HE染色与免疫组化

HE染色与免疫组化实验步骤：
1)取材与固定
用小号解剖针挑取一定量本室培养之成螨，雌雄各半，用PBS洗去培养物后用擦镜纸包裹，常温浸没于Bouin固定液中24小时。

2)盐酸预处理
固定后的粉尘螨以PBS清洗后挑入4％的盐酸溶液中浸泡半小时。

3)琼脂预包埋
A.配臵 1.5％琼脂溶液，微波炉中加热至完全溶解，稍冷却后注入自制包
埋器。

B.将盐酸处理后的粉尘螨以PBS清洗后挑入琼脂溶液中，让其自然凝固。

C.解剖镜下修整琼脂块，形成边长与虫体对称轴相一致的长方体，虫体位
于琼脂块中央。

4) 脱水、透明与浸蜡
A.将预包埋的尘螨臵于50％乙醇中2小时（中间换液一次），然后臵于70％
乙醇中室温过夜。

B.第二天取出后依次入梯度乙醇脱水并以二甲苯透明：
80％乙醇I
（1小时）
80％乙醇II
（1小时）
95％乙醇I
（30分钟）
95％乙醇II
（30分钟）
100%乙醇I
（15分钟）
100%乙醇II
（15分钟）
乙醇：二甲苯（1：1）混合液
（10分钟）
二甲苯I、II透明
（共约15分钟）
镜下观察至虫体透明即可终止
c．将经透明的琼脂块取出，按如下流程浸蜡：
二甲苯：塑化石蜡（1：1）混合液
（10分钟）
塑化石蜡I、II、III（各一小时）
5) 塑化石蜡包埋
折叠大小适中的纸盒进行包埋。

用镊子轻轻夹取琼脂块，臵于纸盒底部并注满石蜡。

解剖镜下迅速摆正琼脂块的位臵，以便准确选取不同的方向进行切片。

待蜡块表面稍凝固后，连同纸盒一起沉入水中，使其迅速冷却。

6) 切片与展片
先对蜡块进行修整，使其边与琼脂块的边相平行。

使用手摇轮转式切片机，调整切片厚度为4-6μm，连续切片。

将恒温水浴箱加热至45℃左右，同时将已包被Poly-L-lysine的载玻片预热。

在载玻片上滴加少许温水，截取适当长度的蜡带，在载玻片上进行展片。

晾干后臵于60℃烤箱中2小时，使蜡带贴附牢固。

7) HE染色
按常规方法进行染色。

由于尘螨体积微小，在染色过程中容易掉片，而且各组织嗜染性不同，故在试验中对各步骤进行了一些调整，获得较满意的效果。

流程如下：
切片常规脱蜡至水化
Harry’s苏木素染色
20分钟
自来水冲洗
0.5％盐酸酒精分化
2～4秒
自来水洗并蓝化
5～10分钟
80％乙醇
5～10秒
0.5％伊红
1～3秒
95％乙醇I
1分钟
95％乙醇II
3～5秒
100%乙醇I、II
各1～2分钟
二甲苯I、II
各1～2分钟
中性树胶封固
8) 内源性酶的灭活与抗原修复：
常规脱蜡至水，30%H2O2 1份+蒸馏水9份混合,室温10分钟以灭活内源性酶。

蒸馏水洗3次。

将切片浸入0.02MPBS缓冲溶液（pH 7.2-7.6）,微波炉中高火加热至沸腾后断电，自然冷却。

热修复抗原也可选用0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）。

9）免疫组化
滴加5%BSA封闭液, 37℃ 30分钟。

甩去多余液体, 不洗；滴加适当稀释的一抗，4℃过夜（16h以上）。

PBS（pH 7.2-7.6）洗10分钟×3次。

抗体按都按1：100 稀释；滴加生物素化山羊抗兔IgG, 37℃ 30分钟。

PBS（pH 7.2-7.6）洗10分钟×3次；滴加试剂SABC, 37℃ 30分钟。

PBS（pH 7.2-7.6）洗10分钟×3次；DAB显色:使用DAB显色试剂盒(AR1022)。

取1ml蒸馏水,加试剂盒中A,B,C试剂各1滴,混匀后加至切片。

室温显色, 镜下控制反应时间。

也可自配显色剂显色。

蒸馏水洗涤。

苏木素轻度复染。

脱水,透明,封片。

显微镜观察。