HPLC法测定野蚕豆根中桃叶珊瑚苷含量的研究

基金项目：国家自然科学基金（８１８６０８１２）；云南省应用基础研究－中医联合专项（２０１７ＦＦ１１６（－０２１））。

作者简介：吴银双（１９９０－），女，汉族，硕士，助理研究员，研究方向为药物分析和质量研究。

Ｅ－ｍａｉｌ：１０２９２２５９５１＠ｑｑ ｃｏｍ
通信作者：姚政（１９７７－），女，汉族，硕士，副教授，硕士生导师，研究方向为中西医结合防治肝病。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｙａｏｚｈｍａｉｌ＠１２６ ｃｏｍ
ＨＰＬＣ法测定野蚕豆根中桃叶珊瑚苷含量的研究
吴银双１　李　莉２　单　蕊３　陈　燕２　杜　冰２　李海宁２　姚　政２
１ 云南省药物研究所，云南　昆明　６５０１１１；２ 云南中医药大学，云南　昆明　６５０５００；
３ 重庆市开州区中医院，重庆　４０５４００
【摘　要】　目的：建立ＨＰＬＣ法测定栽培野蚕豆根中桃叶珊瑚苷含量。

方法：采用外标法，ＸＢｒｉｄｇｅＳｈｉｅｌｄＣ１８色谱柱（２５０ｍｍ×４ ６ｍｍ，５μｍ），甲醇－水（２∶９８）为流动相，梯度洗脱；流速１ ０ｍＬ／ｍｉｎ，柱温３０℃，检测波长２０３ｎｍ。

结果：桃叶珊瑚苷的质量浓度在：１２ ８～７４ ４μｇ／ｍＬ内与峰面积呈良好的线性关系，Ｒ＝０ ９９９０。

平均加样回收率为１００ ９８％，ＲＳＤ值为０ ６９５％（ｎ＝９）。

结论：栽培野蚕豆根中桃叶珊瑚苷２年生根、１年生根、２年生茎叶、１年生茎叶的平均含量分别为：２
４８１５％、０ ９７５９％、０ ３７５８％、０ ０２６６％；实验采用的ＨＰＬＣ法操作简便、快速、准确，样品处理简便易行，适于野蚕豆根中桃叶珊瑚苷的质量控制。

【关键词】　野蚕豆根；桃叶珊瑚苷；ＨＰＬＣ法
【中图分类号】Ｒ２８４ ２ 【文献标志码】Ａ 【文章编号】１００７－８５１７（２０２０）２４－００２１－０４
ＨＰＬＣＭｅｔｈｏｄｔｏＤｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅＣｏｎｔｅｎｔｏｆＡｕｃｕｂｉｎｉｎＴｈｅＲｏｏｔｓｏｆＣｅｎｔｒａｎｔｈｅｒａｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａＢｅｎｔｈ
ＷＵＹｉｎｓｈｕａｎｇ１　ＬＩＬｉ２　ＳＨＡＮＲｕｉ２　ＣＨＥＮＹａｎ２　ＤＵＢｉｎｇ２　ＬＩＨａｉｎｉｎｇ２　ＹＡＯＺｈｅｎｇ
２ １ ＹｕｎｎａｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭａｔｅｒｉａＭｅｄｉｃａ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５０１１１，Ｃｈｉｎａ；２ ＹｕｎｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｋｕｎｍｉｎｇ６５０５００，Ｃｈｉｎａ；
３ ｃｈｏｎｇｑｉｎｇＫａｉｚｈｏｕＴＣＭＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０５４００，Ｃｈｉｎａ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａＨＰＬＣｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｕｃｕｂｉｎｃｏｎｔｅｎｔｉｎｔｈｅｃｕｌｔｉｖａｔｅｄＣｅｎｔｒａｎｔｈｅｒａｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａｂｅｎｔｈ．ＭｅｔｈｏｄｓＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｅｓｔｓｗｅｒｅｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｂｙｅｘｔｅｒｎａｌｓｔａｎｄａｒｄｍｅｔｈｏｄ，ｉｎｗｗｈｉｃｈＸＢｒｉｄｇｅＳｈｉｅｌｄＣ１８ｃｏｌｕｍｎ（２５０ｎｍｘ４ ６ｎｍ，５μｍ）ｗｉｔｈｍｅｔｈａｎｏｌ－ｗａｔｅｒ（２∶９８）ａｓｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅｗａｓｕｓｅｄｆｏｒｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｕｔｉｏｎ．Ｔｈｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｃｏｎｄｉ ｔｉｏｎｓｗｅｒｅａｓｆｏｌｌｏｗｓ：ｆｌｏｗｒａｔｅ１ ０ｍＬ／ｍｉｎ，ｃｏｌｕｍｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ３０℃，ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ２０３ｎｍ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｍａｓｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｃａｌｃｕｌａｔｅｄｂｙｐｅａｋａｒｅａｓｈｏｗｅｄａｇｏｏｄｌｉｎｅａｒｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ（Ｒ＝０ ９９９０）ｗａｓｗｉｔｈｉｎ１２ ８～７４ ４μｇ／ｍＬ．Ｔｈｅａｖｅｒａｇｅｒｅｃｏｖｅｒｙｗａｓ１００ ９８％，ａｎｄｔｈｅＲＳＤｖａｌｕｅｗａｓ０ ６９５％（ｎ＝９）．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎＡｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｏｕｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｓｔｕｄｙ，ｔｈｅａｖｅｒａｇｅａｕｂｕｃｉｎｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆ２－ｙｅａｒｒｏｏｔｉｎｇ，１－ｙｅａｒｒｏｏｔｉｎｇ，２－ｙｅａｒｓｔｅｍｓａｎｄｌｅａｖｅｓａｎｄ１－ｙｅａｒｓｔｅｍｓａｎｄｌｅａｖｅｓｗｅｒｅ２ ４８１５％，０ ９７５９％，０ ３７５８％ａｎｄ０ ０２６６％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＲｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅｓｔｕｄｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＨＰＬＣｍｅｔｈｏｄｉｓｎｏｔｏｎｌｙｓｉｍｐｌｅ，ｒａｐｉｄａｎｄａｃｃｕｒａｔｅｂｕｔａｌｓｏｈａｓｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｓｉｍｐｌｅａｎｄｅａｓｙｓａｍｐｌｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｗｈｉｃｈｍｅａｎｓｉｔｉｓｓｕｉｔａｂｌｅｆｏｒｔｈｅｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｏｆａｕｂｕｃｉｎｉｎｔｈｅＣｅｎｔｒａｎｔｈｅｒａｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａｂｅｎｔｈ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＣｅｎｔｒａｎｔｈｅｒａｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａＢｅｎｔｈ；Ａｕｂｕｃｉｎ；ＨＰＬＣ
野蚕豆根，又名化血丹、小红药、金猫头（广西）、灵芝草（云南），原植物来源于玄参科（Ｓｃｒｏｐｈｕｌａｒｉａｃｅａｅ）胡麻草属（Ｃｅｎｔｒａｎｔｈｅｒａ）植物大花胡麻草ＣｅｎｔｒａｎｔｈｅｒａｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａＢｅｎｔｈ，主要分布于云南、贵州、广西等地，越南、缅甸、印度也
有分布［１］。

以根入药，主要载于《中华本草》《全
国中草药汇编》《天然药８４０４种诠释》《云南中草药》《中国民族药志要》《红河天然药物》等书，
具有消肿止痛、散瘀止血的功效，外用治外伤出
血［２］。

在云南省红河州等地，野蚕豆根主要被用
于防治多种心脑血管疾病，且疗效显著，系当地苗族地区名贵地方药。

迄今为止，有关野蚕豆根的主要化学成分研究报道，主要含有环烯醚萜苷类、苯乙醇苷类、类胡萝卜素类、紫罗兰酮苷类、
单萜苷类等丰富的生物活性物质［３－５］。

其中环烯醚
萜苷类化合物是其主要化学成分，环烯醚萜苷具
有抗炎、抗肿瘤、保肝、降糖、神经系统保护作用等广泛的药理活性［６－７］，最新的研究还发现环烯醚萜苷类具有ＤＮＡ合成酶抑制剂的作用，可开发成抑制ＤＮＡ合成的抗肿瘤新药［５］。

桃叶珊瑚苷是野蚕豆根中含量最高的环烯醚萜苷类成分［３］。

桃叶珊瑚苷在抗氧化、抗炎、抗菌、抗糖尿病、保肝、抗肿瘤、神经保护及促进伤口愈合作用等功效显著［８］，能明显抑制乙型肝炎病毒ＤＮＡ的复制和促进干细胞再生［９］。

药理研究显示，野蚕豆根用药安全，无明显毒性反应，有抗凝血及抗炎活性［１０－１１］，对心血管疾病和大鼠急性缺血模型所到处心肌损伤有保护作用［１２－１３］，泡制的酒可以防治脑血栓、脑梗［１４］。

该民族药疗效确切，有较好的应用前景。

目前，随着野蚕豆根临床需求量的增加，其野生资源已属濒危，当地已开展人工种植。

有关ＨＰＬＣ法测定野蚕豆根中桃叶珊瑚苷的含量，张传利等［１５－１６］对其野生（根、茎、叶、花）、栽培的野蚕豆根不同部位（根、茎、叶、花、混合样）的桃叶珊瑚苷、梓醇进行含量了测定，野生的野蚕豆根桃叶珊瑚苷的含量高低为：根＞茎＞花＞叶，根的含量远高于其他部位；栽培的野蚕豆根桃叶珊瑚苷的含量高低为：根＞叶＞混合样＞茎＞花，根中的最高含量为０ ９３０ｍｇ／ｇ；两种野蚕豆根中梓醇在叶中含量都是最高的。

色谱柱：ＡｇｉｌｅｎｔＴＣ－Ｃ１８柱（２５０ｍｍ×４ ６ｍｍ，５μｍ）；流动相：乙晴－水（３∶９７），检测波长２０５ｎｍ。

本研究对栽培野蚕豆根１年生根、茎叶；２年生根、茎叶中的桃叶珊瑚苷分别进行含量的测定，色谱柱：ＸＢｒｉｄｇｅＳｈｉｅｌｄＣ１８色谱柱（２５０ｍｍ×４ ６ｍｍ，５μｍ）；流动相：甲醇－水（２∶９８），检测波长２０３ｎｍ。

建立ＨＰＬＣ法测定野蚕豆根中桃叶珊瑚苷含量的方法，为栽培野蚕豆根药材质量评价及采收的合理性提供科学依据。

１　仪器与材料
１ １　仪器　Ｗａｔｅｒｓｅ６９５型高效液相色谱仪、万分之一电子天平（恒平，ＦＡ２００４型）、十万分之一电子天平（岛津，ＳＨＩＭＡＤＺＵ）、超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司，ＳＫ３３００ＬＨ）、万能高速粉碎机（温岭市林大机械有限公司，ＤＦＹ－Ｃ）、旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂，ＲＥ－２０００Ａ）、电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司，ＤＺＫＷ－Ｄ－４）、循环水真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司，ＳＨＺ－ⅢＡ）。

１ ２　试剂　桃叶珊瑚苷对照品购自中国食品药品检定研究院（批号：１１１７６１－２００６０１）。

所用试剂均为分析纯，使用娃哈哈纯净水，甲醇为色谱醇。

野蚕豆根采自云南省红河州屏边县国云种植有限公司栽培基地，经云南中医药大学李海宁老师鉴定为玄参科胡麻草属植物大花胡麻草ＣｅｎｔｒａｎｔｈｅｒａｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａＢｅｎｔｈ
的根及根茎。

２　方法与结果
２ １　对照品溶液的制备　精密称取桃叶珊瑚苷对
照品６ ２０ｍｇ，置５０／ｍＬ棕色容量瓶中，用甲醇溶
解定容，制成０ １２４ｍｇ／ｍＬ对照品溶液，避光冰
箱保存，备用。

２ ２　供试品溶液的制备［１７］　分别精密称取１年生
根、茎叶、２年生根、２年生茎叶（１ ０ｇ），置于具
塞锥形瓶中，加氯仿２０ｍＬ，超声处理２０ｍｉｎ，滤
过。

药渣自然晾干后，加６０％乙醇３０ｍＬ，称定质
量，超声处理３０ｍｉｎ，再称定质量，用６０％乙醇补
足损失的质量，用０ ２２μｍ微孔滤膜过滤，即得。

２ ３　色谱条件及适用性实验［１８－１９］　色谱柱：
ＸＢｒｉｄｇｅＳｈｉｅｌｄＣ１８色谱柱（２５０ｍｍ×４ ６ｍｍ，５
μ
ｍ）；流动相：甲醇（Ａ）－水（Ｂ）；梯度洗脱程序：０～２５ｍｉｎ２％～９８％Ｂ；２５～３０ｍｉｎ８０％～２０％Ｂ；３０～３５ｍｉｎ２％～９８％Ｂ；流速１ ０ｍＬ／ｍｉｎ，检
测波长２０３ｎｍ，柱温３０℃，进样量：２０μＬ。

在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液２μ
Ｌ
，注入液相色谱仪。

２ ４　线性关系考察　精密量取“２ １”对照品溶液１、２、３、４、５、６ｍＬ分别置于１０ｍＬ容量瓶中，依次稀释定容，分别进样２０μＬ，以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得线性回归方程为：Ｙ＝６３２６５２２ ０８５Ｘ－１７４７ ４１１（Ｒ＝０ ９９９０），线性范围为：１
２ ８～７４ ４μｇ／ｍＬ。

２ ５　精密度实验　取“２ １”对照品溶液适量，按“２ ３”色谱条件重复进样６次，每次２０μＬ，
记录色谱图，按峰面积计算相对偏差。

桃叶珊瑚苷对照品的相对标准偏差（ＲＳＤ）为１ ４４％，表明仪器精密度良好。

２ ６　稳定性实验　取“２ ２”供试品溶液，按“２ ３”色谱条件，精密吸取同一供试品溶液２０μ
Ｌ，分别于０、２、４、６、８、１０、１２、２４ｈ进样，其相对标准偏差（ＲＳＤ）为１ ９２％，表明供试品溶液在２４ｈ内表现出良好的稳定性。

２ ７　重复性实验　精密称取６份药材，按“２ ２”制备供试液，按“２ ３”色谱条件分别进样测定，每次２
０μＬ，记录色谱图，按峰面积计算相对偏差。

其相对标准偏差（ＲＳＤ）为１ ２１％，表明该方法重复性良好。

２ ８　加样回收率实验　精密称取９份已知含量的野蚕豆根药材粉末，每份０
５０ｇ，按“２ ２”制备供试液，分别精密加入一定量的对照品溶液，按“
２ ３”项色谱条件测峰面积，计算回收率，结果显示桃叶珊瑚苷的平均回收率为１００ ９８％，ＲＳＤ＝０ ６９５％。

表１　加样回收试验结果
编号样品中含量／μｇ标准品加入量／μ
ｇ测得量／μｇ回收率／％平均回收率／％
ＲＳＤ／％
１２０ ２３１１ ６３１ ８７１００ ３４２２０ ２３１１ ６３１ ９８１０１ ２９３２０ ２３１１ ６３１ ８８１００ ４３４２０ ２３１７ ４３７ ７３１００ ５７５２０ ２３１７ ４３７ ７６１００ ７４１００ ９８
０ ６９５
６２０ ２３１７ ４３７ ８８１０１ ４３７２０ ２３２３ ２４３ ７０１０１ １６８２０ ２３２３ ２４３ ５１１００ ３４９
２０ ２３
２３ ２
４４ ０１
１０２ ５０
２ ９　供试品含量测定　分别取野蚕豆根（１年生根茎、茎叶；２年生根茎、茎叶）粗粉适量，平行称取６份，按“２ ２”制备供试液，按“２ ３”色
谱条件进样测定，记录峰面积，采用Ｅｘｃｅｌ２０１０处理计算桃叶珊瑚苷的含量。

　表２　各种样品里桃叶珊瑚苷的所含的量　（ｎ＝６）
产地桃叶珊瑚苷的含量／％１年生茎叶０ ０２６６
１年生根茎０ ９７５９
２年生茎叶０ ３７５８
２年生根茎２ ４８１５
３　讨论
野蚕豆根主要化学成分为环烯醚萜苷类化合物，其中含量最高的桃叶珊瑚苷，也是其中的活性成分之一，是评价野蚕豆根质量标准的一个重要指标。

本研究以桃叶珊瑚苷为测定指标，采用流动相甲醇－水溶液（２∶９８）梯度洗脱，流速１ ０ｍＬ／ｍｉｎ，柱温３０℃，检测波长２０３ｎｍ的色谱条件，从而研究野蚕豆根中桃叶珊瑚苷的含量。

实验结果表明在此条件下峰形对称性较高，无拖尾现象，测得含量稳定，重现性好，为野蚕豆根的开发与应用提供实验依据，同时也为其它药材测定桃叶珊瑚苷化合物提供参考。

野蚕豆根在云南省红河州一带资源丰富，被当地苗族广泛用于心血管系统疾病的防治，由于大量采集，现野生资源枯歇，目前在云南省红河州已经开展了大量人工种植，由于３年生野蚕豆根多发生根的腐败而导致产量降低，故一般采收１～２年生药材。

本研究以桃叶珊瑚苷的含量为评价指标，对栽培野蚕豆根１年生、２年生根以及地上部份茎叶进行含量测定，桃叶珊瑚苷２年生根、１年生根、２年生茎叶、１年生茎叶的平均含量分别为：２ ４８１５％、０ ９７５９％、０ ３７５８％、０ ０２６６％。

２年生根、茎叶的桃叶珊瑚苷含量远远高于１年生根、茎叶的含量，为野蚕豆根药材２年采收的合理性提供理论依据。

野蚕豆根主要化学成分是环烯醚萜苷类化合物，环烯醚萜苷类化合物在自然界中分布广泛，是具有多种药理活性的天然产物，有很高的药用价值，其根中的桃叶珊瑚苷是含量最高的化合物。

近代研究，野蚕豆根泡制的酒可以防治脑血栓、脑梗［１４］，也明确了野蚕豆根作为防治心脑血管疾病候选新药的开发价值，根作为原料还可以在新型药物、抗肿瘤、保健食品、化妆品的添加剂等开发方面具有广阔的前景。

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（收稿日期：２０２０－０４－２９　编辑：程鹏飞）。