完整版)宏基因组测序讲解

完整版)宏基因组测序讲解
宏基因组测序的目的是研究藻类物种的分类、与特定环境相关的代谢通路，以及通过不同样品的比较研究微生物内部、微生物与环境以及与宿主的关系。

宏基因组，也称为微生物环境基因组或元基因组，是由Handelsman等于1998年提出的新名词。

它包含了可培养的和未可培养的微生物的基因，主要指环境样品中的细菌和真菌的基因组总和。

宏基因组学是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对象的微生物研究方法。

它通过功能基因筛选和/或测序分析为研究手段，以微生物多
样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系以及与环境之间的关系为研究目的。

一般XXX包括从环境样品中提
取基因组DNA，进行高通量测序分析，或克隆DNA到合适
的载体，导入宿主菌体，筛选目的转化子等工作。

宏基因组文库是一种重要的研究工具，可以利用转入大肠杆菌中的宏基因组DNA载体，使以前无法研究的不可培养微
生物的DNA得到复制、表达，从而进行研究。

所有带有宏基
因组DNA载体的模式微生物克隆构成宏基因组文库。

对于宏
基因组文库的DNA进行分析，有很多分析方法，主要分为表
型功能筛选和序列基因型分析两类。

表型功能筛选是利用模式
微生物表型的变化筛选某些目的基因，例如从文库中筛选能表达抗菌物质的克隆。

而序列基因型分析则是对文库中所有或部分的DNA进行测序分析，以应用于生态学研究，例如分析文
库中16SrRNA序列，对所研究生态环境的多样性进行评估。

一个典型的宏基因组分析涉及多个轮次，以确保从生态环境标本中分离到目的基因，并尽可能多地分析DNA序列所编码的
信息。

XXX是一种以环境样品中的微生物群体基因组为研究对
象的新的微生物研究方法。

它主要通过功能基因筛选和测序分析来研究微生物多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系。

在宏基因组学研究中，样品总DNA的提取及基因或基因组DNA的富集是非常关键的步骤。

提取的样品DNA必须可以代表特定环境中微生物的种类，获得高质量环境样品中的总DNA是宏基因组文库构建的关键
之一。

因此，应选择合适的方法，既要尽可能地完全抽提出环境样品中的DNA，又要保持较大的片段以获得完整的目的基
因或基因簇。

同时，应严格操作，谨防污染，并且保持DNA
片段的完整和纯度。

目前已有许多商品化宏基因组DNA提取
试剂盒可用，同时也有很多实验室致力于宏基因组DNA提取方法的改进。

为了提高阳性克隆的占有率，需要对感兴趣的基因或基因组进行富集。

稳定同位素示踪技术是较好的富集方法之一。

另外，抑制性消减杂交技术是一项非常有用的技术方法，可以富集特定基因，并证实微生物之间基因的不同。

宏基因组文库的构建策略取决于研究的整体目标。

在选择克隆载体和宿主菌株时，需要考虑转化效率、宏基因的表达、重组载体在宿主细胞中的稳定性以及目标性状的筛选等因素。

大肠杆菌是最常用的宿主菌株，但不同微生物种类所产生的活性物质有明显差异，因此需要选择不同的宿主菌株。

在宏基因组文库的筛选过程中，需要注意选择合适的筛选方法和条件，以提高阳性克隆的占有率。

具体筛选方法和条件的选择应根据研究的目的和样品的特点进行。

功能性筛选法是一种基于活性测定的筛选方法，通过建立和优化合适的方法从基因组文库中获得具有特殊功能的克隆。

这种筛选方法不需要已知序列的信息，能够快速找到可用于工农业和医药的蛋白质和天然产物。

功能性筛选的方法有两种，
一种是直接检测具有特殊功能的克隆子，另一种是基于异源基因的宿主菌株与其突变体在选择性条件下功能互补生长的特性进行。

虽然功能性筛选法的筛选过程比较简单、快速，但是这种筛选方法依赖于目的基因在新的宿主中表达。

使用模式微生物并不能把所有的宏基因组DNA表达出来，而且要求克隆到基因或基因簇的全长。

一旦克隆过程中破坏基因某个组件将使得基因没法表达，也就不能根据功能进行筛选，故检出的概率很低，工作量大，往往从上万个克隆中只能筛选到几个有用的克隆。

底物诱导基因表达筛选(SIGEX)是一种用于能利用各种底物诱导的分解代谢型基因的检出，并结合生物发光技术用来筛选代谢相关基因及酶基因的方法。

通常，编码相关代谢基因或酶基因呈簇存在，与该物质诱导的启动子和同源转录调控序列毗邻，往往在有底物诱导的条件下才表达，反之则不表达。

首先构建一个含有绿色荧光蛋白(GFP)的表达载体，将宏基因组DNA克隆到GFP基因上游，使该基因的表达受到宏基因组DNA片段中的启动子调控。

当外加目标底物时，可以影响
GFP的表达，通过活细胞荧光分离技术(fluorescence activated cell sorting。

FACS)，在添加特定底物的条件下对表达库进行
筛选，就能够得到对该底物具有代谢活性的克隆。

SIGEX法在XXX研究中有很多优势。

它提供了一个有效的、经济的检测手段，增加了筛选的容量和效率，节省了时间，为高通量筛选提供了保障。

此外，使用SIGEX法不需要对在
颜色筛选中使用的底物进行修改，也不用担心因修改底物而产生毒性。

SIGEX法还可以从底物中推断出未知的酶，进而推
断基因的功能。

然而，SIGEX法的不足之处是目标基因的结
构性和适应性很敏感，同时无法用于分析不能进入细胞质的底物。

此外，FACS对进样设备的要求也比较高。

代谢特定底物
的调控子和操纵子在位置上不一定都相邻。

同时，有些基因的表达除了受底物诱导外，还可能受其他因子的诱导，而有些基因并不需要诱导，是本底水平表达的。

有些可诱导基因在新的宿主中有可能不可被诱导表达。

但是考虑到宏基因组文库中含有大量的基因，其中必然有一部分是可诱导的，是可以被该技术检测到的。

只要对这些不足之处进行优化，选择合适的条件，SIGEX法仍然是一种宏基因组文库筛选的有效方法，尤其适
合于在工业上使用。

稳定同位素技术是一种利用稳定同位素来标记环境中的物质，以鉴定和分析复杂样本中进行有特殊代谢功能的微生物的方法。

稳定同位素具有相同原子序数但不同中子数目且不具放射性的特点。

该技术可以用于富集环境中某些活性微生物的核酸，进而构建宏基因组文库，更有利于寻找未培养微生物的功能基因。

荧光原位杂交技术是一种利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶DNA分子或RNA分子杂交的方法。

通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，可以确定与特异探针杂交后被染色的细胞。

FISH技术已经用于不同生态系统的研究中。

应用稳定同位素技术可以对环境中某些活性微生物的核酸进行富集，进而构建宏基因组文库，更有利于寻找未培养微生物的功能基因。

除了SIGEX法、稳定同位素技术和荧光原位杂交技术之外，常规的PCR、分子杂交、抗原抗体反应等技术也可以用于筛选。

在构建文库之前对样品有目的进行富集，然后提取样品DNA构建文库，可以提高目的克隆的数量。

此外，一些公
司还开发了专门筛选某些酶、蛋白等的试剂盒，在食品工业、医药等领域有较好的应用前景。

目前，XXX技术存在一个严重的问题，即文库表达问题。

模式微生物无法完全表达所有的宏基因组DNA，这降低了表
型筛选的效率。

因此，在上万个克隆中，只能筛选出几个有用的克隆，XXX表型筛选的效率非常低。

虽然XXX的提出带来了观念上的突破，但受限于技术瓶颈，还未在实际工作中产生理论上可能带来的巨大成果。

但我们有理由相信，随着分子生物学技术的发展，XXX研究必将成为今后若干年自然科学研
究的一个重要领域。