非小细胞肺癌组织中ERCC1基因的表达及临床意义

非小细胞肺癌组织中ERCC1基因的表达及临床意义
冷雪峰;冼磊;陈铭伍;李满红
【摘要】Objective To detect the expression of excision repair cross complement group 1( ERCC1 )gene mRNA in non-small cell lung cancer and study their clinical significance. Methods The expression of ERCC1 gene 82 cases of lung cancer,36 cases of adjacent tissues and 15 cases of benign tissue mRNA were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction( RT-PCR). Results ERCC1 gene in NSCLC patients with carcinoma, adjacent and benign tissues were expressed 54. g％( 45/82 ),44. 4％ ( 16/36 )and 73. 3 ％ ( 11/15 ) , respectively , there was no statistical significance among the three groups( P ＞ 0. 05 ). In the clinical and pathological features,63. 0％ expressed in
adenocarcinoma( 34/54 )weremore than that in squamous cell carcinoma 39. 3％( 11/28 ) , the difference was statistically significant( P ＜ 0. 05 ), and ERCCl gene did not significantly associated with other clinical and pathological features( P ＞ 0. 05 ). Conclusion The expression of ERCC1 gene mRNA in different tissues is not significant,but its expression of adenocarcinoma in the Guangxi population is more than squamous cell carcinoma patients,which may help guide individual platinum drug treatment.%目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)组织ERCC1基因mRNA表达情况及其临床意义.方法采用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测82例肺癌组织、36例癌旁组织及15例良性组织中ERCC1基因mRNA的表达情况.结果 ERCC1
基因在NSCLC患者癌、癌旁及良性组织中均有表达,分别为54.9%(45/82)、
44.4%(16/36)和73.3%(11/15),三者总体差异无统计学意义(P＞0.05).在临床、病理等特征中腺癌表达率63.0%(34/54)高于鳞癌39.3%(11/28),差异有统计学意义(P＜0.05).与其他临床及病理特征均无关联(P＞0.05).结论 ERCC1基因mRNA在不同组织中的表达无显著差异,但其在广西人群中腺癌表达高于鳞癌,可指导患者术后铂类药物的个体化治疗.
【期刊名称】《广西医学》
【年(卷),期】2011(033)005
【总页数】4页(P540-543)
【关键词】非小细胞肺癌;ERCC1基因;反转录-聚合酶链反应
【作者】冷雪峰;冼磊;陈铭伍;李满红
【作者单位】广西医科大学第一附属医院心胸外科,南宁市,530021;广西医科大学第一附属医院心胸外科,南宁市,530021;广西医科大学第一附属医院心胸外科,南宁市,530021;广西医科大学第一附属医院心胸外科,南宁市,530021
【正文语种】中文
【中图分类】R734.2
肺癌是常见的恶性肿瘤之一,其发病率高居不下。

我国近 20年肺癌发病率以每年约11%的速度递增。

20世纪90年代总患病率达20.41/10万,其中80%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)[1-2]。

核苷酸切除修复交叉互补组
1(excision repair cross complement group 1,ERCC1)是核酸外切修复家族中的重要成员,参与 DNA链的切割和损伤识别。

ERCC1表达量直接影响DNA修复的
生理过程。

临床研究已证实,在非小细胞肺癌(NSCLC)化疗前检测ERCC1表达情况可以作为顺铂化疗疗效一个独立的预测指标[3]。

我们运用 RT-PCR方法,检测 82例NSCLC组织中ERCC1基因的表达情况,探讨其表达与患者病理特征等的关系,为今后肺癌个体化治疗及患者预后研究奠定基础。

1 资料与方法
1.1 临床资料广西医科大学第一附属医院心胸外科 2007年 8月至 2009年 5月手术切除并经病理确诊的非小细胞肺癌(NSCLC)82例(肺癌组)中,以癌组织外 5 cm 界定为癌旁组织,共有 36例,其余病例由于部分为楔形切除或因肿瘤组织过大,切取不了癌旁组织。

癌组织中,男 65例,女 17例;年龄 36～76 (55.3±9.95)岁;汉族49例,壮族33例;鳞癌28例,腺癌54例;其中高、中分化66例,低分化16例;有淋巴结转移的 23例,无转移 59例;根据根据国际抗癌联盟(internationalunion against cancer,UICC)2003标准进行TNM分期,Ⅰ+Ⅱ期55例,Ⅲ+Ⅳ期27例。

手术前患者均未接受过放疗或化疗等抗肿瘤治疗。

良性组织 15例为支气管扩张或肺大疱肺组织。

所有组织标本的取得均征求过患者及家属的同意并签知情同意书,术中取得后立即转移至 -80℃低温冰箱保存备用。

1.2 RT-PCR法检测所有组织均通过Trizol法提取总RNA(Trizol总RNA提取试剂由美国Invitrogen公司提供)。

将提取后的RNA在1%琼脂糖凝胶上加样电泳,凝胶数字成像系统(美国BIO-RAD)观察结果,出现28 S、18 S及5 S 3条带,并且28 S带的亮度是18 S带亮度的2倍,表明RNA未发生降解,其相对分子量分布正常。

筛选符合标准的总 RNA进行cDNA的反转录。

反转录试剂盒RevertAidTM First Strand cDNA购自美国Fermentas公司,反转录后的cDNA存放于 -20℃备用。

要检测的基因及内参的引物经过合理设计及NCBI上比对后,均由上海捷瑞公司合成。

ERCC1基因序列:Forward 5'-CCCTGGGAATTTGGCGACGTAA-
3';Reverse 5'-CTCCAGGTACCGCCCAGCTTCC-3'。

β-actin基因作为内
参:Forward 5'-CTCGCGTACTCTCTCTTTCTGG-3';Reverse 5'-GCTTACATGTCTCGATCCCACTTAA-3'。

PCR反应体系为25μl:模板1μl,上、下游引物各1μl,Takara Premix Ex Taq Version 2.0(Loading dye Mix)加
12μl,ddH2O 10μl补足至25μl。

经预变性94℃3min 30 s,变性94℃40 s,退火(不同基因不同温度)40 s,72℃延伸50 s,经过30个循环后,总延伸72℃5min,随后4℃保存或进行凝胶电泳。

1.3 结果观察取PCR反应产物各6μl均匀上样于含溴化乙啶的2%琼脂糖凝胶中,在0.5×TBE缓冲液里,120 V恒压30min,用β-actin作为内参检测反转录的效率,设置好阴性对照,Bio-Rad Gel Doc 2000凝胶成像系统来判断检测物的有无扩增所需基因的特异性片段,并拍照记录。

将各基因成功的预实验结果送至北京诺赛基因组研究中心测序,见图 1。

测序结果在NCBI中nucleotide blast中比对后完全符合要求。

进行大样本检测时步骤同上,凝胶成像系统观察后,拍照记录,并将已编号的试验结果随机抽样进行测序确认。

在标本对应的内参正常的前提下,有所需要扩增的目的条带表示结果阳性,没有的则为阴性表达。

1.4 统计学分析使用SPSS 17.0软件进行统计学处理,计数资料两样本率的比较采用四个表的χ2检验或Fisher确切概率法(Fisher's Exact Test),以P＜0.05为差异有统计学意义。

图1 ERCC1目的基因测序图
2 结果
2.1 ERCC1基因电泳结果在2%琼脂糖凝胶上以DNA Marker作为相对分子量标准对比所扩增的各基因PCR产物,β-actin为内参。

同时设置以不加模板的反应体系为阴性对照,排除基因组 DNA的污染。

出现所需特异性目的条带的为阳性表达,反之为阴性表达,见图2、图3。

图2 肺癌组织ERCC1基因RT-PCR琼脂糖电泳图
图3 肺癌癌旁及良性组织ERCC1基因RT-PCR琼脂糖电泳图
2.2 ERCC1表达与临床、病理等特征的关系 ERCC1基因在NSCLC患者癌与癌旁
组织中、良性组织中均有表达,其中癌组织中表达阳性率为54.9%(45/82),与对照
组癌旁组织44.4%(16/36)及良性组织73.3% (11/15)比较后总体差异无统计学意
义(P＞0.05)。

在82例肺癌组织中ERCC1的表达在性别、年龄、民族(汉族与壮族)、淋巴结有无转移、TNM分期(Ⅰ+Ⅱ期与Ⅲ+Ⅳ期)及分化程度(高、中分化与
低分化)中均无关联(P＞0.05)。

而腺癌表达率63.0%(34/54)高于鳞癌
39.3%(11/28)(P＜0.05),提示腺癌成为ERCC1 mRNA高表达的因素之一。

见表1。

表1 非小细胞肺癌中ERCC1表达与临床、病理等特征的关系指标n ERCC1(+)χ2值 P值性别男女65 17 35 10 0.135 0.713年龄(岁) ＜60≥60 49 33 26 19
0.162 0.687民族汉族壮族49 33 30 15 1.981 0.159组织学鳞状细胞癌腺癌28 54 11 34 4.175 0.041分化程度高中分化低分化66 16 37 8 0.191 0.662转移淋巴结有无23 59 14 31 0.463 0.496 TNM分期Ⅰ+Ⅱ期Ⅲ+Ⅳ期55 27 30 15
0.008 0.931
3 讨论
到目前为止,癌症的发生及其结果在癌症的评估控制中占有重要的地位。

约 1/3相
关癌症的死亡都与肺癌有关,肺癌每年所导致的死亡已经超过乳腺癌、前列腺癌及
结肠癌的总数。

Chen等[4]的一项关于中国肺癌流行病学趋势的研究结果显
示,2005年我国新增肺癌病例和死亡病例分别为 536 407和475 768例,其中男性多于女性;1988～2005年年均增长 1.63%。

随着对联合化疗分子机制的不断认识,近些年提出了个体化治疗,即针对不同的患者、不同的分子标记物改变来调整相应
的治疗策略。

ERCC1基因是第一个克隆而得的人类DNA损伤修复基因[5],位于19q13.2～
19q13.3,长 15 kb,含有10个外显子,转录后被加工成两个成熟mRNA(分别为1.0
kb和1.1 kb)。

只有1.1 kb mRNA编码的蛋白质(含297个氨基酸)才具有核苷酸切除修复功能。

本研究发现无论是癌组织、癌旁组织或良性组织中均有ERCC1的表达,并且以良性组织高达73.3%,说明ERCC1在维持组织修复功能中占有重要地位。

有研究表明无论内源性还是外源性致癌物带来的DNA损伤,DNA修复基因在修复损伤并维持基因组的稳定性过程中均发挥着重要作用[6]。

在肺癌中ERCC1高表达,往往导致癌细胞对铂类制剂耐药从而导致化疗失败,进而影响生存[7-8]。

本组NSCLC患者若ERCC1表达阳性在术后继续进行铂类化疗不一定使患者受益。

铂
类药物通过形成铂-DNA加合物损伤DNA,从而导致细胞死亡。

ERCC1切除损伤
的DNA片段,损伤后的DNA如果能够及时修复则会对铂类药物耐药[9-10]。

基于其重要功能,对 ERCC1基因的研究从未间断过,对于临床前期铂类化疗耐药相关研
究指出,ERCC1基因低表达的患者明显受益于化疗的辅助治疗[11]。

肖永营等[12]
研究显示 ERCC1低表达组NSCLC患者的总生存时间、肿瘤进展时间及化疗反应
率均高于ERCC1高表达组。

在我们的研究中,除了腺癌中表达高于鳞癌外,癌组织、癌旁组织与良性组织在临床、病理等特征中ERCC1的表达均无统计学意义(P＞
0.05),并且国内外的很多研究中其表达情况存在多样化,试剂、电泳及人工操作的差异性可能是导致结果多样化的部分原因之一。

多数学者发现在腺癌中ERCC1的表达高于鳞癌,这说明ERCC1在肺癌的发生发展过程中扮演一个复杂的角色,在不同
种族、性别、年龄及临床特征等方面存在较大差异性,这也为个体化治疗做下了铺垫。

本研究关注的壮族与汉族不同民族之间ERCC1的表达并未显现出统计学差异,这也提示对于广西地区患有NSCLC的患者强调化疗效果与民族差异是不合理的,即没有确切证据证明NSCLC患者术后接受铂类制剂化疗时,壮族耐药的概率比汉族高或低。

正是由于存在这样那样的差异,个体化治疗才显得尤为重要。

国内外的相关
研究已充分肯定了ERCC1基因在NSCLC患者接受铂类化疗生存预期中的重要作用,并且为个体化铂类化疗实施提供了重要的信息。

2009年 NCCN关于非小细胞肺癌临床治疗指南也指出,在接受铂类化疗前进行ERCC1 mRNA表达水平检测可提高治疗有效率和患者生存率。

由于癌旁 5～6 cm 外的组织仍能检测到一定比例的异倍体,表明此处可能有残存的癌细胞,可能是肿瘤术后复发的根源,也提示在临床工作中应尽早实施综合治疗。

对与肺癌化疗耐药相关的基因进行适当的分子生物学检测,可相对提高疗效,而不至于金钱及资源的“浪费”,从而为提高患者的生活质量及预后的判断奠定基础。

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