昆虫表达系统介绍

杆状病毒是已知昆虫病毒中最大的类群发现最早、研究最多且实用意义也是最大的昆虫病毒。

杆状病毒表达载体系统Baculovirus expression vector systemBEVS自1983年问世以来Smith Summer1983Maeda et al 1984由于其具有高效的表达能力、安全易操作等特点已成为研究和生产各种原核、真核蛋白的用力而普及的工具已成功表达了大量的外源基因几乎覆盖了所有物种可开发利用的大部分基因。

1 分类杆状病毒——有囊膜的双股DNA大型病毒仅限于无脊椎动物有尾噬菌体目Caudovirales 杆状病毒科Baculoviridae 核型多角体病毒属NucleopolyhedrovirusNPV ———苜蓿
蠖核型多角体病毒Autographa Californica NPV ———家蚕核型多角体病毒Bombyx mori MPV 颗粒体病毒属GranulovirusGV ———苹果蠹蛾颗粒体病毒Cydia pomonella GV 多角体与颗粒体的区别NPV和GV均有包涵体形式NPV的称多角体后者称为颗粒体多角体内含有许多病毒子都在宿主细胞核内存在颗粒体内含一个病毒子偶尔是两个绝大部分在核内形成但某些GV在胞浆中形成颗粒体2 发育循环杆状病毒包含两个独特的时相又称双相生活循环biphase life cycle 第一相出现在
PI0-24hr 核衣壳于胞核内病毒发生基质上进行装配通过细胞质出芽获得囊膜这种
病毒称为细胞释放型病毒子Cell-released virusCRV又称胞外型病毒Extracellular virusECV或出芽型病毒Budded virusBV 第二相出现在PI20-72hr 当20hr后核内出现病毒包涵体时第二相显著出现一直持续到感染细胞溶解为止72hr 随着第二相开始CRV急剧减少从第二相开始留在核内的核衣壳被封入核内新装配的囊膜中以后许
多核内获得囊膜的病毒子被包埋入多角体蛋白的结晶基质中逐渐形成多角体。

这种病毒子称为多角体衍生病毒子polyhedron-derived virus PDV或包埋型病毒子oocluded virusOV。

当宿主昆虫死亡或细胞裂解时多角体被释放进周围环境土壤或植物表面很稳定环境中可长期存在并保护PDV活性。

然而当昆虫食入在中肠高pH10消化液下很快溶解。

被释放的PDV借囊膜与中肠上皮细胞微绒毛膜融合作用脱去囊膜核衣壳进入昆虫细胞开始原发感染形成CRV再感染多种组织细胞产生继发感染。

这两种病毒子的囊膜来源明显不同CRV含gp64而PDV则无。

AcPNV感染培养的细胞后可产生典型的细胞病变初期无外观变化与病毒DNA复制时宿主细胞膨胀变圆、核增大核仁消失。

在核中央出现丝状结构即病毒发生基质Virogenic stromaVS。

病毒DNA就在此结构中复制。

宿主染色质转移分散到核周边留下一个独特空旷的环状区域又称环状带ring zone围绕病毒发生基质核衣壳就在这里装配Volkman
Keddie1990。

CRV粒子首先形成通过细胞的质膜出芽而成熟当感染进一步发展在核内出现许多新形成的膜核衣壳与这些膜相连紧密地包裹在这些囊膜内最后多角体蛋白沿着核内获得囊膜的PDV逐渐沉积、浓缩、结晶形成多角体。

3 基因组组成单分子超螺旋闭环双链DNAAyres等1994首次测定了AcNPV C6株全序列DNA由133894bp组成。

与杆状病毒多角体有关的结构蛋白主要是多角体蛋白核p10蛋白1多角体蛋白不是必需基因polhORF84520-5255nt编码245aa的多肽28kD。

Polh基因的启动子是典型的晚晚期基因启动子5’端沸编码区存在——CTAATAAGTATTT除去这段AATAAG将导致启动子失活2p10蛋白又称丝状体蛋白与形态发生及多角体膜的形成有关比polh基因早几个小时被激活是晚晚期高效表达基因。

4 重组杆状病毒构建1转移载体pUC NPV基因组Polylinker MCS 2启动子polh启动子polh约占感染细胞总蛋白的25 多角体蛋白基因缺失突变株培养细胞后产生无包涵体occ-的
空斑其形态与野生型病毒的有多角体occ空斑有明显不同因而易于重组病毒的筛选。

p10启动子能产生多角体适用于大田治虫。

由于p10蛋白与细胞溶解、多角体装配、多角体膜形成及多角体的稳定有关系所以外源基因插入p10编码序列后的重组病毒所产生的多角体在形态上不正常显示一定程度的不稳定性。

由于p10基因表达的
10kD蛋白无可识别的表型不便于筛选因此在构建时最后插入一个标记基因如lacZ基因。

110启动子在不同位置均可表达适合于作为双启动子载体的标记基因启动子。

5 Bac-To-Bac杆状病毒表达系统Luckow等1990通过细菌转座将供体质粒上的表达盒通过转座作用定点转移杆状病毒穿梭载体上而构建的重组病毒由Bacteria到Baculovirus之意。

系统由pFAST-1/HT/Dual等、穿梭质粒Bacmid辅助质粒pMON7124和大肠杆菌DH10BAC等组成。

转移载体内含有杆状病毒特异的多角体基因启动子pFAST-BAC-Dual质粒含有PPH外还有p10启动子及两个MCS可以表达两个外源基
因启动子3’和5’端为转座子Tn7的左右侧翼序列Tn7L、Tn7R。

在mini-Tn7中含有Ampr 和庆大霉素Gmr基因。

BacmidbMON14272是一个人工构建的大质粒是在野生型AcNPV多角体蛋白基因位点插入含有低拷贝的mini-FKanr和来自pUC的LacZ a多肽的一段DNA在lacZ a基因的N端插入了一个含细菌转座子Tn7mini-att Tn7接触位点的短片段插入后不会破坏lacZ a多肽的阅读框。

辅助质粒pMON7124含有一个四环素抗性Tetr基因在大肠杆菌中可形成转座酶将供体质粒mini-Tn7元件转座到bacmid的mini-att Tn7接合位点上。

当mini-Tn7插入到Bacmid的mini-att Tn7结合位点破坏了lacZ a多肽的表达。

因此含重组Bacmid或复合Bacmid的菌落在含X-gal和IPTG的LB 中呈白色lac-且具有Ampr、Tetr、Kanr三种抗性。

杆状病毒的缺点Bacmid DNA的拷贝数低故lacZ互补能力不如高拷贝数质粒强菌落显色较慢共有12.5kb外源基因
插入到多角体基因位点MCS时可能破坏多角体启动子的工作环境以致表达量较传
统的同源重组效率低。

杆状病毒的优点1杆状病毒的衣壳和基因组大可容纳10kb 左右外源DNA不影响复制2应用晚晚期蛋白启动子即使外源基因产物对细胞有毒
性也不影响表达水平因为在外源基因表达之前大部分病毒与宿主基因已被关闭病毒已完成复制过程并释放出大量成熟的子代病毒。

3多个外源片段的表达4还能感染昆虫活体高效表达5对脊椎动物无致病性也不能在脊椎动物细胞内复制表达更不能整合因此重组杆状病毒可以被认为是遗传学上最安全的表达载体6多角体蛋白与
p10基因是非必需片段启动子均很强既为外源性片段提供插入位点又可高水平表达外源基因可称为超高效表达系统7外源基因插入多角体蛋白的基因的座位引起后者的缺失或失活因此重组病毒不含包涵体不在环境中长期存在所以更为安全8昆虫细胞作为真核细胞能完全外源蛋白的一系列转译后加工修饰其中包含糖苷化、脂肪酸酰基化豆蔻酰化、软脂酰化及戊二烯酰化作用、羟基末端a-酰氨化作用及糖基化、磷酸化作用。

9产量高2109细胞表达人IFN 1-5mg最高的达600mgb-Gal 10一般核内定位的蛋白或非结构蛋白表达效率最高分泌蛋白居中膜蛋白表达水平低。

细胞培养专题——另列帖子讨论最多广泛的是IPLB-sf21-AEsf21来源于枯草贪夜蛾/秋粘虫Spodoptera frugiperda的卵巢组织另一个是sf9即sf21克隆衍生物Summer
Smith1987。

杆状病毒的应用例子太多太多现举几个应用于动物病毒病的NDVHN——Niikura 1991Nagy 1991Heckert 1999 F——Mori 1994 HNF——Murakami 1994Kamiya 1994 NP——Makkay 1999Errington 1995
IBDVVP2——Snyder 1994 VP2/3/4——Vakharia 1994Dybing 1998 VPx、
VP3/4——Kibenge 1999 VP3——Pitcovski 1999 MDVA抗原——Niikura 1991
ICP4——Xing 1999 P40蛋白——Urakawa 1994 VP22-VP16——Dorange 2000
pp38——崔治中1992 gB——Niikura 1992 US3——Sakaguchi 1993 gI、gE——Jang 1996、1997 ALVgp85——Venugopal 1997 env——秦爱建1999
CIAVVP1/VP2/VP3——Koch 1993 Iwata 1998 AIVNP——Shafor 1998Zhou 1998 HA——Grawforf 1999 IBVS1——Song 1998 球虫病非特异性增强免疫和杀伤作用——用鸡IFN-yLillchoj 1998CHIFN-y对Eimeria球虫有抑制作用重组杆状病毒毒价的测定先将病毒测定1:100稀释然后用细胞培养基含添加物不含血清稀释至10-8各取1ml分别接种于已吸去培养基的sf9上27C 1hr后小心移去细胞上清加入2ml 40C左右的营养琼脂1ml 2营养琼脂水液中加1ml含添加物血清和SP的2Grace’s培养基均匀铺于层表面凝固后置27C继续培养重组杆状病毒会产生灰白色病斑。

每天观察细胞并记数直到病斑数不再增加为止。