分子生物学导论--分子生物学实验技术 ppt课件
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第12章 分子生物学实验技术(1-3)
本次内容
一、核酸杂交 二、分子标记 三、遗传图谱、物理图谱 四、图位克隆 五、重组DNA、细菌转化
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
10×Buffer
2.0µl
Mg2+（25mM） 1.2µl
Taq酶（5U/µl） 0.1µl
dNTP（25mM） 0.2µl
加水至20µl，混合后，进行 PCR扩增 。
PCR反应程序：
Step1 95℃ 2分钟 Step2 95℃ 30秒 Step3 56℃ 30秒
（SSR引物退火温度在52-65 ℃ 不等。 ） Step4 72℃ 60秒 Step5 GOTO Step2 31循环
对BC3F3（113株）田间成株期鉴定为： R : S = 78 : 35
2.抗条锈病基因Yr5的SSR标记的建立
6个抗病株DNA和6个感病株DNA以2BL上的17对SSR 引物进行PCR扩增和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳多 态性引物Xgwm501对BC3F2（44株）和BC3F3（113株） 进行分析 Xgwm501—195bp、160bp 11.9cM Yr5基因
2、基因重组和连锁理论 连锁图谱构建的理论基础是染色体的交换 与重组。
基因的连锁是位于同一染色体上的基因在遗 传过程中一般倾向于维系在一起。
基因的重组是通过一对同源染色体的两个非 姊妹染色单体之间的交换来实现的。
Sh C P1
Sh C
Sh C
94％
细胞
无交
sh c
换
Sh C
Sh C sh c
sh c
定义2：通过遗传重组所得到的基因在具体染色体上线性排列 图称为遗传连锁图。它是通过计算连锁的遗传标志之间的重组 频率，确定他们的相对距离，一般用厘摩(cM，即每次减数分 裂的重组频率为1%)来表示。
1、染色体遗传理论 1903年W. S. Sutton和T. Boveri分别提出了遗传因 子位于染色体上的理论，他们将染色体看作是孟 德尔基因的物理载体。该理论亦称为SuttonBoveri染色体遗传理论 ：
表2-1 Yr5基因和SSR标记Xgwm501—195bp、160bp在BC3F2 群体上的分离(Segregation between Yr5 gene and
SSR marker Xgwm501—195bp、160bp in BC3F2 population）
SSR 标记 Xgwm501
纯 抗 株（10）
分子标记的优点
（1）多态性直接以DNA形式表现，不受季节、 环境、基因表达与否的限制；
（2）多态性高，存在着丰富的等位变异； （3）数量丰富，多态性遍及整个基因组； （4）表现为“中性”，不影响目标性状的表达，
与不良性状无必然的连锁； （5）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂
合基因型，提供完整的信息。
类型 核酸
探针
Southern DNA DNA or RNA
应用
基因拷贝数等
Northern RNA DNA or RNA RNA 大小和表达丰度
Western Protein
抗体
蛋白的大小和丰度
Southern and Northern blotting
DNA on blot
RNA on blot
RNA
Southern analysis
Southern bolt hybridization
播放动画： Southern. mov
本次内容
一、核酸杂交 二、分子标记 三、遗传图谱、物理图谱 四、图位克隆 五、重组DNA、细菌转化
遗传标记的种类
遗传标记：
用于研究基因遗传变异规律的可识别的等位 基因。
1. Genomic DNA preparation 2. Restriction digestion 3. Denature with alkali
RNA preparation -
4. Agarose gel electrophoresis 5. DNA blotting/transfer and fixation 6. Probe labeling 6. Hybridization (temperature) 7. Signal detection (X-ray film or antibody)
遗传连锁图谱（linkage map）
定义1：又叫遗传图谱（genetic map)是以具有遗传多态性 （在基因组的一个遗传位点上具有一个以上的等位基因，它在 群体中的出现频率皆高于1%）的遗传标记为“路标”，以遗 传学距离（在细胞减数分裂事件中两个位点之间进行交换，重 组的百分率，1%的重组率称为1cM（厘摩尔）为图距的基因组 图。图谱的建立为基因的识别和完成基因定位创造了条件。
根据识别的层次和手段可分为四类：
a) 形态学标记 b) 细胞学标记 c) 生化标记 d) 分子标记
分子标记
• 用于标示目标基因的DNA序列。
– 与目标基因紧密连锁的DNA序列或者是基因内 的一段序列。
DNA序列
目标基因
传统育种方法对很多农艺性状(如籽粒重、 抗病性)很难早期诊断； 很多性状很难用传统方式进行性状鉴别和 选择。 分子标记(尤其是PCR基础上的分子标记) 高通亮、灵敏度高、早期诊断、方便鉴别， 可以缩短育种进程，提高育种效率。
(AT)ｎ最丰富,然后依次是: (A)n、(T)n、(AG)n、(CT)n、(AAT)n、(ATT)n、 (AAC)n、(GTT)n、(AGC)n、(GCT)n、(AAG)n、(CTT) n、(AATT)n、(TTAA)n、 (AAAT)n、(ATTT)n及(AC)n、(GT)n。 3. 同一类内碱基种类不同的SSR,丰度差别很大。
• 重组型配子最大可能的比例是50%，这时在所有 减数分裂的细胞中，在两对基因的连锁区段上都 发生交换，相当于这两对基因间无连锁，表现为 独立遗传。
• 重组型配子占总配子的比例称为重组率，用r表示。 重组率的高低取决于交换的频率，而两对基因之 间的交换频率取决于它们之间的直线距离。重组 率的值变化于完全连锁时的0%到完全独立时的 50%之间。因此重组率可用来表示基因间的遗传 图距，图距单位用厘摩（centi-Morgan，cM） 表示，1cM的大小大致符合1%的重组率。
(1)体细胞核内的染色体成对存在，其中一条来自雌亲，一条 来自雄亲，成对染色体的两个成员是同源的。
(2)每条染色体在个体的生命周期中均能保持其结构上的恒定 性和遗传上的连续性，因而在个体的发育过程中起着一定 的作用。
(3)在减数分裂中，同源染色体的两个成员相互配对，随后又 发生分离，走向细胞的两极，从而形成两个单倍，费用较高，耗时长； 3. 实际分析时一般每次只分析单个位点； 4. 不同引物退火温度不同，需要探索。
SSR的检测
1. 琼脂糖凝胶检测
2. 聚丙烯酰胺凝胶检测
由于1）SSR产物一般为几百bp；2）琼脂糖电泳很难区分 几十bp的差异；3）变性PAGE配制比较复杂，因此，一般 采用连续非变性PAGE电泳分离 (需要银染)。 凝胶配方如下：（1×TBE缓冲体系）
2. 不同材料重复次数的不同，导致了SSR长度的高度变异性。
SSR分子标记的创制基因组的构建——探针制备-预杂交-带有SSR克隆的选择——测 序——引物设计——检测 Genome-体系：
DNA（20ng/µl） 4.0µl
Primer（1mM） 0.25µl
PCR 标记 STS等 建特殊双引物
双引物选择性 主要指AFLP 扩增PCR 标记
Sequencing based
SNP标记
markers:新型的分子标记 EST标记
SSR
SSR, simple sequence repeat，
微卫星标记
1. 真核生物基因组普遍存在，呈随机分布,大约每隔10-50kb就存在 一个SSR.
40%丙烯酰胺（Acr:Bis=39:1) 12mL 5×TBE 12mL 20% 过硫酸铵 600uL TEMED 30uL distliled water 35ml
1.抗病性鉴定和遗传分析
对BC3F2（44株）田间成株期鉴定为： R : S = 32 : 12
对44个F3家系温室苗期和田间成株期共同鉴定为： RR : Rr : rr = 10 : 22 : 12
CC Sh Sh
cc sh sh
全部亲组合占94％
Sh C
P2
sh c sh c
sh c F1
二 分 体
新
Sh C
sh c Sh C Sh c sh C sh c
6%细胞 交换
四
C c新 Sh Sh
分
体
c
C
sh sh 新
3％亲组合 3％重组合
• 重组型配子所占的比例取决于减数分裂细胞中发 生交换的频率。交换频率越高，则重组型配子的 比例越大。
2. 哺乳动物中约为植物的5-6倍;植物中平均23.3kb有一个SSR;双子 叶植物SSR数量大于单子叶植物,核DNA SSR数量多于细胞质 DNA;
3. 根据核心序列碱基数的不同,可分为单碱基、2碱基、3碱基、4碱 基等多种重复型。
SSR的分布特点
1. 不同物种其重复序列及重复单位频率不同。 2. 通过对54个植物种核DNA和28个植物种细胞器DNA SSR(1-4bp)的搜索,发现：
抗 病 株 （ 78）
感 病 株 （ 35）
SSR标 记
A带型 H带型 B带 型 A带 型 H带 型 B带型
Xgwm 501 36 40
2
5
3
27
Mapmaker计算SSR标记Xgwm501—195bp、160bp 与Yr5基因之间的遗
传距离在BC3F3群体中表现为13.3cM
本次内容
一、核酸杂交 二、分子标记 三、遗传图谱、物理图谱 四、图位克隆 五、重组DNA、细菌转化
分子标记的类型和特点
Hybridization-based markers:以分
子杂交为基础的DNA标记技术（RFLP
标记、原位杂交 ）
RAPD
分
单引物PCR AP-PCR
子 标 记
PCR-based markers:以PCR反 应为基础的DNA指 纹技术
标记
DAF ISSR等
双引物
SSR 需克隆、测序构
杂 抗 株（22）
感 病 株（12）
A 带型 H 带型 B 带型 A 带型 H 带型 B 带型 A 带型 H 带型 B 带型
9
0
1
4
16
2
0
0
12
Mapmaker计算SSR标记Xgwm501—195bp、160bp 与Yr5基因之间的
遗传距离在BC3F2群体中表现为10.5cM
表2-2 Yr5基因和SSR标记Xgwm501—195bp、160bp在BC3F3群 体上的分离(Segregation between Yr5 gene and SSR marker Xgwm501—195bp、160bp in BC3F3 population）
SSR的优点
1. 两侧顺序保守，在同种间多相同； 2. 数量丰富，在整个基因组均匀随机分布； 3. 实验重复性好，结果可靠； 4. 多数SSR增减重复序列频率高，在品种间具广泛位点变异； 5. 共显性标记，可鉴别杂合子和纯合子； 6. 仅需微量组织，适合PCR分析半自动化
SSR的缺点
1. 相对的物种专一性； 2. 由于开发时需针对每个座位的微卫星序列，发现其两端的单拷贝序
SSR的主要功能:
1. 编码氨基酸； 2. 染色体末端的SSR，有保护DNA完整性、避免降解、融合及丢失的功能； 3. 提高或降低临近基因转录速率； 4. 基因重组的热点，是基因变异的来源； 5. 部分SSR可产生转录启动复合物或活化染色体。
SSR分析
1. 两端序列多是保守的单拷贝序列，可以根据两端序列设计一对特异 引物，通过PCR将其间微卫星序列扩增出来，利用电泳技术获得长 度多态性。
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
分子杂交
分子杂交是通过各种方法将核酸分子固 定在固相支持物上,然后用放射性标记的 探针与被固定的分子杂交,经显影后显示 出目的DNA或RNA分子所处的位置。
Comparison of Southern, Northern and Western bolt hybridization
本次内容
一、核酸杂交 二、分子标记 三、遗传图谱、物理图谱 四、图位克隆 五、重组DNA、细菌转化
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
10×Buffer
2.0µl
Mg2+（25mM） 1.2µl
Taq酶（5U/µl） 0.1µl
dNTP（25mM） 0.2µl
加水至20µl，混合后，进行 PCR扩增 。
PCR反应程序：
Step1 95℃ 2分钟 Step2 95℃ 30秒 Step3 56℃ 30秒
（SSR引物退火温度在52-65 ℃ 不等。 ） Step4 72℃ 60秒 Step5 GOTO Step2 31循环
对BC3F3（113株）田间成株期鉴定为： R : S = 78 : 35
2.抗条锈病基因Yr5的SSR标记的建立
6个抗病株DNA和6个感病株DNA以2BL上的17对SSR 引物进行PCR扩增和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳多 态性引物Xgwm501对BC3F2（44株）和BC3F3（113株） 进行分析 Xgwm501—195bp、160bp 11.9cM Yr5基因
2、基因重组和连锁理论 连锁图谱构建的理论基础是染色体的交换 与重组。
基因的连锁是位于同一染色体上的基因在遗 传过程中一般倾向于维系在一起。
基因的重组是通过一对同源染色体的两个非 姊妹染色单体之间的交换来实现的。
Sh C P1
Sh C
Sh C
94％
细胞
无交
sh c
换
Sh C
Sh C sh c
sh c
定义2：通过遗传重组所得到的基因在具体染色体上线性排列 图称为遗传连锁图。它是通过计算连锁的遗传标志之间的重组 频率，确定他们的相对距离，一般用厘摩(cM，即每次减数分 裂的重组频率为1%)来表示。
1、染色体遗传理论 1903年W. S. Sutton和T. Boveri分别提出了遗传因 子位于染色体上的理论，他们将染色体看作是孟 德尔基因的物理载体。该理论亦称为SuttonBoveri染色体遗传理论 ：
表2-1 Yr5基因和SSR标记Xgwm501—195bp、160bp在BC3F2 群体上的分离(Segregation between Yr5 gene and
SSR marker Xgwm501—195bp、160bp in BC3F2 population）
SSR 标记 Xgwm501
纯 抗 株（10）
分子标记的优点
（1）多态性直接以DNA形式表现，不受季节、 环境、基因表达与否的限制；
（2）多态性高，存在着丰富的等位变异； （3）数量丰富，多态性遍及整个基因组； （4）表现为“中性”，不影响目标性状的表达，
与不良性状无必然的连锁； （5）许多分子标记表现共显性，能鉴别纯合杂
合基因型，提供完整的信息。
类型 核酸
探针
Southern DNA DNA or RNA
应用
基因拷贝数等
Northern RNA DNA or RNA RNA 大小和表达丰度
Western Protein
抗体
蛋白的大小和丰度
Southern and Northern blotting
DNA on blot
RNA on blot
RNA
Southern analysis
Southern bolt hybridization
播放动画： Southern. mov
本次内容
一、核酸杂交 二、分子标记 三、遗传图谱、物理图谱 四、图位克隆 五、重组DNA、细菌转化
遗传标记的种类
遗传标记：
用于研究基因遗传变异规律的可识别的等位 基因。
1. Genomic DNA preparation 2. Restriction digestion 3. Denature with alkali
RNA preparation -
4. Agarose gel electrophoresis 5. DNA blotting/transfer and fixation 6. Probe labeling 6. Hybridization (temperature) 7. Signal detection (X-ray film or antibody)
遗传连锁图谱（linkage map）
定义1：又叫遗传图谱（genetic map)是以具有遗传多态性 （在基因组的一个遗传位点上具有一个以上的等位基因，它在 群体中的出现频率皆高于1%）的遗传标记为“路标”，以遗 传学距离（在细胞减数分裂事件中两个位点之间进行交换，重 组的百分率，1%的重组率称为1cM（厘摩尔）为图距的基因组 图。图谱的建立为基因的识别和完成基因定位创造了条件。
根据识别的层次和手段可分为四类：
a) 形态学标记 b) 细胞学标记 c) 生化标记 d) 分子标记
分子标记
• 用于标示目标基因的DNA序列。
– 与目标基因紧密连锁的DNA序列或者是基因内 的一段序列。
DNA序列
目标基因
传统育种方法对很多农艺性状(如籽粒重、 抗病性)很难早期诊断； 很多性状很难用传统方式进行性状鉴别和 选择。 分子标记(尤其是PCR基础上的分子标记) 高通亮、灵敏度高、早期诊断、方便鉴别， 可以缩短育种进程，提高育种效率。
(AT)ｎ最丰富,然后依次是: (A)n、(T)n、(AG)n、(CT)n、(AAT)n、(ATT)n、 (AAC)n、(GTT)n、(AGC)n、(GCT)n、(AAG)n、(CTT) n、(AATT)n、(TTAA)n、 (AAAT)n、(ATTT)n及(AC)n、(GT)n。 3. 同一类内碱基种类不同的SSR,丰度差别很大。
• 重组型配子最大可能的比例是50%，这时在所有 减数分裂的细胞中，在两对基因的连锁区段上都 发生交换，相当于这两对基因间无连锁，表现为 独立遗传。
• 重组型配子占总配子的比例称为重组率，用r表示。 重组率的高低取决于交换的频率，而两对基因之 间的交换频率取决于它们之间的直线距离。重组 率的值变化于完全连锁时的0%到完全独立时的 50%之间。因此重组率可用来表示基因间的遗传 图距，图距单位用厘摩（centi-Morgan，cM） 表示，1cM的大小大致符合1%的重组率。
(1)体细胞核内的染色体成对存在，其中一条来自雌亲，一条 来自雄亲，成对染色体的两个成员是同源的。
(2)每条染色体在个体的生命周期中均能保持其结构上的恒定 性和遗传上的连续性，因而在个体的发育过程中起着一定 的作用。
(3)在减数分裂中，同源染色体的两个成员相互配对，随后又 发生分离，走向细胞的两极，从而形成两个单倍，费用较高，耗时长； 3. 实际分析时一般每次只分析单个位点； 4. 不同引物退火温度不同，需要探索。
SSR的检测
1. 琼脂糖凝胶检测
2. 聚丙烯酰胺凝胶检测
由于1）SSR产物一般为几百bp；2）琼脂糖电泳很难区分 几十bp的差异；3）变性PAGE配制比较复杂，因此，一般 采用连续非变性PAGE电泳分离 (需要银染)。 凝胶配方如下：（1×TBE缓冲体系）
2. 不同材料重复次数的不同，导致了SSR长度的高度变异性。
SSR分子标记的创制基因组的构建——探针制备-预杂交-带有SSR克隆的选择——测 序——引物设计——检测 Genome-体系：
DNA（20ng/µl） 4.0µl
Primer（1mM） 0.25µl
PCR 标记 STS等 建特殊双引物
双引物选择性 主要指AFLP 扩增PCR 标记
Sequencing based
SNP标记
markers:新型的分子标记 EST标记
SSR
SSR, simple sequence repeat，
微卫星标记
1. 真核生物基因组普遍存在，呈随机分布,大约每隔10-50kb就存在 一个SSR.
40%丙烯酰胺（Acr:Bis=39:1) 12mL 5×TBE 12mL 20% 过硫酸铵 600uL TEMED 30uL distliled water 35ml
1.抗病性鉴定和遗传分析
对BC3F2（44株）田间成株期鉴定为： R : S = 32 : 12
对44个F3家系温室苗期和田间成株期共同鉴定为： RR : Rr : rr = 10 : 22 : 12
CC Sh Sh
cc sh sh
全部亲组合占94％
Sh C
P2
sh c sh c
sh c F1
二 分 体
新
Sh C
sh c Sh C Sh c sh C sh c
6%细胞 交换
四
C c新 Sh Sh
分
体
c
C
sh sh 新
3％亲组合 3％重组合
• 重组型配子所占的比例取决于减数分裂细胞中发 生交换的频率。交换频率越高，则重组型配子的 比例越大。
2. 哺乳动物中约为植物的5-6倍;植物中平均23.3kb有一个SSR;双子 叶植物SSR数量大于单子叶植物,核DNA SSR数量多于细胞质 DNA;
3. 根据核心序列碱基数的不同,可分为单碱基、2碱基、3碱基、4碱 基等多种重复型。
SSR的分布特点
1. 不同物种其重复序列及重复单位频率不同。 2. 通过对54个植物种核DNA和28个植物种细胞器DNA SSR(1-4bp)的搜索,发现：
抗 病 株 （ 78）
感 病 株 （ 35）
SSR标 记
A带型 H带型 B带 型 A带 型 H带 型 B带型
Xgwm 501 36 40
2
5
3
27
Mapmaker计算SSR标记Xgwm501—195bp、160bp 与Yr5基因之间的遗
传距离在BC3F3群体中表现为13.3cM
本次内容
一、核酸杂交 二、分子标记 三、遗传图谱、物理图谱 四、图位克隆 五、重组DNA、细菌转化
分子标记的类型和特点
Hybridization-based markers:以分
子杂交为基础的DNA标记技术（RFLP
标记、原位杂交 ）
RAPD
分
单引物PCR AP-PCR
子 标 记
PCR-based markers:以PCR反 应为基础的DNA指 纹技术
标记
DAF ISSR等
双引物
SSR 需克隆、测序构
杂 抗 株（22）
感 病 株（12）
A 带型 H 带型 B 带型 A 带型 H 带型 B 带型 A 带型 H 带型 B 带型
9
0
1
4
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0
0
12
Mapmaker计算SSR标记Xgwm501—195bp、160bp 与Yr5基因之间的
遗传距离在BC3F2群体中表现为10.5cM
表2-2 Yr5基因和SSR标记Xgwm501—195bp、160bp在BC3F3群 体上的分离(Segregation between Yr5 gene and SSR marker Xgwm501—195bp、160bp in BC3F3 population）
SSR的优点
1. 两侧顺序保守，在同种间多相同； 2. 数量丰富，在整个基因组均匀随机分布； 3. 实验重复性好，结果可靠； 4. 多数SSR增减重复序列频率高，在品种间具广泛位点变异； 5. 共显性标记，可鉴别杂合子和纯合子； 6. 仅需微量组织，适合PCR分析半自动化
SSR的缺点
1. 相对的物种专一性； 2. 由于开发时需针对每个座位的微卫星序列，发现其两端的单拷贝序
SSR的主要功能:
1. 编码氨基酸； 2. 染色体末端的SSR，有保护DNA完整性、避免降解、融合及丢失的功能； 3. 提高或降低临近基因转录速率； 4. 基因重组的热点，是基因变异的来源； 5. 部分SSR可产生转录启动复合物或活化染色体。
SSR分析
1. 两端序列多是保守的单拷贝序列，可以根据两端序列设计一对特异 引物，通过PCR将其间微卫星序列扩增出来，利用电泳技术获得长 度多态性。
• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
分子杂交
分子杂交是通过各种方法将核酸分子固 定在固相支持物上,然后用放射性标记的 探针与被固定的分子杂交,经显影后显示 出目的DNA或RNA分子所处的位置。
Comparison of Southern, Northern and Western bolt hybridization