福建黄兔微生物和寄生虫感染状况调查与分析

福建黄兔微生物和寄生虫感染状况调查与分析俞春英林玮谢金东王训立*福建中医药大学实验动物中心福州350122
摘要为了调查我校教学用福建黄兔的微生物和寄生虫携带状况,参照国家标准普通级家兔微生物和寄生虫检测项目及方法,以一年为抽查周期,从2016年5月至2017年4月每个季度检测一次,共四批次。

采用增菌分离培养、生化鉴定及血清学鉴定方法分别检测沙门氏菌、多杀巴斯德杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌,ELISA试剂盒检测泰泽病原体、兔出血症病毒的抗体, IHA试剂盒检测弓形虫抗体,显微镜观察体外寄生虫,漂浮法和沉淀法检测粪便中的线虫。

调查发现四批次共计100只福建黄兔的检测合格率为沙门氏菌100%、多杀巴斯德杆菌100%、金黄色葡萄球菌100%、绿脓杆菌100%,泰泽病原体、兔出血症病毒、弓形虫抗体检测合格率均为100%,体外寄生虫痒螨成虫及卵的检出率36%,兔粪球线虫检测的合格率100%。

结果表明,饲养于普通环境中的非等级福建黄兔未发现携带人畜共患病和动物烈性传染病病原体,但体外寄生虫如螨虫的感染率较高。

关键词福建黄兔微生物寄生虫检测
文献标识码:A文章编号:1003-4331(2018)03-0001-04
Investigation and analysis of microorganism and parasites for Fujian rabbits
Yu Chunying Lin Wei Xie Jindong Wang Xunli*
(Laboratory Animal Center,Fu Jjian Univesity Of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou350122)
Abstract To investigate the infection state of microorganism and parasites from Fujian rabbit,through the test items and test methods of conventional rabbit from national standards,and from May2016to April2017as a investigation period,then tested rabbits once a quarter for four batches in all.The methods of enrichment culture and biochemical and serology were used to identify salmonella,Pas鄄teurella multicida,Staphylococcus aureus,Pseudomonas aeruginosa.The ELISA kit was used to test the antibody of the Tyzzer organism and Rabbit hemorrhagic disease virus.The IHA kit was used to test the antibody of toxoplasmosis.The microscope was used to observe parasite in vitro and the floatation and precipitation was used to observe the nematode in the stools.The investigation showed that the percent of pass in one hundred Fujian rabbits from four batches as100%for the all testing items except the parasite in vitro is36%. The results showed that Fujian rabbits who breeding in the non-rank environment have no zoonotic and animal fulminating infectious disease,but have high infection rate in parasites in vitro.
Key words Fujian rabbit Microorganisms Parasites Test
福建黄兔是福建省独有的家兔品种,是长期的
地理隔离演变来的。

据报道,福建黄兔耐粗饲、繁殖
率和成活率高,这对于在养殖业中难度较大的兔类
饲养来讲是极其有利的优势[1-3]。

福建省连江玉华山兔场是我省福建黄兔的种源基地,该兔场繁殖生产
的家兔属于非等级实验兔,饲养于普通的开放环境,
主要供肉用和当地高等院校的教学实验用动物。

我
校长期教学用家兔主要来源于该兔场,鉴于该家兔
为非等级实验兔,由于在教学用家兔的使用环节中
存在多种可能发生的生物安全隐患,如学生偶尔被
抓伤、咬伤,进行采血、灌胃、解剖实验等,倘若发生
具有危害性的病原体感染事故,将会严重影响到实
验人员及学生的身体健康,甚至带来局部的传播。

因
此,动物的微生物学和寄生虫学质量控制与我们的
实验环境安全和身体健康息息相关。

为防范于未然,定期抽查我校所使用的教学实验用家兔的微生物和寄生虫携带情况,以最大程度控制和避免教学生物安全事故的发生[4-6]。

1材料与方法
1.1实验动物福建省连江县玉华山种兔场饲养的4月龄福建黄兔,四批次动物按春、夏、秋、冬四个季度采样,每季度随机挑选25只,于我校实验动物中心[SYXK(闽2014-0006)]适应性饲养一周,观察无异常症状表现后进行相关项目的检测。

1.2试剂及设备
1.2.1细菌检测试剂SF培养基、NAC养基、高盐甘露醇培养基、DHL培养基、血琼脂平板、生化鉴定管购自广州环凯微生物科技有限公司;兔泰泽病原体抗体检测试剂盒购自苏州西山生物技术有限公司;戊巴比妥钠由索莱宝生物科技有限公司分装,批号为1014P034和701O034。

1.2.2病毒检测试剂兔出血症病毒检测ELISA 试剂盒购自Express BIO。

1.2.3寄生虫检测试剂弓形虫间接血凝试验(I⁃
基金项目:福建省实验动物研究重点项目(2015Y0016)资助。

作者简介:俞春英(1982-),女,硕士,助理研究员。

研究方向为实验动物学,yuchunying_2009@。

*通信作者:王训立(1964-),男,研究员,wxl@。

HA )试剂购自中国农业科学院兰州兽医研究所。

1.2.4其他试剂其他试剂均采用国产分析纯或进
口分析纯试剂。

1.2.5
主要仪器设备
生化培养箱(MIR-254,日本
三洋);生物光学显微镜(E100,尼康);全自动酶标
仪(ELX808,美国宝特);洗板机(ELX50,美国宝特);高压灭菌锅(MLS-3750,日本三洋);超净工作台(SW-CJ-2FD ,苏州安泰);电热恒温干燥箱(DHG-9053A ,上海一恒)。

1.3
检测程序
动物→编号→外观检查(正常)→
皮肤取样(体外寄生虫检查)→采血(分离血清,检查病毒抗体和其他病原的抗体)→麻醉→无菌解剖→增菌分离培养→生化鉴定、血清学鉴定→结果判定。

1.4寄生虫检测1.4.1
体外寄生虫检测
依据国家标准GB/T
18448.1-2001[7],采用拔毛法,逐只在兔的体表如耳、背、腹股沟等体外寄生虫易感部位拔取少量被毛,分别散放在载玻片上,用透明胶粘住,编号,记录取样部位,保存于4℃冰箱。

为避免虫体降解需2d 内检测完毕,所有玻片于显微镜下观察,每一玻片重复观察一次,并记录结果。

1.4.2
体内寄生虫检测
依据国家标准GB/T
18448.2-2008[8],清醒状态采兔耳静脉血,分离血清,按弓形虫抗体、出血症病毒抗体、泰泽病原体抗体检测所需的血清量分装,编号,-80℃冻存。

使用购买的弓形虫间接血凝试验(IHA 试验)的冻干抗原,定性检测兔血清中的弓形虫抗体。

检测步骤:用微量加样器在96孔有机玻璃反应板的每孔中加稀释液,每个样品需加4孔稀释液,同时设阳性血清、阴性血清、空白对照;加待检血清、阳性对照血清、阴性对照
血清;样品稀释至第3孔,对照血清均稀释至第7孔;将诊断液摇匀后加入每个孔,然后将反应板置微型振荡器上振荡1~2min ,取下反应板,盖上与板大小相近的玻璃罩,置37℃作用2~3h 后观察结果。

结果判定:在阳性对照血清效价不低于1:1024,阴性对照血清除第1孔允许有前滞现象“+”,其余各孔均为“﹣”,稀释液对照为“﹣”的前提下,对待检血清进行判定,待检血清效价达到或超过1:64判为阳
性,否则为阴性。

另收集兔粪球,每只数粒,装入自封袋,编号,
4℃冰箱冷藏,采用漂浮法和沉淀法检测粪便中的线虫,一周内检测完毕。

1.5
病毒检测
依据国家标准GB/T14926.21-2001[9],采用ELISA 试剂盒检测兔出血症病毒。

操作步骤:1:50稀释血清样本,同时每个检测项目均设阳
性病毒抗原孔及阴性对照抗原孔;一抗孵育,在已包被抗原的ELISA 微孔条上标上序号,再向ELISA 微孔板中阳性病毒抗原孔及阴性对照抗原孔各加稀释好的样本及阴性、阳性对照,贴上封板膜,置37℃孵育45min ;洗板5次,吸水纸上拍干;每孔加入酶标二抗,贴上封板膜,置37℃孵育45min ;洗板步骤同上;显色,加入ABTS 酶底物,室温反应30min ;读板,加入终止液反应2min ,并在15min 内用酶标仪读数,测试波长为405nm 。

结果判定:阴性对照血清的抗原孔读数减去对照抗原孔读数必须﹤0.250、阳性对照血清抗原孔减去对照抗原孔读数必须≧
0.600时,本次试验结果有效。

样本孔读数OD 值减去对照抗原孔OD 值≧0.300时判为阳性,否则为
阴性。

1.6细菌检测按照国家标准GB/T 14926.1-2001[10]、GB/T 14926.5-2001[11]、GB/T 14926.14-2001[12]、GB/T 14926.17-2001[13]、GB/T 14926.10-2008[14]的方法,3%戊巴比妥钠耳静脉麻醉兔,在超净台上无菌解剖兔,挑取少量回盲部内容物分别接种SF 增菌液、高盐甘露醇培养基、NAC 培养基,同时挑取少量气管分泌物划线接种血琼脂平板,然后增菌分离培养,结合生化鉴定和血清学鉴定,分别检测该种兔场兔的沙门氏菌、多杀巴斯德杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌感染情况。

使用ELISA 试剂盒检测兔血清中泰泽病原体的抗体,步骤与兔出血症病毒抗体检测类似。

2结果
2.1
福建黄兔体内外寄生虫检测
四批次家兔体
内寄生虫检测结果均为阴性,说明该家兔群体没有弓形虫病原的感染,兔粪球中也未查到线虫,但四批次均有不同程度的体外寄生虫(螨虫)感染,结果见表1。

不同时间体内外寄生虫检测阳性率(%)
检测项目
抽检数量(只)
2016年夏
2016年秋
2016年冬
2017年春
体外寄生虫(节肢动物)
线虫弓形虫
252525
4400
2800
3200
4000
表1福建黄兔体外寄生虫(节肢动物)、弓形虫、线虫检测结果
2.2福建黄兔出血症病毒检测该兔场有实施兔出血症病毒的免疫程序,四批次福建黄兔的出血症病毒抗体检测均为阳性,表明经过免疫的福建黄兔能很好地得到抗体的保护,避免感染出血症病毒。

结果见表2。

表2福建黄兔出血症病毒抗体的检测结果
2.3福建黄兔细菌学检测四批次共100只黄兔的细菌检测结果均为阴性,表明该群体无沙门氏菌、多杀巴斯德杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、泰泽病原体的流行,符合国家标准规定的普通级家兔的细菌检测标准,不存在普通级家兔所要排除的人畜共患病和动物烈性传染病病原体。

但据悉该兔场有实施一定的细菌免疫程序,因此,还无法达到国家标准中规定的不能免疫又必须阴性的要求,仅能作为实验用动物,结果见表3。

3讨论
近几年在高等院校发生了多起因实验动物所引发的教学生物安全事故,因此,在高校及科研院所的科研和教学动物实验中提高生物安全意识,警惕生物安全事故的发生显得极其重要。

由于我省没有正规的实验兔供应机构,所有标准等级的科研用兔均购自北京、上海等地,导致提高动物成本和延长供应时限。

我校每年教学兔用量达1000只左右,教学兔用量大,而教学实验对动物质量要求不高,受制于教学实验经费和使用的便利性,因此,该兔场繁殖生产的非等级福建黄兔就成为我校教学用家兔的主要供应来源。

目前,福建黄兔为非等级家兔,饲养于普通开放环境中,为了预防动物疫病及防范教学动物实验的生物安全事故,有必要了解该兔的微生物和寄生虫流行情况,为此开展了该项调查研究。

由于微生物和寄生虫的流行情况往往有季节性特点,为了全面了解不同季节该兔的微生物和寄生
虫感染情况,本试验按季度对兔场的生产繁殖群进
行抽检采样,参照实验动物国家标准中普通级家兔
的检测要求选择检测项目[15],另增加多杀巴斯德杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、泰泽病原体项目。

结果表明,抽查的四批次福建黄兔未发现感染
沙门氏菌、多杀巴斯德杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓
杆菌和泰泽病原体,每只兔都检测到出血症病毒保
护抗体,100只福建黄兔均无弓形虫感染,但体外寄
生虫螨虫的平均检出率达36%。

由此可知,福建黄
兔不存在人畜共患病和烈性传染病的病原体感染,
兔的健康状况良好。

但该兔场的兔体外寄生虫如螨
虫的感染率较高,可能是因为饲养于普通环境,且该
兔场生产的家兔大部分供作肉用,在饲养上未达到
国家标准中普通级家兔的饲养环境标准和饲养管理
要求。

此外,也不能排除兔在运输过程和饲养于我校
动物中心这一阶段所带来的微生物和寄生虫感染的
可能,因此,今后若进行阶段性的抽查,需到现场采
样以排除这一可能。

螨虫的存在虽不会对环境和人
体造成致命性危害,但影响动物的质量和人的身体
健康。

而要消除螨虫感染,需从净化种群、净化饲养
环境和加强饲养管理入手,但对于这类非等级的实
验动物生产供应商的地方性养殖场而言是难以实现
的。

因此,要改变教学实验用家兔的现状,首先,需从
学校层面出发,提高教学实验经费,购买标准的实验
动物用于教学;其次,提高学校师生的生物安全意
识,培养学生的规范操作技能和习惯;最后,学校需
要制定相应的应急预案,从而最大程度避免教学生
物安全事故的发生,以保障实验环境不被致病性生
物污染、师生健康不受伤害[16]。

参考文献:
[1]张爱华.浅谈福建黄毛兔[J].畜牧兽医杂志,2004,23(6):41.
[2]谢喜平,陈岩锋,孙世坤,等.福建黄兔报种及创新利用的研
究与实践[J].中国养兔杂志,2006(6):3-5.
[3]林和官,谢喜平.福建黄兔品种特性之一-繁殖和生长发育
[J].中国养兔杂志,1998(6):3-5.
检测项目抽检数
量(只)
不同时间抗体阳性率(%)
2016
年夏
2016
年秋
2016
年冬
2017
年春
兔出血症
病毒抗体25
100100100100
表3福建黄兔细菌学检测结果
检测项目抽检数量(只)
不同时间细菌学检测阳性率(%)
2016年夏2016年秋2016年冬2017年春
沙门氏菌
多杀巴斯德杆菌金黄色葡萄球菌绿脓杆菌
泰泽病原体25
25
25
25
25
[4]罗小泉,陈丽玲,徐彭,等.对教学动物实验安全事故的反思
及对策研究[J].黑龙江畜牧兽医,2014(4):164-165. [5]钱军,孙玉成.实验动物与生物安全[J].中国比较医学杂志,
2011,21(10/11):15-19.
[6]张永斌,郭学军.高校实验动物与生物安全[J].畜牧与饲料
科学,2016,37(2):91-93.
[7]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T
18448.1-2001实验动物体外寄生虫检测方法[S].2001.
[8]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T
18448.2-2008实验动物弓形虫检测方法[S].2008. [9]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/
T14926.21-2001实验动物兔出血症病毒检测方法[S].
2001.
[10]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/
T14926.1-2001实验动物沙门菌检测方法[S].2001.[11]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/
T14926.5-2001实验动物多杀巴斯德杆菌检测方法[S].
2001.
[12]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/
T14926.14-2001实验动物金黄色葡萄球菌检测方法[S].2001.
[13]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/
T14926.17-2001实验动物绿脓杆菌检测方法[S].2001.
[14]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/
T14926.10-2008实验动物泰泽病原体检测方法[S].
2008.
[15]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/
T14922.2-2001实验动物微生物等级及监测[S].2001.
[16]张慧俭,张娜.中医院校实验动物生物安全教育现状及对
策[J].中国科技创新导刊,2013(32):82.
猪肉中赛庚啶残留检测提取方法探究
张晶福建省农产品质量安全检验检测中心福州350003
摘要探索猪肉中的赛庚啶残留物前处理的提取方法,确定采用β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶酶解、离心,提取液经MCX小柱净化,氮吹浓缩后用超高效液相色谱-串联质谱法进行定量检测。

能有效排除干扰,而且方法快速、简便、准确,可用于猪肉中赛庚啶残留量的测定。

关键词赛庚啶超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)
文献标识码:A文章编号:1003-4331(2018)03-0004-03
The exploration of the methods of detecting and extracting cyproheptadine residues from swine tissues
Zhang Jing
(Fujian Inspection and Testing Centre for Agricultural Product Quality and Safety,Fuzhou350003)
Abstract The extraction method of cyproheptadine residues from swine tissues via pre-treatment has been explored by usingβ-glu⁃cosidase hydrochloride/aryl sulfatase to proceed enzymatic hydrolysis and centrifugation,and the extracting solution is measured by ul⁃tra-performance liquid chromatographic-tandem mass spectrometry after being purifing by MCX and concentrated by nitrogen.This method of determinating the amount of cyproheptadine residue in pig tissues is efficient,simple and accurate by eliminating interfer⁃ence effectively.
Key words Cyproheptadine UPLC-MS/MS
赛庚啶(二苯环庚啶,Cyproheptadine)为抗过敏药,主要用于治疗人的过敏性疾病。

由于赛庚啶可在动物下丘脑食欲中枢对5-羟色胺拮抗,抑制下丘脑的饱觉中枢而刺激食欲、增加体重,因此,赛庚啶在动物养殖中非法使用后果较严重。

2010年,农业部
1519号公告将赛庚啶列入了《禁止在饲料和动物饮水中使用的物质》,制定了农业部标准《饲料中可乐定和赛庚啶的测定》[1],并纳入全国饲料质量安全监测工作中。

统计近几年的监测结果,发现猪饲料阳性率比较高。

赛庚啶具有中枢神经系统抑制作用,人服用后会出现嗜睡、镇静、头晕、反应力下降等毒副作用。

目前,已开展对动物组织[2]、猪尿[3]、饲料[4]等方法研究,尚无猪肉中赛庚啶残留检测方法的相关标准。

本文探索对猪肉中赛庚啶残留物不同前处理提取方法比较,确定经酶解提取、离心净化后,采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法测定猪肉中赛庚啶残留量,能有效排除干扰,而且该方法快速、简便、准确,可用于猪肉中赛庚啶残留量的测定。

1仪器、试剂与材料
1.1仪器超高效液相色谱串联质谱仪(Waters TQ-SUPLC/MS/MS);瑞士梅特勒-托利多电子天平(AX105,感量0.00001g);奥豪斯电子天平(AR3130,感量0.001g);美国科俊高速冷冻离心机(D-37520);美国Organomation氮吹仪(N-EVAP)。