavelength was set at 210 nm. The flow rate was 1.0 mL · min . The glutathione contents from 19 wheat germs were determined. The glutathione contents had significant difference. The maximal content was 180.71 mg · (100 g) -1 .
【期刊名称】《中国粮油学报》
【年(卷),期】2012(027)010
【总页数】6页(P104-108,112)
【关键词】麦胚;谷胱甘肽;提取;含量
【作者】刘千;陈黎;胡用军;叶凤琴;陈强
【作者单位】四川农业大学农学院,温江611130;宜宾市产品质量监督检验所,宜宾644002;宜宾市产品质量监督检验所,宜宾644002;宜宾市产品质量监督检验所,宜宾644002;四川农业大学食品学院,雅安625014
【正文语种】中文
【中图分类】S-3
谷胱甘肽(glutathione)是由谷氨酸(Glu)、半胱氨酸(Cys)和甘氨酸(Gly)经肽键缩合而成的活性三肽，有还原型(G－SH)和氧化型(G－S－S－G)2种形态，在生理条件下以还原型占绝大多数。

国外早在20世纪二三十年代就开始了对其生理功能的研究［1］。

它能保护生物膜、抗衰老、解毒、抗癌、预防动脉硬化及抑制饮酒过度而引起的脂肪肝，也是细胞内主要还原型物质，能保护细胞免受氧化及有毒物质
的损伤［2］。

随着对谷胱甘肽研究的深入，其在食品［3－4］、医学［2］、保
健［5－6］、抗衰老［7］等方面的应用正日益引起人们的广泛关注。

谷胱甘肽作为功能活性因子，是制作功能性食品的理想添加剂［3］。

目前，食品工业中已广泛使用抗氧化剂，但绝大多数属人工合成，随着人们越来越关心食品安全问题，天然谷胱甘肽的强抗氧化活性和高安全性，在保健食品等领域将有极好的应用前景［8］。

而谷胱甘肽在自然界含量丰富，尤其在小麦胚中含量最多，高达0．47%［9］。

当前，对麦胚营养价值、功能特性和麦胚稳定化技术
以及麦胚应用的研究较多，但关于麦胚中谷胱甘肽含量测定方法研究较少，仅见曹新志等［10］采用荧光法进行。

麦胚中谷胱甘肽的提取方法有刘国琴等［11］用
浸提法，周惠明等［12］用离子交换分离法，卢敏等［13］用高压电脉冲法，尚
未见用超声提取法。

目前，常见的测定其他植物或食品中谷胱甘肽含量包括紫外分光光度法、酶法、荧光光度法、电化学法和高效液相色谱法等［5－6，14－16］。

其中，高效液相色
谱法因具有灵敏性高，专一性强，线性范围宽，稳定性较高等特点应用范围越来越广。

本研究比较了不同浸泡时间、超声时间、料液比、超声温度、溶剂pH和沉淀剂比例对谷胱甘肽提取效率的影响，力求更高效地从小麦胚中提取谷胱甘肽，并建立同时测定小麦胚中GSH和GSSG含量的HPLC法，为麦胚功能性食品方面的开发和麦胚中谷胱甘肽的提取、测定提供一定科学依据。

1．1 供试材料
19份不同来源小麦生/熟胚为供试样品，样品编号及来源见表1。

样品粉碎过40
目筛后烘干保存备用。

选取1号材料进行提取条件和色谱条件试验。

1．2 仪器与试剂
KQ－100B超声波清洗机:昆山超声波仪器公司;UV－265型紫外－可见分光光度仪、
高效液相色谱仪［SPD－10A VP紫外－可见检测器、LC－6A高压泵、CTO－10AS VP柱温箱(含7725i型手动进样器)，浙大智达N2000工作站］:Shimadzu 公司;CP225D型电子天平:Sartorius公司;Milli－Q型纯水仪:Millipore公司。

GSH和GSSG对照品:Sigma公司;辛烷磺酸钠:上海蓝季科技发展有限公司;色谱纯乙腈、分析纯磷酸二氢钠、氯仿等其余试剂:成都市科龙化工试剂厂。

1．3 供试品溶液的制备
按表2中的试验设计顺序逐一进行单因素试验。

考察浸泡时间时，其他因素取中间变量值;最佳浸泡时间确定后，采用确定的条件考察超声时间，未考察因素则取中间变量值;以此类推，各设3次重复。

精密称取1 g麦胚粉于100 mL具塞三角瓶中，加入蒸馏水并小幅度振荡均匀，称定三角瓶和溶液的总质量，在暗室中放置一定时间后取出。

将样液放在特定温度的水中用超声波提取样品一定时间之后，擦净外壁再次称量并按先前称定的总质量补加提取溶剂。

吸取溶液0．5 mL至1．5 mL离心管中，按比例加入沉淀剂氯仿，于10 000 r/min下离心15 min。

吸取上清液10μL进行HPLC测定。

1．4 对照品溶液的制备
精密称取GSH、GSSG对照品，配制浓度分别为7．72μg/mL与8．64μg/mL、15．44μg/mL与17．28 μg/mL和30．88μg/mL与34．56μg/mL的GSH∶GSSG对照品混合溶液。

1．5 色谱条件和系统适用性实验
分别在色谱柱:Synergi 4μHydro－RP 8 nm，150×4．6 mm和Synergi
4μFusion－RP 8 nm，150×4．6 mm上考查了5种流动相对GSH和GSSG分离的影响。

其中流动相Ⅰ(水－乙腈)考察比例为:99∶1，98∶2，97∶3;流动相
Ⅱ(辛烷磺酸钠+磷酸二氢钠混合溶液－乙腈)考察比例为:92∶8，93∶7，94∶8，95∶5，90∶10，Ⅰ和Ⅱ均用磷酸调节pH为2．5、3．0和3．5。

综合考虑分
离度、理论塔板数和分析时间，选择色谱柱:Synergi 4μFusion－RP 8 nm，
150×4．6 mm;流速为1．0 mL·min－1;柱温25℃;进样量为10μL;流动相:水(0．08%辛烷磺酸钠+0．24%磷酸二氢钠，以磷酸调pH 2．5)－乙腈(体积比为82∶8);检测波长为210 nm的色谱条件。

此色谱条件下，理论塔板数以GSH和GSSG的峰计算均不低于4 000，如图1所示。

2．1 谷胱甘肽提取条件选择
谷胱甘肽的超声波提取条件单因素试验结果见图2。

各数据均为3次重复的平均值，经显著性检验发现浸泡时间、超声时间、物料比
和提取温度各变量间差异达到极显著，溶剂pH差异不显著，沉淀剂比例差异显著。

单因素试验的最佳条件为:浸泡时间1 h、超声时间10 min、物料比1∶30、提取
温度0℃、沉淀剂比例1∶2．0;考虑到用提取溶剂溶解样品时，溶剂pH对谷胱甘肽含量影响不大，由于小麦胚芽蛋白的等电点为pH 4．0，利于后面蛋白质的除杂，所以采用4．0作为最佳pH值。

刘国琴等［11］曾报道85℃浸提GSH得率最高。

但本研究之前按其方法在60～90℃每间隔10℃提取，并用碘量法测定，发现此条件下，GSH峰与杂质峰重合使测定的GSH峰面积偏高很多。

经重新建立色谱条件将两峰分离后发现，增加温度仅使杂质峰增大，而GSH峰面积基本不变。

故在此温度段，增加超声温度对提高GSH的提取无显著效果，考虑到浸提与超声提取的差异，后续试验中只考察了0、25和50℃。

物料比的选择上，刘国琴等［11］和卢敏等［13］分别采用了1∶9
和1∶20的物料比，陈丽娜等［14］提取玉米胚中谷胱甘肽用的物料比是1∶10，而本试验中的最佳物料比为1∶30。

这可能是由于刘国琴等［14］采用的是搅拌
浸提，卢敏等［13］采用高压电脉冲，而陈丽娜等［14］则是对玉米胚进行先超
声(时间5 s/次，超声次数30次，间隔时间5 s)后振荡的提取，提取方法和原料不同导致差异。

针对浸泡时间因素，还进行了4、8、12 h的试验，超声时间进行了
40 min和50 min的试验，发现谷胱甘肽含量都较低，因此后续试验未进一步考察。

2．2 色谱条件方法学考察
2．2．1 线性关系
取GSH、GSSG浓度分别为7．72、8．64μg/mL的对照品混合溶液，进样1、5、10、15、20μL，浓度分别为15．44、17．28μg/mL的对照品混合溶液，进样12．5、15、17．5、20μL，再取浓度分别为30．88、34．56μg/mL的对照品
混合溶液，进样12．5、15、17．5、20μL，按“1．5”所述色谱条件测定。

分
别以GSH和GSSG峰面积为纵坐标，GSH和GSSG进样量(μg)为横坐标，分别
绘制标准曲线，计算得到回归方程如下:
GSH的回归方程为:Y=620 490X+742
R=0．999 8
GSSG的回归方程为:Y=777 678X+110 8
R=0．999 5
以上结果表明GSH和GSSG在0．007 7～0．617 6 μg和0．008 6～0．691
2μg范围内具有良好的线性关系。

2．2．2 精密度
精密吸取GSH和GSSG的对照品混合溶液5μL，重复进样6次。

得到GSH峰面
积分别为:261 385、265 444、261 942、266 128、261 042和265 159，RSD 为0．87%;GSSG峰面积分别为:332 281、333 540、332 286、327 274、326 7337和333 765，RSD为0．95%。

表明进样精密度良好。

2．2．3 稳定性
据有关文献表明［4］，GSH水溶液在空气中易被氧化，可加入具有强还原性的物质如维生素C等保护其不被氧化。

因此本次试验通过对对照品加VC和不加VC考
察了其稳定性。

分别吸取不加VC的GSH和GSSG的对照品混合溶液5μL，连续
6 d内每天进样1次测定，结果混合标样中GSH和GSSG峰面积RSD分别为2．25%和2．58%;再分别吸取加VC的GSH和GSSG的对照品混合溶液5μL，
连续6天内每天进样1次测定，结果混合标样中GSH和GSSG峰面积RSD分别
为3．03%和0．26%。

可以看出，加VC和不加VC对对照品溶液的稳定性在6
d内没影响，且具有良好的稳定性。

因此，选用不加VC的对照品溶液。

2．2．4 重复性
称取供试品6份，按“1．3”制备，测得GSH含量分别为35．01、34．35、34．40、33．49、32．62和32．45 mg/100 g，平均含量为
(33．72±1．03)mg/100 g，RSD为3．08%;该供试样品中未检出GSSG。

2．2．5 加样回收率
精密称取1 g样品，加入GSH和GSSG标样并按“1．3”制备后测定。

GSH与GSSG各自的加入量、回收率和相对标准偏差列于表3。

由表3可知，GSH在3
个不同加入量下的回收率分别为94．80%、102．00%和96．09%，平均回收率为97．63%，RSD为3．93%;GSSG在3个不同加入量下的回收率平均值则分别为94．25%、102．10%和94．56%，平均回收率为96．97%，RSD为4．59%。

结果表明GSH和GSSG的回收良好。

2．3 19份麦胚样品的测定
不同来源的19份小麦胚样品中谷胱甘肽含量测定结果见表4。

测定条件:提取溶剂pH 4．0，料液比1∶30，浸泡时间1 h，在0℃下超声10 min，沉淀剂比例为1∶2．0;色谱条件为:Fusion－RP柱(150×4．6 mm，4μm，8 nm);流动相:水(0．08%辛烷磺酸钠+0．24%磷酸二氢钠，以磷酸调pH 2．5)
－乙腈(体积比为82∶8);检测波长为210 nm;流速为1．0 mL·min－1;柱温为25℃。

可以看出谷胱甘肽含量范围在6．58～180．71 mg·(100 g)－1;其中GSH
和GSSG含量范围分别在ND(未检出)～105．46 mg·(100 g)－1和ND(未检出)～97．21 mg·(100 g)－1。

据报道，小麦胚芽中谷胱甘肽含量为98～107 mg·(100 g)－1［15－16］。

本研究的含量范围变幅较大，可能与材料来源有关，与生熟加工方式无必然联系。

通过以上试验可以看出，在最适提取条件下，用Fusion－RP柱(150×4．6 mm，4μm，8 nm)，流动相:水(0．08%辛烷磺酸钠+0．24%磷酸二氢钠，以磷酸调
pH 2．5)－乙腈(体积比为82∶8)，检测波长为210 nm，流速为1．0 mL·min－1，柱温为25℃，同时测定小麦胚中GSH和GSSG，分别在0．007 7～0．617
6μg和0．008 6～0．691 2μg范围内具有良好的线性关系;进样精密度良好，重复性和稳定性高，回收良好;检测的19份不同来源麦胚样品谷胱甘肽含量差异较大。

因此，此法可为麦胚中谷胱甘肽的开发利用提供一定参考依据。

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