鸡抗血清3型鸭甲型肝炎血清的制备与初步应用

鸡抗血清3型鸭甲型肝炎血清的制备与初步应用
报告如下：
1 材料
1.1 病毒DHAV-3致弱疫苗毒（B54株）、DHAV-1（ATCC株）、鸭瘟疫苗株病毒（DPV），由武汉中博生物股份有限公司保存。

1.2 抗体ELISA检测试剂盒禽流感病毒（AIV）抗体、传染性支气管炎病毒（IBV）抗体、鸡新城疫病毒（NDV）抗体、传染性喉气管炎病毒（ILTV）抗体、禽传染性法氏囊病毒（IBDV）抗体、鸡贫血病毒（CAV）抗体、禽白血病病毒（ALV）抗体、禽脑脊髓炎病毒（AEV）抗体、禽呼肠孤病毒（REO）、网状内皮组织增殖病毒（REV）抗体检测试验盒，均购自北京IEDXX公司。

1.3 检测用抗原和抗体减蛋综合征病毒（EDS76）HA抗原，DHAV-1和DHAV-3鸭阳性血清及阴性血清均由武汉中博生物股份有限公司制备、鉴定和保存。

1.4 培养基无菌检验培养基：硫乙醇酸盐培养基（T.G），酪胨琼脂培养基（G.A），葡萄糖蛋白栋培养基（G.P）；支原体培养基：改良Frey氏固体和液体培养基，均购自北京海淀中海动物保健科技公司。

1.5 试验动物SPF鸡3周龄，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；SPF鸭种蛋购自哈尔滨兽医研究所实验动物中心；10日龄鸭胚和易感雏鸭，均购自武汉市畜牧兽医科学研究所；10日龄SPF鸡胚，用购自济南斯帕法斯家禽有限公司SPF种蛋进行自孵。

2 方法
2.1 抗血清的制备
2.1.1 免疫原的制备与纯化将DHAV-3 B54株种毒1：1000倍稀释，尿囊腔接种10日龄SPF鸭胚，每胚0.1ml，置于37℃孵化箱继续孵化，不必翻蛋。

收集36～96h死亡鸭胚，无菌收集尿囊液。

纯化方法为：将收获的尿囊液装入透析袋，用PEG20000进行包埋浓缩处理，待体积浓缩至原体积的1/50时，10000r/min离心60min，取上清液，再在同样条件下45000r/min离心150min，弃去上清，再加入等体积灭菌PBS，悬浮沉淀物，-20℃冻存备用[8]。

2.1.2 免疫及采血将浓缩后的DHAV-3经肌肉注射途径接种3周龄SPF鸡10只，0.5ml/只，隔离器中饲养。

14日后加强免疫一次，加强免疫后28日，经心脏无菌采血，分离血清[9]。

2.2 细菌与霉菌检测按现行《中国兽药典》附录第42页进行，将制备的混合血清分别接种T.G小管及G.A斜面各2支，每只0.2ml，分别各一支置37℃和25℃，另取0.2ml接种G.P小管，置25℃，均培养7d，观察有无细菌和霉菌生长。

2.3 支原体检验按现行《中国兽药典》附录49页进行检测，将制备的混合血清取0.2ml 移植接种于1小管液体培养基中，将小瓶与小管置37℃培养，同时设滑液支原体和灭菌生理盐水作阳性和阴性对照。

分别于接种后5、10、15日进行移植培养，观察14日。

在上述每次液体培养物移植小管培养的同时，取培养物0.2ml接种于支原体琼脂平板固体培养基，置含5%～10%CO2潮湿的环境，37℃培养14日，观察结果。

2.4 特异性检测
2.4.1 中和试验将制备血清于56℃水浴灭活30min，分别与DHAV-1、DHAV-3及DPV （100ELD50）等量混合。

37℃感作1h，感作后的DHAV-1和DHAV-3分别经尿囊腔接种5枚10日龄鸭胚；感作后的DPV经绒毛尿囊膜接种5枚10日龄SPF鸡胚，每胚0.2ml，连续观察7日，记录胚死亡情况。

2.4.2 ELISA检测应用ELISA法检测AIV抗体、NDV抗体、IBV抗体、ILTV抗体、IBDV 抗体、CAV抗体、AEV 抗体、REO抗体、REV抗体、ALV抗体。

具体操作方法参见IDEXX 产品说明书。

2.4.3 HI方法检测应用HI方法检测所制备的抗血清中EDS76病毒抗体，具体操作方法参考现行《中国兽药典》附录第11页进行检测。

2.5 中和效价的测定采用固定病毒-稀释血清法。

将待检血清、阳性血清和阴性血清置于56℃ 水浴中灭活30min；用灭菌PBS进行2倍系列稀释。

将3型鸭肝炎病毒（B54株）稀释至200ELD50/0.1ml，分别与等量的不同稀释度的待检血清、阳性血清和阴性血清相混合。

37℃感作1h。

将感作好的混合液，每个稀释度经尿囊腔接种SPF鸭胚5枚，每胚接种0.2ml，同时设置5枚鸭胚接种灭菌PBS作为空白对照，接种后封闭针孔，置37℃继续孵育，每天照蛋检查鸭胚情况，连续观察7d，记录鸭胚死亡数量，按Reed-Muench法计算中和抗体效价。

2.6 治疗试验选择1日龄樱桃谷雏鸭60只，平均分成2组，第1组为ATCC攻毒试验组，第2组为DHAV-3 G攻毒试验组。

各试验组又平均分成攻毒对照小组和治疗小组，各小组15只雏鸭分别隔离饲养，于7日龄攻毒，攻毒剂量均为10
3.0LD50/0.5ml，当攻毒后各试验组雏鸭出现发病症状后，立即对各治疗小组雏鸭腿部肌肉注射0.5ml抗血清。

连续观察7日，统计雏鸭死亡情况。

3 结果
3.1 细菌、霉菌与支原体检测按照现行《中国兽药典》附录42页和49页进行无菌和支原体检验，结果表明所制备的血清无细菌、霉菌和支原体生长。

3.2 特异性
3.2.1 中和试验抗血清与DHAV-3感作后，接种的5枚鸭胚，连续观察7日均未出现死亡，而鸭瘟病毒和1型鸭肝炎病毒抗血清感作组，两组接种的胚在120h内全部死亡。

说明所制备的血清对DHAV-1和DPV无中和作用，是抗DHAV-3特异性血清。

3.2.2 ELISA检测使用IDEXX ELISA抗体检测试剂盒，分别对AIV、NDV、IBV、ILTV、IBDV、CAV、AEV、REO、REV、ALV抗体进行检测，检测结果均为阴性。

3.2.3 HI方法检测使用HI方法检测抗血清中EDS76病毒抗体，检测结果也为阴性。

3.3 中和效价测定结果阳性血清对照和空白对照鸭胚全部健活，而阴性血清对照全部死亡。

阳性和阴性血清平行试验成立，按Reed-Muench法计算所制备的抗血清中和效价为10-2.8，表明该血清在1：632稀释时可保护50%的接毒鸭胚免于死亡，见表1。

3.4 治疗试验将隔离饲养的7日龄雏鸭进行攻毒，24h前各小组均无发病死亡现象。

在攻毒后26h，当DHAV-3 G株攻毒对照组第一例雏鸭出现发病症状时，对两治疗组鸭腿部肌肉注射0.5ml抗血清，观察7日，DHAV-1 ATCC株和DHAV-3 G株攻毒对照组分别出现86.7%和80%的死亡率，表明攻毒对照成立。

出现发病雏鸭后紧急注射抗血清，对DHAV-1 ATCC株和DHAV-3 G株攻毒保护率分别为15.38和91.67，见表2。

4 讨论
本试验中使用的免疫原是经过纯化的尿囊液病毒，没有使用胚组织毒是因为其含有大量宿主杂蛋白，不仅会影响所制备的抗血清效价，而且还会影响在免疫酶技术中的使用效果。

对于鸭肝炎病毒，虽然尿囊液中的病毒含量（滴度）较低，但是其它杂蛋白相对于胚组织量少，便于病毒抗原的纯化与浓缩。

关于抗血清治疗试验，抗血清的使用时机非常重要，一般在发病后24h内使用，效果比较明显。

由于鸭肝炎发病急促，一旦出现发病症状后，几小时内就会死亡，对病死雏鸭进行解剖，可发现肝脏肿大、有明显的出血点或出血斑，脑部也出现水肿，故当观察到症状后再用
血清治疗，很难奏效。

我们根据多次两株强毒的攻毒试验研究，该毒株的攻毒剂量控制在一定范围内，一般均在攻毒24h后出现发病死亡，死亡高峰出现在32～48h。

另外鸭肝炎病毒传染能力极强，同群感染率高，所以对抗血清治疗效果评价，以攻毒后抗血清的保护率为标准，即（对照组死亡率-治疗组死亡率）/对照组死亡率，为使试验结果更加确切，把抗血清使用时机定为攻毒后第一只雏鸭发病以后，以使抗血清治疗效果更加接近实际应用。

本试验表明，制备的DHAV-3血清对DHAV-1基本无保护作用，这与鸭胚血清中和试验具有一致性，故在临床生产中，对易感雏鸭无论是免疫还是抗血清治疗，要与流行发病的病株血清血清型一致才有保护效果。

参考文献：
[1] Anchun C，Mingshu W，Hongyi X，et al. Development and application of a reverse transcriptase polymerase chain reaction to detect Chinese isolates of duck hepatitis virus type 1[J].J Microbiol Methods，2009，77（3）：332-336.
[2] Fauquet C M，Mayo A，Maniloff J，ea al. Virus Taxonomy[M].Eighth Report of International Committee on T axonomy of Viruses，Calif：Elsevier Academic Press，2005：757-778
[3] 刘建，苏敬良，张克新，等.新型鸭肝炎病毒流行病学调查及免疫防治试验[J].中国兽医杂志，2006，42（2）：3-6.
[4] 马秀丽，赵立娜，夏雪梅，等.一株韩国新型DHV的分离及RT-PCR鉴定[J].浙江农业学报，2010，22（5）：596-598.
[5] Wang L，Pan M，Fu Y，et al. Classification of duck hepatitis virus into three genotypes based on molecular evolutionary analysis[J]. Virus Genes，2008，37（1）：52-59.
[6] Tseng C H，Tsai H J. Molecular characterization of a new serotype of duck hepatitis virus[J]. Virus Res，2007，126（1-2）：19-31.
[7] 苏敬良，黄瑜，贺荣莲，等. 新型鸭肝炎病毒的分离及初步鉴定[J].中国兽医科技，2002，32（1）：15-16.
[8] 胡燕宾.鸭肝炎病毒（DHV-1）的纯化及结构蛋白分析[D].重庆：西南大学，2007.
[9] 李俊平，杨承槐，李启红，等.鸡抗REV血清的制备与检定[J].中国兽药杂志，2011（09）：15-18.
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