金银花组织培养研究

摘要：
为了加快金银花产业的发展。

提高金银花的繁殖系数，避免生态环境被破坏。

以药用金银花的当年生幼叶为外植体，用MS基本培养基。

通过不同的生长激素和细胞分裂素浓度梯度，筛选适合的培养浓度和培养条件。

实验结果表明，随着培养基中6-BA浓度的升高，褐变率随之提高，褐变现象出现的时间也越早；反之，较低浓度的6-BA适宜幼叶的分化生长，褐变反应慢。

另外，培养时间过长，未及时转接，也出现了褐变现象。

采用3×3（6-BA,NAA各3个平行组）正交实验的方法，找出最优水平组合，得出最佳的激素配比组合。

培养条件：26℃恒温培养，光照1200lx。

实验结果表明，诱导愈伤组织的增殖最佳培养基：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.5 mg/L;诱导芽分化的最佳培养基：MS+6-BA1.0 mg/L+NAA0.1 mg/L。

关键词：金银花；外植体；生长激素；细胞分裂素
Abstract
To quicken the development of Honeysuckle industry, improve the proliferation rate of Honeysuckle, avoid the damage of ecological environment, we choose current-year-young leaves of Jiangsu medicinal Honeysuckle to establish aseptic system for explants.In the whole cultivation process, we choose MS medium. The disinfection method: 1.Sterilization with alcohol of 75% concentration for 45s, 2.Sterilization with HgCl2 of 0.15% concentration for 8min, 3.Washing with aseptic water for 4 or 5 times, 4.Drying with aseptic filter paper.There two kinds of medium: with activated carbon and without activated carbon. Experimental results demonstrated that a little of activated carbon can decrease Browning. With comparison of different cultivation time and concentration of growth hormone(NAA) and cytokinin(6-BA), we discover that the higher of the 6-BA concentration, the higher Browning rate and the earlier of Browning. On the contrary, young leaves growth better and later Browning with lower concentration of 6-BA. We also found Browning with too long cultivation time. By 3×3 Orthogonal Experiment, We find optimal combination of hormone. Cultivation environment: constant temperature with 26℃, light irradiaton 1200lx. The main results: 1.The best multiplication medium for callus: MS+6-BA0.5mol/L+NAA0.5 mol/L.2. The best medium for meristtem culture: MS+6-BA1.0 mol/L+NAA0.1 mol/L.
Key words: Honeysuckle, aseptic system, growth hormone, cytokinin
1 前言
1.1形态特征及生物学特征
金银花（拉丁学名：Lonicera Japonica，英文名：Japan-ese Honeysuckle）别称：忍冬、金银藤、银藤、二色花藤、二宝藤、右转藤、子风藤、鸳鸯藤。

属于植物界，被子植物门Angiosperms。

合瓣花亚纲core eudicots，川续断目Dipsacales，忍冬科Caprifoliaceae，忍冬属Lonicera，金银花种L. japonica。

半常绿藤本；幼枝洁红褐色，密被黄褐色、开展的硬直糙毛、腺毛和短柔毛，下部常无毛。

叶纸质，卵形至矩圆状卵形，有时卵状披针形，稀圆卵形或倒卵形。

总花梗通常单生于小枝上部叶腋，与叶柄等长或稍较短，密被短柔后，并夹杂腺毛；苞片大，叶状，卵形至椭圆形，两面均有短柔毛或有时近无毛；小苞片顶端圆形或截形。

花冠白色，有时基部向阳面呈微红，后变黄色。

雄蕊和花柱均高出花冠。

果实圆形，熟时蓝黑色，有光泽；种子卵圆形或椭圆形，褐色，两侧有浅的横沟纹。

1.2 生长习性
喜温和湿润气候，喜阳光充足，耐寒、耐旱、耐涝，适宜生长的温度为20-30。

℃，对土壤要求不严，耐盐碱。

但以土层深厚疏松的腐殖土栽培为宜。

用种子和扦插繁殖为主。

1.3 化学成分
1.3.1 挥发油：含30种以上成分。

鲜花挥发油成分以芳香醇为主，含量高达14 ％以上，
其他成分多为低沸点不饱和萜烯类成分，而干花挥发油成分以棕榈酸为主，一般占挥发油的26 ％以上，芳香醇含量仅在0. 3％以下。

1.3.2黄酮类化合物：5-羟基-3’,4,7-三甲氧基黄酮、木犀草素-7-O-a-D-葡萄糖
甙、木犀草素-7-O-b-D-半乳糖甙、槲皮素-3-O-b-D-葡萄糖甙、金丝桃甙等。

1.3.3有机酸类：以绿原酸，异绿原酸为主。

1.3.4三萜皂苷类：皂甙、环烯醚萜甙等以长春藤甙元为配基的三萜皂甙、以石竹
素为甙元的三萜皂甙。

1.3.5无机元素：共15种。

分别为Fe、Mn、Cu、Zn、Ti、Sr、Mo、Ba、Ni、Gr、Pb、
V、Co、Li、Ca。

1.4病虫害防治
病害有褐斑病，除减少病源、加强管理外，在发病初期可用3%井冈霉素5×10-5（50ppm）液连续喷治2-3次。

虫害有圆尾蚜，可用化学药剂防治。

咖啡虎天牛，可在7-8月，气温在25℃以上晴天，在田间释放天牛肿腿蜂防治，效果良好。

尺蠖可在幼龄期用化学药剂防治。

1.5 药理学作用
1.5.1抗炎作用：对急性炎症的抑制作用与地塞米松及皮炎平的治疗作用相当。

1.5.2抑菌抗毒作用：对多种致病菌如金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、大肠杆菌、
痢疾杆菌、霍乱弧菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌等均有一定抑制作用；对肺炎球菌、脑膜炎双球菌、绿脓杆菌、结核杆菌、志贺氏痢疾杆菌、变形链球菌等有抑菌和杀菌作用，对流感病毒、孤儿病毒、疱疹病毒、钩端螺旋体均有抑制作用；对痈肿疔疮、肠痈肺痈有较强的散痈消肿，清热解毒、消炎作用：安全浓度范围内，金银花和山银花黄酮类提取物均具有显著的抗病毒作用，体外对PRV分别具有明显的阻断、抑制和中和作用，其中山银花对PRV体外的抑制作用强于金银花，而阻断作用和中和作用，两者差异不显著。

1.5.3抗血小板凝聚作用：樊宏伟等专家发现金银花所含的有机酸类化合物可抑制ADP
(二磷酸腺苷)诱导的家兔血小板聚集，其化合物的浓度剂量越大，其作用越明显剂量和作用呈现正相关性。

[1]
1.5.4对免疫系统作用：金银花具有增强免疫功能，能促进淋巴细胞转化，增强自细胞的吞噬功能。

1.6中药制剂
1.6.1六味黄酮茶：六味黄酮茶是以饮茶的方式饮用中药，该茶由“金银花、银杏
叶、决明子、山楂、槐米、菊花” 六种国家卫生部规定的药食同源的中草药组方而成主要含有人体自身不能合成的植物黄酮类化合物。

六味黄酮茶属于功效型食品（批号：陕卫食证字号），一种具有药效的功效性食品。

1.6.2银翘解毒片：治疗风热感冒的银翘解毒片(丸)，就是以金银花为主药的。

与黄芪制成的银黄片，可以治疗急性上呼吸道感染、急性咽喉炎、急性扁桃体炎等。

1.6.3 金银花露：金银花加水蒸馏可获得“金银花露”，有清暑解热的作用，可以治疗小儿热疖、痱子、暑热等症。

1.7现在金银花市场供需现状
在医药行业，金银花的用量逐年递增．以江苏某金银花使用量较大药品生产企业为例．2004年需求量为40t．2010年预算用量l10t．根据该公司产品销售规划．至2013年预计用量达130t．需求量较今年增加约20％。

．仅王老吉一个产品金银花年需求量达3 O00t．预计到2013年需求量会翻番．达6 O00t。

汇总全国各行业年金银花的需求量约为20 000t。

因为近几年各行业对金银花的大力和深度的开发，以及各地区在种植方式和种植规模上维持现状，导致金银花价格一路走高。

详情请看图1[2]—金银花最近几年走势图。

[2]
国外要的中药材是质量符合标准的，具有明确化学成分的，是经过提取和高科技含量的产品。

国内药材生产、加工和包装质量都不高。

用GC-MS法分析金银花挥发油具体组成，其中酸类仅四种，相对含量高达48.24%。

1其中绿原酸和异绿原酸是清热解毒类中药的基本成分之一，目前约有80%清热解毒杀菌类中药处方中都含有金银花。

金银花对滥用化学抗生素引起的耐药性有一定的作用，且无毒，因此被誉为植物界的“抗生素”。

随着国际市场的开放和种植的规范化，金银花及其保健制品的需求量很可能增加。

市场上常见的用金银花为原料生产的保健产品有：忍冬酒、银花茶、忍冬可乐、金银花汽水、银花糖果和银仙牙膏等。

用金银花制成的金银露，清凉爽口。

以它为主要原料的银仙牙膏，防治口腔疾病也有较好效果。

[3]
1.8金银花组织培养的研究进展
1.8.1金银花组织培养选择外植体的研究进展
研究发现，春季剪取的嫩茎作外植体，比夏季和秋季嫩茎的存活率和诱导率高，顶芽比带腋芽的茎段萌发快，且不定芽的生长量也较高。

[4]
1.8.2金银花组织培养无菌体系的研究进展
金银花幼嫩枝芽表皮因有疏柔毛和疏腺毛，灭菌比较困难。

在对金银花外植体进行灭菌时，如果灭菌时间短，则会因为灭菌不彻底而造成污染率提高，因而对萌发率会有显著影响；如果灭菌时间长，则对外植体产生毒害作用，从而造成褐化率明显提高，也会对萌发率产生严重影响。

研究结果表明，先使用75％酒精灭菌45 s后，再用o．15％HgCl：进行8 min的第二次灭菌，可收到较好的效果。

[5]
1.8.3金银花初代培养的研究进展
大多研究认为，金银花诱导培养选用MS培养基或稍加改良MS培养基的诱导效果较好，芽萌动较快。

诱导培养基的细胞分裂素和生长素浓度比为10～12．5：l时较好。

但杨培君等[6]在研究中认为，蒙花金银花从生芽诱导所用细胞分裂素和生长素浓度比例以2．3～2．5为宜。

黄守印等[7]认为北京忍冬诱导培养基两者比例为6时较好，而李景刚等[8]则认
为金银花良种PM-1诱导培养基的两者比例以20最好，分化率达93％，平均丛生芽数9个。

1.8.4金银花愈伤组织增殖培养的研究进展
不同金银花品种诱导愈伤组织产生不定芽及生根的激素种类及浓度有较大差异，蓝靛果诱导不定芽的培养基是Ms+6-BA 1．0mg/L + NAA 0．01m/L，诱导生根是1／4MS+IAA 1．0 mg/L，金银花诱导不定芽是B5+6-BA 2．2mg/L+KT 2.0 mg/L+IAA2．0 mg/L，生根培养基为1/2B5+IAA 0．08 mg/L。

[9]
1.8.5金银花细胞悬浮培养过程中次生代谢物的变化
Horiike T等[10]金银花细胞悬浮培养中获得了6种姜黄二酮类物质，即(2s)-2-羟基姜黄二酮、(2R)-2-羟基姜黄二酮、(8S)-6-羟基姜黄二酮、(2R，8S)-8-羟基-2-羟基姜黄二酮、(IS，10s)-1，10-环氧姜黄二酮和(1R，IOR)-1，10-环氧姜黄二酮。

Yamamoto H等[11]认为，金银花细胞悬浮培养不会产生环烯醚和裂环烯醚苷，但细胞能将马钱素转化成环烯醚萜甙裂环马钱素，也能将7一脱氧马钱素转化成马钱素和环烯醚萜甙裂环马钱素，而不能将香叶醇转化成环烯醚苷和环烯醚萜甙裂环马钱素。

Yamamoto H[12]还证明了细胞色素P450是马钱素转化合成环烯醚萜甙裂环马钱素的催化酶。

1.8.6金银花生根培养的研究进展
金银花组培苗生根培养绝大多数采用1／2MS培养基，也有用1／4MS[13]。

所使用激素主要是生长素IBA、NAA、IAA。

不同品种诱导生根的生长素种类和浓度有较大的差别。

蒙花金银花、北京忍冬、灰毡毛忍冬均采用IBA 0．2～3．0mg/L诱导生根[7] [10],而红河金银花、风爪金银花、皱叶忍冬则采用NAA 0．02～0．05mg/L加IAA或IBA 1．0mg/L生根培养[7]，也有采用高浓度NAA 3．0 mg/L诱导生根[10]。

一些试验认为，减少矿物质浓度可以使根增长，但不增加根的数量[13]。

另有研究认为，在金银花生根培养基中添加200mg/L的活性炭能促进生根，生根率达94．4％，且须根较多，苗木粗壮[14]。

金银花生根培养多在温度25±2 ℃条件下培养。

但灰毡毛忍冬生根培养适宜温度为20℃，生根率达98．7％，比25℃高9．7％[15]。

2 金银花的组织培养
2.1外植体的接种与培养
2.1.1外植体的选择与消毒
选取江苏药用金银花当年生幼茎和幼叶为外植体，母本无病、无虫、生长正常。

将茎段用清水冲洗干净，剪下幼叶，投入300mL带塞广口瓶中。

打开超净工作台，.在无菌室或接种箱中放好接种时所需要的酒精灯、贮存75%酒精和棉球的广口瓶、火柴、灭好菌的各种镊子、接种针、解剖刀、手术剪、培养基等。

打开紫外灯照射30～45分钟，进行灭菌。

叶片先用75％的酒精灭菌45 s，然后用O．15％HgCl2灭茵8 min，最后用无菌水冲洗4~5次，用无菌滤纸吸干水分。

2.1.2外植体接种及初代培养
用酒精棉球擦手和工作台，并对接种工具用酒精灯火焰烧灼，晾凉备有。

将灭过菌的叶片，在无菌的情况下，切成2cm×2cm小块，迅速放入不同配比的培养基中，每瓶四个外植体，每平行组3瓶，共12个外植体。

接种时，锥形瓶应斜向火焰，在酒精灯火焰附
近操作。

材料接种后，将锥形瓶瓶口在酒精灯火焰上转动烧一遍，盖好瓶盖，注明材料名称及接种日期。

材料接种后，将其置于恒温培养箱中培养，温度24～26℃，光照条件为12～16h／d。

培养30d左右观察愈伤组织生长状况。

初代培养的培养基是MS+6-BA+NAA +蔗糖3%+琼脂0.72%，pH5.8，其中的激素浓度配比如下表：
表1 各组培养基的激素的配比
6-BA mg/L NAA mg/L
1 0.1 0.1
2 0.1 0.5
3 0.1 1.0
4 0.
5 0.1
5 0.5 0.5
6 0.5 1.0
7 1.0 0.1
8 1.0 0.5
9 1.0 1.0
2.1.3愈伤组织的增殖
按下表配制愈伤组织继代培养基，挑选淡绿色，长的比较大的，四周几乎都愈伤化的愈伤组织接种于初代培养中生长最好的MS培养基上，然后剔除愈伤组织粘着的原培养基，用镊子和小刀切成0.5cm×0.5cm左右的小块后，接种于继代培养基上，每瓶接种2个愈伤组织，放入共接种15瓶。

温度25℃，光强1500～2000 lx，光照周期12 h／d的光照培养箱中进行培养，并随时观察愈伤组织的生长情况。

15d后统计愈伤组织增殖率。

2.2不定芽的诱导
按下表配制不定芽的诱导培养基，将增殖后的愈伤组织接入到表2中的 1～9号培养基中。

将增殖后生长比较旺盛的愈伤组织接种到不同6-BA和NAA浓度的MS基本培养基中，每日光照12h,温度28℃左右，并随时观测其生长情况，30d后统计不定芽的分化率。

1 0.5 0.05
2 1.0 0.05
3 1.5 0.05
4 0.
5 0.1
5 1.0 0.1
6 1.5 0.1
7 0.5 0.15
8 1.0 0.15
9 1.5 0.15
3 结论与分析
3.1 初代培养：
初代培养5天后，有7瓶培养基中出现染菌现象，1瓶中1个外植体中间有黑色菌落出现，无菌丝。

因为短时间内出现菌落，且无菌丝，因此可能是黑霉菌。

另外6瓶中也都是外植体的边缘或中间出现很小的白色斑点，有丝。

因其繁殖周期长，有菌丝出现，所以有可能是放线菌。

出现高污染率的可能原因有金银花叶片上有毛，很难清洗；汞杀毒时间短，或汞的浓度不够；操作不规范，在接种过程中污染。

死亡13个外植体，均是从边缘开始枯黄，慢慢扩散到整个外植体。

导致死亡的可能原因有汞或酒精杀毒之间过长，或汞和酒精杀毒后，没有用清水漂洗干净；或者接种时，离酒精灯外焰过近，烧伤了外植体。

未生长的外植体有5个，可能细胞分裂素浓度和生长素浓度过低，没有起到促进作用。

褐变的愈伤组织有17个。

表3 NAA xmg/L+6-BA ymg/L对愈伤组织的诱导率
NAA xmg/L+ 接种外植体愈伤化生长势诱导率%
6-BA ymg/L 瓶数总块数总块数
1 3 1
2 2 + 16.67
2 3 12 4 + 33.33
3 3 12 2 + 16.67
4 3 12
5 ++ 41.67
5 3 12 8 ++++ 66.67
6. 3 12 7 +++ 58.33
7 3 12 5 ++ 41.67
8 3 12 5 ++ 41.67
9 3 12 4 + 33.33
(－死亡；+较差；++一般；+++较好++++旺盛)
总外植体数108个，有8个外植体污染，共7瓶，污染率7.4%，死亡外植体数13个，死亡率12.04%，褐变外植体数17，褐变率15.74%，未生长的外植体数6个，脱分化成愈伤组织的外植体数52个，愈伤组织诱导率48.15%。

初代培养20d，叶片四周卷起，有少许愈伤组织生长，成嫩绿色，质地紧密。

有的呈“回”字形生长有浅绿色疏松的愈伤组织。

有的边缘有少许白色疏松的愈伤组织。

有的浅黄色疏松的愈伤组织。

初代培养30d，“回”字形愈伤组织的中间部分也有愈伤组织生长，其中MS+0.5mol/L 6-BA + 0.5mol/L NAA外植体边缘愈伤组织长势最旺盛，中间也有很多愈伤组织生长，质地疏松，成翠绿色。

综上所述：MS+0.5mol/L 6-BA + 0.5mol/L NAA是诱导愈伤组织的增殖的最佳培养基。

其愈伤组织呈现结构疏松，色泽艳丽，生长旺盛的状态，应该属于Ⅱ型愈伤组织增殖——兴奋分裂型。

[15]
MS+0.1mol/L 6-BA + 0.1mol/L NAA的几个愈伤组织结构致密生长缓慢，可能是激素浓度较低造成的。

可能属于保守分裂型。

[15]
随着6-BA浓度的增加，褐变愈来愈严重，随着NAA浓度的增加，愈伤组织长势愈来愈好。

到MS+1.0mol/L 6-BA + 1.0mol/L NAA愈伤组织的增殖已呈现衰败型了，即结构松弛，生长缓慢。

[15]
因此说明过高浓度的6-BA会促使愈伤组织褐变，而有关报道表明1%的活性炭能有效缓解褐变现象，因为活性炭具有吸附细胞有毒此生代谢产物的能力。

另外褐变也随着时间的延长而增多，可能原因是随着时间的延长培养基内的营养大量的消耗，次生代谢产物在培养基内的浓度增加，有毒物质也增多了，所以褐变增加。

MS+0.5mol/L 6-BA + 0.1mol/L NAA，MS+0.5mol/L 6-BA + 1.0mol/L NAA，MS+1.0mol/L 6-BA + 0.1mol/L NAA 3组有白色，或青白色，黄白色的疏松愈伤组织生长，大量研究认为，这种沿叶片切口长出的白色，疏松，颗粒状的愈伤组织是体细胞胚来源于愈伤组织内的单个胚性细胞，属于单细胞起源。

[16]
初代培养中，污染率和褐变率过高导致愈伤组织诱导率过低，对金银花组织培养造成了困扰，因此杀菌要彻底，培养基中可添加1%的活性炭。

3.2 愈伤组织的继代培养与增殖
MS+0.5mol/L 6-BA + 0.5mol/L NAA是诱导愈伤组织的增殖的最佳培养基，愈伤组织呈黄绿色，结构疏松膨大。

所以接种的继代培养基是MS+0.5mol/L 6-BA + 0.5mol/L NAA。

继代培养10d后，有3个愈伤组织表面出现白色菌斑，有菌丝出现，据观察所得应该是放线菌。

30d后，大部分愈伤组织都生长较好，颜色以浅绿色，黄绿色为主，组织疏松。

其中外植体总数30个，污染个数3个，污染率16.67%，死亡个数3个，死亡率10%，存活个数19个，愈伤组织诱导率63.33%。

污染和死亡率依然很高，应该是操作技术不熟练造成的。

3.3 不定芽的诱导：
表4 NAA xmg/L+6-BA ymg/L对不定芽的诱导率
NAA xmg/L+ 接种外植体不定生长势诱导率%
6-BA ymg/L 瓶数总块数芽数
1 3 6
2 + 33.33
2 3 6 5 + 50
3 3 6 2 + 33.33
4 3 6
5 ++ 50
5 3
6 6 ++++ 100
6. 3 6 2 +++ 33.33
7 3 6 5 ++ 83.33
8 3 6 4 ++ 66.67
9 3 6 2 + 33.33
(－死亡；+较差；++一般；+++较好++++旺盛)
其中愈伤组织数为54个，愈伤组织有3个污染，污染率5.56%，愈伤组织褐变数13个，5.56%褐变，愈伤组织诱导率为77.78%，芽分化率为68.52%。

每个不同激素浓度下的愈伤组织其丛生芽数目不等，其中以1.0mol/L 6-BA + 0.1mol/L NAA下的愈伤组织分化出的不定芽数最多，且颜色翠绿，生长旺盛。

实验结果表明：最适宜分化出丛生不定芽的激素配比是MS+1.0mol/L 6-BA + 0.1mol/L NAA.
在不定芽的诱导过程中，污染率及死亡率都降低了很多，说明在实验中，锻炼了操作能力，提高了实验的成功率。

4 小结与讨论
4.1 小结
在整个金银花伤组织和不定芽的诱导的培养过程中,可以很明显的看,外植体愈伤组织的形成与外源激素的作用是密不可分，多种激素的综合使用时，其组合比例、浓度是组培成功最基本的条件。

愈伤组织培养过程中MS+0.5μmol/L6-BA+0.5μmol/LNAA的培养基效果是最好的。

不定芽的培养过程中最佳培养基为MS+0.1mg/L NAA+1.0mg/L6-BA的培养基效果是最好的。

由于金银花属于木本植物，所以其培养周期中的各个时期都较长。

且由于金银花叶片表面有毛，很难测底的杀菌，致使愈伤组织成活率都较低。

实验过程中死亡和褐化的数量较多，所以应控制好灭菌的时间和紫外杀毒的时间，在叶片的处理过程中也控制好升汞的浓度，以保持好叶片和芽的活性，增强诱导率和存活率。

4.2 讨论：
4.2.1 外植体褐变的防治
外植体褐变是阻碍愈伤组织诱导率的主要限制因素，研究采用三个途径控制外植体伤口褐变。

一是利用抗氧化物质；二是利用吸附剂的吸附性，三是一定低温处理[14]。

抗氧化剂中的抗坏血酸和柠檬酸在一定程度上虽然达到了控制褐变的目的，但对愈伤组织的生长有一定影响，且对琼脂凝固有影响，需要在灭菌前调节pH值。

使用350-800ppm 的DL—半胱氨酸前无菌溶液浸泡伤口，可有效地控制早期褐变，但这种作用因蘸取量有阻而随时间推后而减弱。

常常在愈伤组织未长出前即失效，伤口仍出现不同程度的褐变。

活性碳具有一定的控制揭变的能力，但由于选择吸附性较差，造成培养基中一些物质的有效成分降低，愈伤组织诱导率低、发育也不好，培养基有效利用时间降低浪费较大。

使用PVP(聚乙烯吡咯烷酮)作吸附剂控制褐变时间较长，但效果较抗氧化物质低。

外植体接种后使之处于2-6℃低温下可以降低酶的活性，减少酚类分泌量．从而达到控制褐变的效果，但是这种处理所用的时间不宜太长，超过72小时植物体的生命力受到损伤。

在上述备单项试验的基础上，研究采用一套综合方法，即在培养基中加入150-300mg ／L抗坏血酸+150-300mg/L柠檬酸+ 5 g/L PVP接种前用350-300ppmDL-半胱氨酸处理伤口，接种后2- 5℃4,8小时低温处理，对伤口褐变有很高的控制效果，褐变率被降低到10%以下。

4.2.2 灭菌剂的选择
组织培养过程中外植体常规消毒法一般用75 %乙醇配合0.1 %升汞消毒。

由于金银花植株外表长有疏柔毛和疏腺毛，用常规消毒法将很难彻底杀灭病菌，研究表明，用75% 乙醇配合0.1 - 0.2%升汞对带腋芽的茎段消毒后的污染率高而且成活率低；也有研究报道用氯酸钠、次氯酸钙代替升汞对金银花外植体进行消毒，但灭菌效果均不如升汞理想。

也有研究用75% 碱化乙醇代替75% 乙醇进行表面灭菌能取得较好的灭菌效果。

其原因可能是碱化乙醇中的OHˉ可改变细胞膜表面所带电荷的性质，增加膜的通透性，从而提高乙醇、升汞杀菌效果。

[17]
参考文献
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致谢
本次毕业论文从设计到完成，以及后期的整理分析，都是在我的指导老师张国斌老师的精心指导下完成的，在我的毕业设计选题、调研、开题以及撰写过程中始终严格要求，同时及时地给予我系统全面的指导，指出我的不足及错误。

他学识渊博，治学严谨，逻辑分析能力强，使我受益匪浅。

从大二的生物化学到大三的组织培养技术，最后的毕业论文实验，张老师在学习、生活上给了我很大的帮助和支持，值此论文完成之际，我向张国斌老师致以最诚挚的感谢和深深的敬意！
其次，在我毕业设计过程中彭敏，谢丽波等同学也给与我很大的帮助，虽然短短的相处不到一年的时间，却给与我无私的帮助。

在此我向各位同学表示衷心的感谢！同时，在四年的本科学习中，李良学老师、郜金荣老师、代建丽老师、杨艺华老师、雷湘老师、刘艳老师等一大批优秀教师给予我大力支持和帮助，他们无私的指导和观察处理问题的独特方式、严谨的治学作风对我产生了很大的影响，在此我向他们致以深深的谢意！
最后，对一直关心支持我的家人、同学、朋友表示最真挚的感谢！向审阅本设计的各位老师表示真挚的感谢！
附录Ⅰ实验图片
图1初代培养10d 图2初代培养15d
图3初代培养30d 图4继代培养30d
图5不定芽的诱导20d 图6不定芽的诱导30d
附录Ⅱ MS培养基（单位：mg/L）
附录Ⅲ计算公式
3.1衡量外植体的表面消毒效果的观察指标
污染率=污染的外植体数/接种的总外植体个数×100%
死亡率=死亡外植体个数/接种的总外植体个数×100%
3.2愈伤组织培养的观察指标
愈伤组织的诱导率=产生愈伤组织的外植体数/接种的总外植体个数×100%
愈伤组织分化率=分化芽的愈伤组织数/接种分化培养基上的总外愈伤组织个数×100%
3.3观察不定芽，不定根的指标
芽分化率=产生芽的外植体个数/接种的总外植体个数×100%
生根率=以生根的芽数/生根培养的总芽数×100。