特异性亲和吸附法纯化冬小麦麸皮抗冻蛋白

万方数据
第２４卷第８期张超等特异性亲和吸附法纯化冬小麦麸皮抗冻蛋白１３
阳性组）作为对照。

１．４样品表面疏水性的测定
样品表面疏水性采用ＡＮＳ法测定［１０—１Ｉ。

将样品溶解于１０ｍｉｍｌ／ＬＰＢＳ（ｐＨ８．０）。

取２ｍＬ样品（１ｍｇ／ｍＬ），加入４０止浓度为８．０ｍｍｏｌ／ＬＡＮＳ荧光扫描，激发波长为３７５啪，发射波长扫描范围４１０—５６０ｎＩｎｏ
１．５差热分析法测定样品ＴＨＡ
采用ＤＳＣ测定样品热滞活性（ＴｈｅｒｍａｌＨｙｓｔｅｒｅｓｉｓＡｃｔｉｖｉｔｙ，ＴＨＡ）。

将１０ｐｉｇ样品密封于铝制坩埚中，放置在样品池中央，降温至一３０℃，然后升温至２５℃，再降温至一３０℃。

接着，缓慢升温至样品体系为固液混合物状态，称为保留温度（Ｔｈ），停留２ｍｉｎ，再将温度从Ｔｈ降低至一３０℃，重复上述过程，在不同的Ｔｈ下停留２ｍｉｎ。

记录不同Ｔｈ下，样品结晶的起始温度（Ｔｏ），上述过程中升降温的速率均为１．０。

Ｃ／ｍｉｎ。

ＴＨＡ参照公式（１）计算。

１１ｔ４＝ｒｈ—Ｔｏ（１）１．６特异性亲和吸附法
特异性亲和吸附参照Ｋｕｉｐｅｒ等【１２Ｊ的试验方法，并进行改良（图１）。

金手指为不锈钢棒，直径０．５ｅｎｌ，长度２０ｃｍ。

将金手指置于３０ｍＬ试管中，加人１０ｍＬ双蒸水，采用可控温冰箱将体系温度从一１℃缓慢的降至一４℃，时间２ｈ，冻结。

同时，将１００ＩＩ群品溶解于９０ｍＬ１０ｍｍｏｌ／ＬＰＢＳ（ｐＨ８．ｏ），３５００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｍｉｌｌ，上清液磁力搅拌器缓慢搅拌，当溶液上清液温度达到一４℃时，将金手指浸入上清液，并继续缓慢搅拌。

控制体系温度从一４℃下降至一６℃，时间７ｈ。

此时冰晶体积大约为上清液体积的４０％，取出金手指，并用预冷的双蒸水１０～２０ｍＬ（＜０ｏＣ）将其表面液体组分冲入烧杯。

烧杯中未冻结的溶液称为液体组分，冻结的冰晶称为冰晶组分。

冰晶组分在２℃的环境中溶解，冻干。

Ａ—Ｃ：金手指在一ｌ一一４℃之间形成，时间２ｈ；Ｃ：金手指；Ｄ—Ｆ：ＡＦＰ的特异亲和吸附过程，一４一一６ｏＣ，７ｈ；Ｇ：冰晶组分溶解，２℃。

底部标签分别显示了冷冻的时间和温度。

闺ｌ特异性亲和吸附ＡＦＰ的示意图
１．７特异性亲和吸附法测定样品的分配系数分配系数（８）是溶液冻结过程中，样品在水相和冰相的分布情况，反映样品的亲冰能力。

艿采用特异性亲和吸附法测定（公式２）。

占：士（２）
ｍ，＋ｍＬ
其中，艿为分配系数；ｍ，为冰晶组分蛋白质的质量／ｍｇ；ｍＬ为液体组分蛋白质的质量／ｒａｇ。

１．８ＴａＡＦＰ的特异性亲和吸附方法
将１００ｇ冬小麦麸皮与５００ｍＬ１０ｍｍｏｌ／ＬＰＢＳ（ｐＨ８．０）搅拌４ｈ，３０００ｒ／ｍｉｎ下离心３０ｍｉｎ，上清液采用特异性亲和吸附法纯化（图１）。

特异性亲和吸附进行两个循环（Ｒｏｕｎｄｌ和Ｒｏｕｎｄ２）。

具体来说，将Ｒｏｕｎｄ１获得的冰晶组分再作为原料，进行Ｒｏｕｎｄ２吸附，合并Ｒｏｕｎｄ１和Ｒｏｕｎｄ２的液体组分，冻干，称量。

将Ｒｏｕｎｄ２的冰晶组分采用ＨＰＬＣ分离。

该冰晶组分复溶于１０ｍｍｏＬ／ＬＰＢＳ（ｐＨ８．０），约蛋白含量１ｍｇ／ｍＬ，并取样５皿进行色谱分离，色谱柱采用相同的ＰＢＳ，在０～０．３ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣｌ梯度下按１．０ｍＬ／ｍｉｎ的流速洗脱３０ｒａｉｎ，检测波长２２０ｎｎｌ。

１．９电泳
ｓＤＳ—ＰＡＧＥ按本课题组已报道的方法进行Ｌ４Ｊ。

２结果与讨论
２．１ＴａＡＦＰ的亲水能力
采用ＴＧＡ来度量ＴａＡＦＰ亲水能力的原因在于加热过程中，样品中的水会蒸发，蒸发过程主要由两个因素控制，一个是环境的温度、湿度、气压等因素；另一个是样品对水的束缚力，束缚力强，则水蒸发速度慢，反之亦然。

当环境因素保持一致时，溶质对水的束缚力就变成了影响水蒸发的主要因素，而溶质对水的束缚力即反映样品的亲水能力【７－８Ｊ。

图２显示了纯水、ＢＳＡ、ＤｃＡＦＰ和ＴａＡＦＰ的ＴＧＡ和ＳＤＴＡ曲线。

ＢＳＡ、ＤｃＡＦＰ和ＴａＡＦＰ的浓度均为１０％（质量分数），即样品重量损失为９０％时的温度，是水分完全蒸发时的温度。

从图２可以看出，纯水、ＢＳＡ、ＤｃＡＦＰ和ＴａＡＦＰ在失重９０％时的温度分别为１４８、１６８、１７８和１８０℃。

ＤｃＡＦＰ和ＴａＡＦＰ失重９０％时的温度明显高于纯水和ＢＳＡ失重９０％时的温度，即ＤｃＡＦＰ和ＴａＡＦＰ中的水需要更高的温度才可以完全蒸发，ＢＳＡ为一种常用的蛋白，没有特别强的亲水性或疏水性，而ＤｃＡＦＰ具有很强的亲水性［４—５·７ｔ１３—１４｜。

而结果显示ＤｃＡＦＰ和ＴａＡＦＰ的ＴＧＡ
曲线更加相似，具有较强亲水性。

同时，ＳＤＴＡ曲线　万方数据
１４中国粮油学报２００９年第８期
显示纯水、ＢＳＡ、ＤｃＡＦＰ和ＴａＡＦＰ水分蒸发结束的温度分别为１９５、２０６、２１８和２２０ｏＣ，即ＤｃＡＦＰ和ＴａＡＦＰ中的水需要更高温度才完全蒸发，具有较强的亲水能力，与ＴＧＡ曲线获得结论相互吻合。

０５ｌＯ１５２０ｍｉｌｌ
图２ＴａＡＦＰ亲水能力检验
２．２ＴａＡＦＰ的疏水能力
ＴａＡＦＰ表面疏水性的荧光扫描图谱见图３。

图谱显示ＴａＡＦＰ的疏水性比ＢＳＡ的弱，而与ＤｃＡＦＰ的相似。

所以，ＴａＡＦＰ具有较强亲水性，与ＤｃＡＦＰ或其它ＡＦＰ相似［１ｌ’１５。

１７｜。

该结论与ｒＩＧＡ检测结果相互吻合。

ｊ型
擎
螫
４１０４４０４７０５００５３０５６０
波长／ｒｉｍ
图３ＢＳＡ、ＤｃＡＦＰ和死Ａ即表面疏水性荧光扫描图谱系中可结晶水的含量［４·９１。

而ＴａＡＦＰ的亲水性在统计学上与ＤｃＡＦＰ相似，进一步佐证ＴａＡＦＰ具有很强的亲水性。

裹１ＴａＡＦＰ在冰晶相和液相的分配系数
注：Ｎｄ未测定；表中的数据为平均值土标准偏差（ｎ≥３），在Ｉ司一列中，不同的字母显示数据之间的显著性差异（Ｐ＜Ｏ．０５）
２．４ＴａＡＦＰ的特异性亲和吸附
经过特异性亲和吸附，ＴａＡＦＰ最终被纯化３４０倍达到电泳纯，产率为１．６４％（以粗分离样品中蛋白质的质量计，质量分数）（表２）。

该产率略高于传统的分离纯化方法［６ｆ，但分离步骤少，效率高，并可以广泛地应用于搜寻和纯化未知的ＡＦＰ。

表２死ＡＦＰ特异性亲和吸附试验数据
与传统分离方法相比【６ｊ，ＴａＡＦＰ特异性亲和吸附法将五步缩短为三步，主要原因在于：（１）粗提取和特异性亲和吸附分别充分利用了ＴａＡＦＰ的亲水性和亲冰性特点，纯化倍数达到２７０，针对性更强；（２）采用两个循环的特异性亲和吸附效果显著，ＴａＡＦＰ达到电泳纯（图４）。

２．３死ＡＦＰ的分配系数
表１显示当体系部分结晶后，大于９０％（质量分
数）的ＢＳＡ都存在于液相；与之相反，大于９０％（质量
分数）的ＤｃＡＦＰ和ＴａＡＦＰ都结合于冰晶相，验证了
眈ＡＦＰ和死ＡＦＰ作为—岍，都具有较强的亲冰能力。

Ｒ二曩姜戮毒蓦篓黧墨黼善淼姜
这也是采用特异亲和吸附ＴａＡＦＰ的理论基础。

另一得的仡册。

方面，ＤｃＡＦＰ具有很强的亲水性，可以有效地控制体图４特异性亲和吸附ＴａＡＦＰ分离过程的ｓＤｓ—ＰＡＧＥ分析　万方数据
　万方数据
　万方数据
特异性亲和吸附法纯化冬小麦麸皮抗冻蛋白
作者：张超， 赵晓燕， 马越， 张晖， 李冀新， 姚惠源， Zhang Chao， Zhao Xiaoyan， Ma Yue， Zhang Hui， Li Jixin， Yao Huiyuan
作者单位：张超,Zhang Chao(国家蔬菜工程技术研究中心,北京市农林科学院,北京,100097;江南大学,食品科学与工程国家重点实验室,无锡,214122)， 赵晓燕,马越,Zhao Xiaoyan,Ma Yue(国
家蔬菜工程技术研究中心,北京市农林科学院,北京,100097)， 张晖,姚惠源,Zhang Hui,Yao
Huiyuan(江南大学,食品科学与工程国家重点实验室,无锡,214122)， 李冀新,Li Jixin(新
疆农垦科学院特产研究所,石河子,832000)
刊名：
中国粮油学报
英文刊名：JOURNAL OF THE CHINESE CEREALS AND OILS ASSOCIATION
年，卷(期)：2009,24(8)
1.Mizuno A;Mitsuiki M;Toba S Antifreeze activities of various food components[外文期刊] 1997(01)
2.Grandum S;Nakagomi K Characteristics of ice slurry containing antifreeze protein for ice storage applications 1997(03)
3.Payne S R;Young O A Effects of pre-slanghter administration of antifreeze proteins on frozen meat quality 1995(02)
4.Zhang C;Zhang H;Wang L Effect of carrot (Daucus carota) antifreeze proteins on the fermentation capacity of frozen dough[外文期刊] 2007(6)
5.Zhang C;Zhang H;Wang L Effect of carrot (Daucus carota) antifreeze proteins on texture properties of frozen dough and volatile compounds of crumb 2008(06)
6.张超;赵晓燕;马越冬小麦麸皮抗冻蛋白的筛选及其分离纯化[期刊论文]-中国粮油学报 2009(05)
7.Zhang C;Zhang H;Wang L Validation of antifreeze properties of glutathione based on its thermodynamic characteristics and Baker's Yeast protective ability during cryopreseration[外文期刊] 2007(12)
8.Wilson P W A model for thermal hysteresis utilizing the anisotropic interracial energy of ice crystals 1994(04)
9.Meyer K;Keil M;Naldrett M J A leucinc-rich repeat protein of carrot that exhibits antifreeze activity[外文期刊] 1999(2-3)
10.Alizakeh-Pasdar N;Eunice C Y;Li C Comparison of protein surface hydrophobicity measured at various pHvalues using three different fluorescent probe 2000
11.Kato A;Nakai S Hydrophobicity deter mined by a fluorescence probe method and its correlation with surface properties of proteins 1980
12.Kuiper M J;Lankin C;Gauthier S Y Purification of antifreeze proteins by adsorption to ice[外文期刊] 2003(03)
13.Smallwood M;Worrall D;Byass L Isolation and characterization of a novel antifreeze protein from carrot (Daucus carota)[外文期刊] 1999(part 2)
14.Worrall D;Elias L;Ashford D A carrot leueinc-richrepeat protein that inhibits ice
recrystallization[外文期刊] 1998(5386)
15.Daley M E;Graether S P;Sykes B D Hydrogen bonding on the ice-binding face of a beta-helical。