辣椒雄性不育研究进展

辣椒雄性不育研究进展
郭爽;常绍东;黄贞;刘玉平;曹翠文
【摘要】There are two types of male sterility in hot pepper, i.e., cytoplasmic male sterility and genic male sterility, and it is good materials for research on fertility expression linked to male sterilily in plant. This paper reviews the new research progress in microspore abortion mechanism, the relationship between fertility and physiological-biochemical indexes, fertility-related genetic characteristics and molecular biology, and points out some key ideas for the hot pepper male sterility study in the future.%在辣椒上同时存在细胞质不育和细胞核不育两种遗传类型的雄性不育，是研究植物雄性不育育性表达很好的试验材料。

介绍了辣椒雄性不育的小孢子败育机理、育性与生理生化指标昀关系、育性相关基因遗传特点以及最新的分子生物学研究进展，并指出今后辣椒雄性不育研究的重点。

【期刊名称】《辣椒杂志》
【年(卷),期】2012(000)002
【总页数】5页(P1-5)
【关键词】辣椒;雄性不育;研究进展
【作者】郭爽;常绍东;黄贞;刘玉平;曹翠文
【作者单位】广州市农业科学研究院,广州510308;广州市农业科学研究院,广州510308;广州市农业科学研究院,广州510308;广州市农业科学研究院,广州510308;广州市农业科学研究院,广州510308
【正文语种】中文
【中图分类】S641.3
从遗传角度可将植物雄性不育划分为两大类，一类是细胞质雄性不育（cytoplasmicmale sterility,CMS），育性由细胞质和细胞核基因共同控制；另
一类是细胞核雄性不育（genicmale sterility,GMS），育性仅由细胞核基因控制，不受细胞质影响。

大多数蔬菜作物自然突变的雄性不育仅有其中一种遗传类型，但在辣椒上同时存在CMS和GMS两种不育遗传类型，是研究植物雄性不育育性表达很好的试验材料。

自1951年Martin等首次报道了辣椒雄性不育现象[1]，Peterson首次报道了辣椒的胞核互作型雄性不育以来[2]，辣椒雄性不育的研究和利用得到了广泛重视，特别是近年来分子生物学的迅猛发展，使此项研究工作不断深入。

本文就近年来辣椒雄性不育的败育机理、生理生化指标与败育的关系研究、以及遗传特点和分子生物学等方面的研究现状进行概述。

关于辣椒雄性不育细胞学机理的研究，一些学者研究认为[3-5]是由于小孢子母细
胞不能正常进行减数分裂所致，败育发生在小孢子四分体形成前。

在造孢细胞期，不育系和保持系特征相似，无明显差异，不育系小孢子败育发生在四分小孢子形成以前，由于绒毡层细胞发育异常，高度液泡化，径向膨大，挤压正在进行减数分裂的小孢子母细胞，将小孢子母细胞挤压在一起，使小孢子母细胞呈不规则排列，影响了小孢子母细胞减数分裂的正常进行，不能形成正常四分小孢子，从而不能形成正常的花粉粒而导致败育。

也有一些学者认为[6-10]小孢子母细胞减数分裂正常，可以形成小孢子四分体，败育发生在雄配子体发育时期。

绒毡层细胞未把营养物质供给小孢子发育而用于自身的膨大，或者绒毡层细胞延迟退化，小孢子不能及时得到营养物质而导致了小孢子败育。

这些营养物质被周围的花药壁细胞吸收增大，因此缩小了小孢子囊，导致败育。

李莹莹等在辣椒雄性不育系与可育系小孢子发生的
细胞学观察中发现，上述两种情况均存在，即辣椒败育在造孢细胞增殖到小孢子母细胞进行减数分裂以及释放小孢子形成的各个阶段都有发生[11]。

国内外有关辣椒胞质雄性不育系的细胞学比较研究结果不尽一致，这种不一致可能来自于CMS类型、核背景以及植株生长发育条件的差异。

但无论雄性不育发生在小孢子发育的哪个阶段，都是由于绒毡层细胞的异常发育导致了小孢子的败育，均直接或间接与绒毡层的发育相关。

在辣椒雄性不育系中，可溶性蛋白质含量从蕾期开始逐渐降低，在其保持系中，蛋白质含量则呈逐渐升高的趋势，远高于不育系[12]，推断不育系花药中可溶性蛋白的缺乏是由于来自绒毡层的物质运输被阻断而成为花粉发育的限制因素。

辣椒可溶性蛋白的电泳图谱比较发现[13-14]，在辣椒叶片、干种子、萌发种子中可溶性蛋白不育系均比保持系少几条谱带，同时出现特异性谱带，花药中随小孢子的发育，谱带区别由少到多，并在花粉成熟时出现4条特征带。

说明编码这类蛋白的基因表达，不育系与保持系的差异是连续出现、逐级放大，直到最后足以影响花药中的蛋白含量变化及花药、小孢子的形态建成，从而造成小孢子败育。

另外，雄性不育的发生也与碳水化合物代谢的严重破坏有关。

正常发育的花药在发育过程中会积累丰富的淀粉，而不育花药中几乎不积累淀粉，调节淀粉含量的酶活性也明显降低[15]。

用碘-碘化钾染色鉴定辣椒花粉粒淀粉含量[16]，结果显示不育系花粉不着色或着色浅，形状不规则。

同时在辣椒花蕾的发育过程中[13]，保持系可溶性糖含量一直升高，不育系大花蕾可溶性糖含量明显低于中、小花蕾，也明显低于保持系大花蕾。

表明辣椒雄性不育系花粉中碳水化合物的代谢受到了严重破坏。

过氧化物酶（POD）被认为是与生长素有关的一种重要酶，它以自由生长素为底物，其活性的增强，将有可能导致花药中生长素的亏缺，影响小孢子的正常发育。

辣椒不育系花药中POD活性明显高于可育株。

对花药中POD同工酶酶谱带型的
研究表明[17]，谱带在造孢细胞期的花蕾中就表现出明显差异，不育系较可育系多4条带。

在小孢子母细胞期和四分小孢子期除不育系花药的POD活性高于保持系外，二者带型无明显差异。

花粉粒成熟期，不育系较保持系明显多5条带。

可见
小孢子发育过程中该酶在保持系花粉粒成熟期花药中，除谱带由强到弱外，带型几乎无变化，而不育系谱带变化较大，除2条带减弱外，其余带均加强，且带数增
加较多。

推测不育系的过氧化物酶变化开始于花蕾中除花药以外的部分，并最终引起该酶在花药中的变化。

在花发育过程中，富含游离脯氨酸是正常花粉的一个重要特征。

脯氨酸为花粉萌发和花粉管伸长提供重要的能源和氮源，是花粉代谢活动中一种极活跃的物质，与花粉的发育有着密切关系,且可被直接地用于蛋白质的合成，它的缺乏会影响花粉发
育过程中许多酶与结构物质的合成，从而导致小孢子败育。

在辣椒不育系中，游离脯氨酸含量从蕾期开始逐渐降低，在其保持系中，脯氨酸含量则呈逐渐增高的趋势，保持系含量远高于不育系[12]。

辣椒不育系花药缺乏游离脯氨酸与在玉米、烟草[18]和大白菜[19]上的研究结论相一致。

辣椒CMS雄性不育基因在各种果型的辣椒中广泛存在，但恢复基因主要分布在辣味较浓的小果形辣椒材料中，而大果形辣椒和甜椒材料中相对较少[16，20]。

张
宝玺等认为辣椒CMS育性恢复能力呈连续分布的数量性状特点，利用DH群体与不育系测交，用AFLP标记，在对测交群体育性调查的基础上，把辣椒核恢复基因的QTLs初步定位在第1、3、6、8位点的4个连锁群上[21]。

王立浩将辣椒CMS主效恢复基因定位在第6条染色体上，并找到了4个微效QTLs[22]。

辣椒雄性不育分子标记研究方面，如表1所示，国内学者王得元等找到2个与辣
椒不育基因连锁的RAPD标记[23]，王述彬等也找到了3个与辣椒细胞质雄性不
育基因连锁的RAPD标记以及1个与线粒体DNA相关的RAPD标记 [24-25]。

国外学者Lee等通过BAS法和AFLP技术找到了1个与彩色甜椒ms基因紧密连
锁的AFLP标记，并将其成功转化为CAPS标记，命名为PmsM1-CAPS，距离
ms位点2～3 cM[26]；找到了与辣椒ms3位点紧密连锁的3个AFLP分子标记，并将其中的1个AFLP标记转化为CAPS标记，命名为GMS3-CAPS，此标记能
够区分纯合体和杂合体[27]；找到1个与辣椒ms1位点紧密连锁的AFLP标记，
离ms1位点大约3 cM[28]。

与Rf基因连锁的分子标记研究中，张宝玺等利用群
分法找到位于主效恢复基因两侧的2个RAPD标记，与恢复基因分别相距0.37
cM和8.12 cM[29]。

随后唐冬英也找到了一个与恢复基因紧密连锁的RAPD标记[30]。

常彩涛等利用RAPD标记，在恢复系中扩增得到一条约1515 bp的特异片段，荧光原位杂交证实其为恢复系特有[31]。

国外学者也报道了与Rf基因紧密连
锁的2个CAPS标记和1个STS标记，2个CAPS标记分别命名为OPP13和AFRF8，分别距离Rf基因位点 1.1 cM和 1.8 cM，STS标记命名为CRF-SCAR，距离 Rf基因位点 5.3 cM[27，32-34]。

辣椒雄性不育基因克隆研究，国外学者Kim报道了与辣椒CMS有关的atp6基因结构，利用线粒体特有的探针对不育系和保持系的线粒体基因组进行 Southern和Northern印迹分析，在不育系CoxⅡ基因的3’端发现了一个特异的开放阅读框，命名为orf456。

随后的Western印迹分析表明，一个约17 kDa的蛋白质在雄性不育系中特异表达，并且随着恢复基因的引入，此蛋白的含量显著下降。

转基因试验也证实，此基因的导入确实可以导致雄性不育发生[35-36]。

以此基因序列设计
引物，在不育系中扩增到了一条特异带，测序结果表明它与orf456高度同源，进一步证明orf456基因与辣椒不育有关。

利用反向PCR技术获得了此片段的侧翼
序列，发现其侧翼序列与编码烟草NADH脱氢酶第一亚基的基因高度同源，推测此开放阅读框与编码线粒体NADH脱氢酶第一亚基的基因发生重组，从而导致NADH脱氢酶无法行使正常的生理功能，导致雄性不育发生。

国内学者邓明华等
也在辣椒CMS不育系中扩增到atp6和CoxⅡ两个基因，而在保持系和恢复系中
均未能扩增到该序列[37]。

郭爽等以辣椒细胞质雄性不育系和其相应的近等基因恢复系为试验材料，利用抑制消减杂交（SSH）技术成功构建了CMS恢复基因诱导表达的消减cDNA文库，结合高密度点阵膜杂交差异筛选，共得到175个在恢复系材料中高表达或特异表达的Unique ESTs。

并采用RT-PCR技术对部分ESTs序列进行表达分析，推测辣椒不同材料的育性恢复过程或机制并不完全相同，而且辣椒花药对恢复基因表达的响应要敏感于花瓣、萼片以及子房等花器官，同时花器官对恢复基因表达的响应要敏感于以叶片为代表的营养器官的响应，但总的来说，不同器官对恢复基因表达的响应是不同的。

采用RACE技术从辣椒恢复系花药中获得了一个控制辣椒花器官发育的MADS-box基因，命名为PPI，但是并未阐明该基因与辣椒育性恢复的关系[38-40]。

辣椒由于其显著的杂交优势，F1代杂交种在辣椒生产上广泛应用，利用辣椒胞质雄性不育三系配套来制种可以降低制种成本，保证种子纯度，保护知识产权，在辣椒杂种优势利用中具有广阔的前景。

目前，国内外学者对辣椒雄性不育的来源、分类、分布特征、败育机理、生理生化指标、遗传规律以及分子生物学等方面进行了深入研究，并取得了重大成果，但是辣椒发生雄性不育时，是否产生一些副效应，以及有关辣椒不育基因和恢复基因的作用机理等方面的研究甚少。

目前关于植物CMS不育的机理有两种假说，一种认为CMS相关嵌合基因的产物是具有毒性的细胞毒素蛋白，这种蛋白在花药中积累，间接或直接破坏线粒体正常生理生化功能，中断花粉发育，从而导致花粉败育。

在水稻中的研究结论验证了毒性假说[41]。

另一种假说是共转录假说，认为CMS相关的嵌合基因和正常线粒体基因共转录，导致某些基因的表达异常，甚至功能丧失，影响呼吸链和正常电子传递，影响线粒体的正常生理功能，导致花粉败育。

在矮牵牛中，发现不育系抗氰呼吸途径的活力比可育系低很多[42]。

而恢复基因通过改变CMS相关嵌合基因的表达而抑制雄性不育的性状[43]。

在辣椒中，研究者可以借鉴在其他植物种类中的研
究思路，从而探求辣椒中雄性不育及育性恢复的基因作用机理，为从分子水平对辣椒育性进行调控，选育恢复系和不育系奠定基础，也为辣椒雄性不育系、恢复系、保持系的获得提供新的思路和途径。

【相关文献】
[1] Martin J,Crawford J.Several types of sterility in capsicum
frutescens[J].Proc.Am.Soc.Hortic.Sci.,1951,（57）:335-338
[2] Peterson P A.Cytoplasmically inherited male sterility in capsicum[J].The American Naturalist,1958,92 （863）:111-119
[3] 吴鹤鸣，余建明，周邗杨，等．羊角椒雄性不育系与保持系的细胞学观察[J]．江苏农业学报，1988，4（2）：35-38
[4] 耿三省，王志源，蒋建箴，等．辣椒雄性不育系小孢子发生的细胞学观察[J]．园艺学报，1994，21（2）：165-169
[5] 刘建萍，辛华，程斐，等．“菜椒1号”雄性不育系与同型保持系小孢子细胞学观察[J]．莱阳
农学院学报，2002，19（4）：273-275
[6] Hirose T,Fujime Y.Studies on hybrid seed production using a new male sterility line in
C.annuum[J].Jap.Soc.Hort.Sci.,1981,50（1）:66-70
[7] 石太渊，印东生，胡迎雪，等．辣椒雄性不育系小孢子发生的细胞形态学及减数分裂观察[J]．辽宁农业科学，1999（6）：6-10
[8] 王述彬，罗向东，戴亮芳，等.辣（甜）椒细胞质雄性不育系减数分裂和雄配子体发生过程[J].园艺学报，2004，31（6）：807-810
[9] 逯红栋，巩振辉，王晓敏，等．辣椒雄性不育材料小孢子发生的细胞形态学观察[J]．西北植物
学报，2006，26（9）：1842-1845
[10] 王述彬，罗向东，戴亮芳，等．甜椒胞质雄性不育雄配子发育的解剖学和超微结构研究[J]．武汉植物学研究，2004，22（6）：557-560
[11] 李莹莹，魏佑营，张瑞华，等．辣椒雄性不育系与可育系小孢子发生的细胞学观察 [J]．植物
研究，2006，26（4）：411-415
[12] 邓明华，文锦芬，邹学校，等．辣椒细胞质雄性不育系的物质代谢和过氧化物酶分析 [J]．云
南农业大学学报，2007，22（6）：791-794
[13] 邓明华，邹学校，周群初，等．辣椒胞质雄性不育系与保持系生化特性研究 [J]．湖南农业大
学学报，2002，28（6）：492-494
[14] 邹学校，侯喜林，刘荣云，等．辣椒细胞质雄性不育基因对不育系及杂交一代农艺性状和生化特性的影响[J]．园艺学报，2004，31（6）：732-736
[15] 李太贵．不同育性细胞质对水稻叶片β-淀粉酶活性及同功酶的影响[J]．遗传学报，1980，7（2）：174-178
[16] 沈火林，蒋健箴，王志源，等．辣椒雄性不育系选育及遗传研究[J]．北京农业大学学报，1994，20（1）：25-30
[17] 陈正钢．辣椒细胞质雄性不育生理生化特性的初步研究[D]．北京:北京农业大学,1995
[18] 陈晓斌，曹有龙，贾勇炯，等．白肋烟草雄性不育系的过氧化物酶同工酶和游离氨基酸分析[J]．浙江农业学报，1999，11（2）：76-79
[19] 孙日飞，方智远，张淑江．萝卜胞质大白菜雄性不育系的生化分析[J]．园艺学报，2000，27（3）：187-192
[20] 王述彬，刘金兵，潘宝贵．辣（甜）椒细胞质雄性不育恢复基因的遗传与分布[J]．华北农学报，2007，22（1）：86-89
[21] 张宝玺，王立浩，黄三文，等.辣椒分子遗传图谱的构建和胞质不育恢复性的QTL分析 [J]．中国农业科学，2003，36（7）：818-822
[22] Wang L H,Zhang B X,Lefebvre V,et al,QTL analysis of fertility restoration in cytoplasmicmale sterile pepper[J].The Oretical and Applied Genetics,2004,109（5）:1058-1063
[23] 王得元，王鸣，郑学勤．用RAPD分析辣椒细胞质雄性不育基因．核农学报，2005，19（2）：99-102
[24] 王述彬，刘金兵，潘宝贵．辣椒细胞质雄性不育系与其保持系基因组DNA的RAPD分析[J]．上海农业科学，2008，24（1）:8-10
[25] 王述彬，罗向东，戴亮芳，等．辣椒细胞质雄性不育系与其保持系线粒体DNA的RAPD分析[J]．江苏农业学报，2008，24（1）:44-47
[26] Lee J,Yoon J B,Park H G.A CAPS marker associated with the partial restoration of cytoplasmicmale sterility in chili pepper （Capsicum annuum L.） [J].Molecular Breeding,2008,21:95-104
[27] Lee J,Yoon J B,Park H G.Linkage analysis between the partial restoration （pr） and the restorer-of-fertility（Rf）loci in pepper cytoplasmicmale
sterility[J].Theor.Appl.Genet.,2008,117:383-389
[28] Lee J,Yoon J B,Han J H,et al.A codominant SCAR marker linked to the genicmale sterility gene （ms1） in chili pepper （Capsicum annuum L.） [J].Plant
Breeding,2010,129:35-38
[29] Zhang B X,Huang S W,Yang G M,et al.Two RAPD markers linked to a major fertility restorer gene in pepper[J].Euphytica,2000,113:155-161.
[30] 唐冬英，邹学校，刘志敏，等．辣椒胞质雄性不育恢复基因的 RAPD 标记 [J]．湖南农业大学学报，2004，30（4）：307-309
[31] 常彩涛，王春国，陈成彬，等．细胞质雄性不育辣椒育性恢复基因特异分子标记的筛选[J]．实验生物学报，2005，38（3）：227-232
[32] Kim D S.Development of RAPD and AFLP markers linked to fertility restorer （Rf）gene in chili pepper（Capsicum annuum L.） [J].Thesis,Seoul National University,2005 [33] Kim D S,Kim D H,You J H,et al.Cleaved amplified polymorphic sequence and amplified fragment length polymorphism markers linked to the fertility restorer genic chili pepper （Capsicum annuum L.） [J].Mol.Cells,2006,21:135-140
[34] Gulyas G,Pakozdi K,Lee J S,et al.Analysis of fertility restoration by using cytoplasmicmale-sterile red pepper（Capsicum annuum L.） line[J].Breed
Sci.,2006,56:331-334
[35] Kim D H,Kim B D.The organization of mitochondrial atp6 gene region in male fertile and CMS lines of pepper[J].Current Genetics,2005,49:59-67
[36] Kim D H,Jeong G K,Kim B D.Isolation and characterization of the cytoplasmicmale sterility-associated orf456 gene of chili pepper[J].Plant Molecular Biobogy,2007,63（4）:519-532
[37] 邓明华，邹学校，霍金龙，等．辣椒核质互作雄性不育系线粒体不育基因CoxⅡ和atp6的克隆与分析 [J]．西北植物学报，2010，30（10）：1935-1940
[38] Guo S,Ma N,Yang W C,et al.Expression analysis of restorer alleles-induced genes in pepper[J].Agricultural Sciences in China,2011,10（7）:1010-1015
[39] 郭爽，马宁，杨文才，等.辣椒花器官发育MADS-box基因的克隆与表达分析 [J]．园艺学报，2010，36（10）：1591-1597
[40] 郭爽，沈火林，杨文才，等．利用抑制消减杂交技术分离辣椒细胞质雄性不育育性恢复相关EST[J]．园艺学报，2009,36（10):1443-1449
[41] Wang Z H,Zou Y J,Li X Y,et al.Cytoplasmicmale sterility of rice with BoroⅡcytoplasm is caused by a cytotoxic peptide and is restored by two related PPR motif genes via distinct modes of mRNA silencing[J].Plant Cell,2006,18:676-687
[42] Connett M,Hanson M R.Differential mitochondrial electron transport through the cyanide-sensitive and cyanide-insensitive pathways in is onuclear lines of cytoplasmicmale sterile,male fertile and restored petunia[J].Plant Physicol.,1990,93:1634-1640
[43] Pathania A,Bhat S R,Kumar V D,et al.Cytoplasmicmale sterility in alloplasmic Brassica juncea carrying diplotax is catholica cytoplasm:molecular chaization and genetics of fertility restorationr[J].Theo.Appl.Genet.,2003,107:455-461。