DRR390A

中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的 DNA 模板添加量。 如果欲使用本制品进行 2 Step RT-PCR 反应的第二步 PCR 扩增反应，第一步的 RT 反应 液作为 DNA 模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的 10%。
2） 进行 Real Time PCR 反应。 建议采用下列图表显示的两步法 PCR 反应程序。退火/延伸时间可在 20～30 秒范围内进行调整，推荐 使用 30 秒的条件。有关 PCR 的具体反应条件请参照「PCR 反应条件说明」。
使用量 10.0 μl 0.4 μl 0.4 μl 0.8 μl 0.4 μl 2.0 μl 6.0 μl 20.0 μl
使用量 25.0 μl 1.0 μl 1.0 μl 2.0 μl 1.0 μl 4.0 μl 16.0 μl 50.0 μl
终浓度 1×
0.2 μM*1 0.2 μM*1
*2 1× *3
● 操作方法
◆ 应用Thermal Cycler Dice® Real Time System扩增仪的操作方法
请按照Thermal Cycler Dice® Real Time System（Takara Code：TP800）的使用说明书要求进行实验操 作。
-2-
1） 按下列组份配制 PCR 反应液（反应液配制请在冰上进行）。
● 制品内容（50 μl 反应×200 次）
Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）（2×Conc.）*1 ROX Reference Dye（50×Conc.）*2 ROX Reference Dye II（50×Conc.）*2
1.0 ml×5 支 200 μl ×1 支 200 μl ×1 支
● 适用的 Real Time PCR 扩增仪
Thermal Cycler Dice® Real Time System（Takara） ABI PRISM® 7000/7700，7300/7500 Real-Time PCR System，7500 Fast Real-Time PCR System （Applied Biosystems） LightCycler®（Roche Diagnostics） Smart Cycler® II System（Cepheid） Mx3000PTM（Stratagene） 其他各种 Real Time PCR 扩增仪
试剂
使用量
终浓度
Premix Ex Taq （Probe qPCR）（2×）
12.5 μl
1×
PCR Forward Primer（10 μM）
0.5 μl
0.2 μM*1
PCR Reverse Primer（10 μM）
0.5 μl
0.2 μM*1
荧光探针溶液
1 μl
*2
模板
2 μl
*3
dH2O（灭菌蒸馏水）
Takara Code：DRR390A
Premix Ex Taq TM
(Probe qPCR) （200 次量）
说明书
宝生物工程(大连)有限公司
目录
内容
页码
● 制品说明
1
● 制品内容
1
● 适用的 Real Time PCR 扩增仪
1
●保 存
1
● 试剂盒原理
1
● 试剂盒特长
2
● 操作注意
2
● 操作方法
*5
*1 通常引物终浓度为 0.2 μM 可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在 0.1～1.0 μM 范围内调整引物浓度。
*2 使用的探针浓度，与使用的 Real Time PCR 扩增仪、探针种类、荧光标记物质种类有关， 实际使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行。
*3 在 20 μl 反应体系中，DNA 模板的添加量通常在 100 ng 以下。因不同种类的 DNA 模板 中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的 DNA 模板添加量。 如果欲使用本制品进行 2 Step RT-PCR 反应的第二步 PCR 扩增反应，第一步的 RT 反 应液作为 DNA 模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的 10%。
11
●问 答
11
● 制品说明
本制品是采用探针法（TaqMan®，Molecular Beacon等）进行Real Time PCR（qPCR）反应的专用试剂。 是一种 2×浓度的Premix Type试剂，进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单。Mix中添加了Tli RNaseH（耐热性RNaseH），以cDNA作为模板进行PCR反应时，可以最大限度抑制由于cDNA中残存 mRNA对PCR反应造成的阻害作用。制品中的DNA聚合酶使用了改良后的Hot Start法用 DNA聚合酶 TaKaRa Ex Taq HS，与Takara精心研制的Real Time PCR用Buffer组合使用，可以有效抑制非特异性的 PCR扩增，大大提高PCR的扩增效率，进行高灵敏度的Real Time PCR扩增反应。 本制品可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。
水便可进行 Real Time PCR 反应，操作简单方便。 3． DNA 聚合酶使用了改良后的 TaKaRa Ex Taq HS，可以进行 Hot Start 法 PCR 反应，再与 Takara 公司
独自开发的 Buffer 系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度，高扩增特异性之特点。 4． 在 2×浓度的 Premix 中，预先添加了耐热性 RNaseH（Tli RNaseH），可以最大限度抑制以 cDNA 作为
3） 实验结果分析。 反应结束后确认 Real Time PCR 的扩增曲线，进行 PCR 定量时制作标准曲线等。
-3-
◆ 应用ABI PRISM® 7000/7700/7300 Real-Time PCR System，StepOnePlusTM Real-Time
PCR System的操作方法
*1 内含TaKaRa Ex Taq HS，dNTP Mixture，Mg2+, Tli RNaseH等。 *2 只使用在 ABI、Stratagene 等公司的 Real Time PCR 扩增仪上，用以校正孔与孔之间产生的荧光
信号误差。使用 ABI PRISM 7000/7700/7300 和 StepOnePlus Real-Time PCR System 使用 ROX Reference Dye，7500 Real-Time PCR System 和 7500 Fast Real-Time PCR System 使用 ROX Reference Dye II，Stratagene 公司的 Mx3000P 也适用 ROX Reference Dye II。Thermal Cycler Dice Real Time System、LightCycler、Smart Cycler II System 等 Real Time PCR 扩增仪时不必 使用。
1．热变性
Primer
探针
荧光物质
淬灭物质
2．引物退火/探针与模板的杂交
Polymerase
探针杂交
3．延伸反应
● 试剂盒特长
1． 适用于 Real Time PCR 反应，可以快速、准确地对目的基因进行检测、定量。 2． 是一种 2×浓度的 Premix Type 试剂，PCR 反应液配制时，只需加入模板、引物、荧光探针、灭菌蒸馏
请按照各种仪器使用说明书要求进行实验操作。 1） 按下列组份配制 PCR 反应液（反应液配制请在冰上进行）。
试剂 Premix Ex Taq （Probe qPCR）（2×） PCR Forward Primer（10 μM） PCR Reverse Primer（10 μM） 荧光探针溶液 ROX Reference Dye（50×）*4 DNA 模板 dH2O（灭菌蒸馏水） Total
8.5 μl
Total
25 μl
*1 通常引物终浓度为 0.2 μM 可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在 0.1～1.0 μM 范 围内调整引物浓度。
*2 使用的探针浓度，与使用的Real Time PCR扩增仪、探针种类、荧光标记物质种类有关，
试剂使用时请参照仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行。使用Thermal Cycler Dice® Real Time System时，通常探针终浓度在 0.1～0.5 μM范围内进行调整。 *3 在 25 μl 反应体系中，DNA 模板的添加量通常在 100 ng 以下。因不同种类的 DNA 模板
2
◆ 应用 Thermal Cycler Dice Real Time System 扩增仪的操作方法
2
◆ 应用 ABI PRISM 7000/7700/7300 Real-Time PCR System，
StepOnePlus Real-Time PCR System的操作方法
4
◆ 应用 ABI PRISM 7500/7500 Fast Real-Time PCR System 的操作方法
两步法 PCR 扩增标准程序：
Stage 1：预变性 Repeat：1 95℃ 30 秒
Stage 2：PCR 反应 Repeat：40 95℃ 5 秒 60℃ 30 秒
◆ 特别提示： 本制品中使用的 TaKaRa Ex Taq HS 是利用抗 Taq 抗体的 Hot Start 用 DNA 聚合酶，与其他公司的 化学修饰型 Hot Start 用 DNA 聚合酶相比，不需要 PCR 反应前的 95℃、5～15 分钟的酶的活性化反 应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其 PCR 的扩增效率、定量精度等都会受到影响。 如果在 PCR 反应前进行模板的预变性，通常设定为 95℃、探针法
TaqMan 探针法是使用 5’端带有荧光物质（如：FAM 等），3’端带有淬灭物质（如：TAMRA 等）的 TaqMan 探针进行荧光检测的方法。当探针完整时，5’端的荧 光物质受到 3’端淬灭物质的制约，不能发出荧光。 而当 TaqMan 探针被分解后，5’端的荧光物质便会 游离出来，发出荧光。 当 PCR 反应液中加入荧光探针后，在 PCR 反应的 退火过程中，荧光探针便会和模板杂交。进一步在 PCR 反应的延伸过程中，Taq DNA 聚合酶的 5’→ 3’Exonuclease 活性可以分解与模板杂交的荧光探 针，游离荧光物质发出荧光。通过检测反应体系中 的荧光强度，可以达到检测 PCR 产物扩增量的目 的。具体原理见右图。
5
◆ 应用 LightCycler Real Time PCR 扩增仪的操作方法
7
◆ 应用 Smart Cycler II System Real Time PCR 扩增仪的操作方法
8
● PCR 反应条件说明
9
● 进行 RT-PCR 反应时的实验方法
9
● 引物设计说明
10
● 特别提示：本公司提供用于基因表达定量分析的引物设计及合成服务
模板进行 PCR 反应时，由于 cDNA 中残存 mRNA 对 PCR 反应造成的阻害作用。
● 操作注意
以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。 1 . 使用制品时，请上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，并经轻微离心后使用。试剂没有混匀时反应性能会
有所下降，本制品不能用振荡器混匀。Premix Ex Taq（2×Conc.）于-20℃保存时容易形成沉淀，此时， 轻轻用手握一会儿或室温放置一段时间后，颠倒混匀可以完全融解。 2 . 溶解后的试剂请于冰上放置。 3 . 本制品中不含有荧光探针等。 4 . 反应液的配制、分装请一定使用新的（无污染的）枪头、Microtube 等，尽量避免污染。
● 保 存：
4℃保存。可在-20℃长期保存，一旦融解请于 4℃保存。反复冻融制品性能可能下降，请避免多次反复冻融 制品。
● 试剂盒原理
进行 PCR 扩增时，在 PCR 反应液中加入荧光探针，然后在 PCR 扩增过程中，通过检测 PCR 反应液中的 荧光强度，可以达到监测 PCR 产物扩增量的目的。 本制品中的 DNA 聚合酶使用了改良后的 TaKaRa Ex Taq HS，并结合 Takara 独自开发的 Buffer 系统，可 以有效抑制非特异性 PCR 扩增，大大提高 PCR 扩增灵敏度。
drr390apremixextaqpremixextaqtmprobeqpcrprobeqpcr200次量tm宝生物工程宝生物工程大连大连有限公司有限公司说明书说明书目目录录内内容容页页码码制品说明制品说明11制品内容制品内容适用的适用的realtimepcrrealtimepcr扩增仪保保存存111111扩增仪试剂盒原理试剂盒原理试剂盒特长试剂盒特长操作注意操作注意112222操作方法操作方法2222应用应用thermalcyclerdicerealtimethermalcyclerdicerealtimesystemsystem扩增仪的操作方法扩增仪的操作方法应用应用abiprismabiprism70007700700077007300real7300realtimepcrsystemtimepcrsystemsteponeplussteponeplusrealrealtimepcrsystemtimepcrsystem的操作方法的操作方法44557788999910101111应用应用abiprism75007500abiprism75007500fastrealfastrealtimepcrsystemtimepcrsystem的操作方法的操作方法应用应用lightcyclelightcyclerrrealtimepcrrealtimepcr扩增仪的操作方法扩增仪的操作方法应用pcrpcr反应条件说明反应条件说明进行进行rtrtpcr引物设计说明引物设计说明特别提示