茯苓菌丝体生物量、多糖含量的测定

茯苓菌丝体生物量、多糖含量的测定
蔡爱群;唐福斌;韩伟
【摘要】通过收集经液体培养的茯苓1号[Poria cocos(Schw.)Wolf.Strain 1]、茯苓5.78号(P.cocos Strain5.78)菌株菌丝体,并干燥后称重,比较其生物量产率;采用苯酚-硫酸法,分别测定茯苓1号、茯芩5.78号菌株菌丝体的多糖吸光度,从而测定出其多糖含量.结果表明,茯苓1号比茯苓5.78号生长速度快,生物量大;茯苓5.78号菌丝体的多糖含量比茯苓1号高.说明在相同的液体培养基条件下,茯苓1号、茯苓5.78号菌株的菌丝体生长速度不同;茯苓多糖含量也不一样.
【期刊名称】《湖北农业科学》
【年(卷),期】2016(055)020
【总页数】3页(P5279-5281)
【关键词】茯苓[Poria cocos(Schw.)Wolf.];液体培养;生物量;多糖
【作者】蔡爱群;唐福斌;韩伟
【作者单位】韶关学院英东生命科学学院,广东韶关512005;韶关学院英东生命科学学院,广东韶关512005;韶关学院英东生命科学学院,广东韶关512005
【正文语种】中文
【中图分类】S567.3+2
中药茯苓是多孔菌科（Polyporaceae）茯苓属（Wolfiporia Ryv.et Gilbn）茯苓［Poria cocos（Schw.）Wolf.］的干燥菌核炮制而成，具有渗湿利尿、健脾宁心等功效。

茯苓的化学成分主要有茯苓多糖、三萜、树胶、甾醇、蛋白质、维生素、
微量元素等［1］。

近年来，国内外众多学者对茯苓多糖进行了大量分析研究，发现其具有增强免疫能力、延缓衰老、抗病毒、抗肿瘤、降血糖等药理功效［2］，可广泛应用于食品、医疗保健等领域，因此市场需求量不断攀升。

然而人工种植茯苓存在许多技术处理难题，容易受气候和地域等条件限制，同时存在产量不高、生产周期长、病虫害控制带来的残留等问题，并且要消耗大量木材，因而饱受诟病。

用液体培养技术生产茯苓菌丝体、从茯苓菌丝体和发酵液中提取茯苓多糖等活性物质，可以很好地解决人工种植茯苓的替代问题，还能节省大量木材，这对于森林资源和生物多样性的保护有着重要的意义。

液体培养生产茯苓菌丝体可连续性地进行规模化工业生产，能大大缩短生产周期，降低生产成本［3］。

这对于茯苓多糖的测定、提取及开发意义重大，所以试验选择性地对茯苓1号、茯苓5.78号菌株菌丝体实施了生物量、多糖含量的测定，以期能进一步为茯苓药用品及保健品开发等提供技术支撑。

1.1 材料
1.1.1 茯苓菌株供试茯苓菌株为茯苓1号和茯苓5.78号，均引自安徽省岳西多生
食用菌专业合作社。

1.1.2培养基①斜面、平板培养基（PDA培养基）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15～20 g、水1 000 mL、pH自然。

②种子培养基［3］：葡萄糖20 g、蛋白胨4 g、酵母浸膏5 g、K2HPO41 g、KH2PO40.46 g、MgSO4· 7H2O 0.5g、水1000mL。

③发酵培养基［4］：葡萄糖30 g、蛋白胨4 g、酵母浸膏5.1 g、
K2HPO41 g、KH2PO40.46 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、水1 000 mL，pH 5.5。

1.1.3 试剂与仪器主要有石油醚、80%乙醇、5%苯酚、1 mol／L氢氧化钠、葡萄糖等。

仪器主要有无菌接种台、恒温培养箱、实验用冰箱、高压蒸汽灭菌锅、恒温培养用摇床、电子控温烘箱、紫外分光光度计、索氏提取器、布氏漏斗和抽滤瓶等。

1.2 试验方法
1.2.1 PDA培养基接种前检验将斜面培养基和平板培养基一起放在37℃恒温培养箱培养24 h，如无菌生长，方可使用。

1.2.2 母种的扩接将茯苓1号、茯苓5.78号母种试管中的菌丝体连带着培养基转接入不同斜面培养基的中央，接种好后，塞上胶塞，贴上写有接种时间、菌丝体种类的标贴，于恒温培养箱中26℃恒温培养。

约一个星期后，接种的茯苓1号、茯苓5.78号菌丝体长满试管，即可进行平板培养基的接种或放入4℃冰箱中保存。

1.2.3 平板培养基的接种先后从茯苓1号、茯苓5.78号斜面菌种中用接种钩分别挑起1块约1 cm× 1 cm菌块，接入装有平板培养基的不同培养皿的中央，每个菌种接5个平板，用封口膜封口，于26℃恒温培养箱中培养4～7 d，待菌丝长满培养皿。

1.2.4 种子培养基的接种及培养按种子培养基配方配制500 mL种子培养基，配好后，分装入10个250 mL三角瓶中，每个三角瓶50 mL，加塞，于高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20 min左右后取出，冷却至室温待用。

再分别用2个打孔器把生长于平板培养基外侧的茯苓1号、茯苓5.78号菌丝打孔，先后接种到不同的三角瓶种子培养基中，每瓶接种4块直径为1 cm的圆形菌块，贴上写有接种时间、菌丝体种类的标贴。

放于培养温度为26℃、转速为150 r／min的恒温摇床中进行摇瓶培养4 d［3，5］。

1.2.5 发酵培养基的接种与摇床培养先按配方配好发酵培养基1 000 mL，调节pH 至5.5，分装入250 mL三角瓶中，每瓶装液50 mL。

于高压蒸汽灭菌锅中121℃灭菌20 min，灭菌完毕后取出冷却至室温。

每瓶发酵培养基以10%的比例接入液体种子菌种，茯苓1号、茯苓5.78号各接种8瓶，贴标贴后放于培养温度为26℃、转速为150 r／min的恒温摇床中进行摇瓶培养［6］。

1.3 茯苓生物量测定
1.3.1 茯苓菌丝体生长速度的测定分别用打孔器打孔接种1块直径为1 cm的茯苓
1号、茯苓5.78号平板培养基菌种在直径为95 mm的平板中央，茯苓1号和茯
苓5.78号各接3个平板。

接种后，用封口膜将平板密封。

于26℃恒温培养，每
隔24 h测定菌块菌丝生长的直径，直至菌丝长满平板为止结束测量。

根据菌丝体生长直径大小的不同，比较茯苓1号、茯苓5.78号菌株菌丝的生长速度［4］。

1.3.2 茯苓菌丝体干重的测定收取的菌丝体发酵液用布氏漏斗和抽滤瓶真空抽滤。

抽滤过程中，用去离子水反复洗涤菌丝球5～6次，直到洗净菌丝球中残留的培养液为止，期间要注意滤液不能加得太满，以防滤液被抽入真空泵。

得到的菌丝球于烘箱中，60℃下烘至恒重，称量，以50 mL发酵液中菌丝体干重（g／50 mL）
作为计量单位。

然后以培养时间为横坐标，菌丝体生物量（干重）为纵坐标，绘制茯苓1号、茯苓5.78号菌丝发酵过程中菌丝体的生长曲线［3］。

1.4 茯苓多糖含量的测定
1.4.1 对照品溶液的配制精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖50 mg，置50 mL
容量瓶中，用去离子水定容至刻度，再用移液管吸取5 mL，置另一个50 mL容
量瓶中，加去离子水稀释至刻度，即得浓度为0.100 mg／mL的葡萄糖标准溶液。

1.4.2 标准曲线的绘制精密量取葡萄糖标准液0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置于15 mL试管中，编号为1～7，都加水至1.0 mL，再加入5%苯酚
溶液1.2 mL，待充分混匀后，迅速加入浓硫酸7.0 mL；再充分混匀后，置45℃
水浴中30 min，然后移至冰水浴中30 min。

取出后，在紫外分光光度计上于
490 nm处测其吸光度值［7］。

以标准葡萄糖含量（mg）为横坐标，以吸光度
值为纵坐标，即得到一条标准曲线（图1），由此得回归方程。

1.4.3 样品茯苓多糖的提取用索氏提取器提取样品的茯苓多糖，茯苓多糖采用文献［7］的苯酚－硫酸比色法测定。

用紫外分光光度计，在490 nm处测其吸光度值，根据回归方程计算茯苓1号、茯苓5.78号菌丝体多糖的百分含量。

2.1 茯苓生物量
2.1.1 茯苓菌丝体生长速度的测定和分析茯苓菌丝体生长速度测定结果见图2。

由
图2可见，将活化的茯苓1号、茯苓5.78号同时采用打孔器接种到平板上培养后，其菌丝体生长速度是茯苓1号比茯苓5.78号快，且生长更旺盛，说明茯苓1号比茯苓5.78号更适应液体发酵培养。

2.1.2 茯苓菌丝体生物量（干重）的测定和分析茯苓菌丝体生物量测定结果见图3。

从图3可见，茯苓菌丝体经液体发酵培养后，随着培养时间的延续，茯苓菌丝体
生物量逐渐增加，培养8 d时，茯苓1号菌丝体生物量最大，为0.310 g／50 mL；当生长到12 d时，茯苓1号菌丝球已经开始自溶，生物量转为下降趋势。

茯苓
5.78号的生长则稍微缓慢一点，当培养时间到10 d时，生物量达到最大值，为0.305 g／50 mL；继续生长到14 d时，茯苓5.78号菌丝球自溶，生物量转为下降趋势。

2.2 茯苓多糖含量
样品溶液多糖含量的测定结果表明，茯苓1号、茯苓5.78号菌丝体中多糖含量都很高，茯苓1号菌丝体多糖含量达到82.4%，茯苓5.78号菌丝体多糖含量达到86.2%。

与李真鹍等［7］报道的发酵茯苓菌丝体中多糖的含量不低于55%，最高可达87%的结果相差不大。

目前，传统的茯苓栽培法仍是茯苓生产的主要方式，但该方式受气候和地域等条件限制，存在产量不高、生产周期长等不足。

而用液体发酵培养方法生产茯苓，可不受气候、地域、病虫害等条件的制约，生长周期短、产量大，易于实现工业化生产，具有广阔的开发应用前景［8］。

茯苓多糖是近年来研究较多的一种真菌多糖，其质量约占整个茯苓菌核干重的70%～90%［9］。

由茯苓1号、茯苓5.78号菌丝体多糖含量的比较可推测出，茯苓多糖含量可能与发酵时间有关，在发酵终点内，发酵时间越长，多糖的产量越高。

茯苓1号、茯苓5.78号菌丝体多糖含量都超过了80%，具有很好的开发前景，可以通过液体培养技术大量生产茯苓1号、茯苓
5.78号菌丝体，再用菌丝体来提取茯苓多糖，加工成营养保健品或生物药剂等终
端产品，从而造福人类。

目前多数真菌发酵主要依据菌丝体的产量、培养液中的pH、还原糖、含氮量、培养液的颜色变化以及菌丝球的形态变化等因素来判断［10］，所以在茯苓菌丝体
液体发酵过程中，发酵终点的判断还需深入研究；另外本试验的茯苓菌丝体产量低于文献报道，需进一步作培养基优化、培养条件优化的正交设计或响应面试验来探究。

【相关文献】
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［2］林燕，黄嘉鹏.茯苓有效成分的药理作用研究进展［J］.中外健康文摘，2010，7（9）：271－272.
［3］李羿，万德光，裴瑾，等.茯苓液体发酵条件的研究［J］.成都中医药大学学报，2005，28（1）：52－55.
［4］胡国元，游慧珍，董兰兰，等.茯苓菌丝体液体培养条件研究［J］.武汉工程大学学报，2010，7（7）：1－4.
［5］胡国元，李伟伟.富硒金针菇深层培养研究［J］.湖北民族学院学报，2002，18（2）：21－23.
［6］王伟霞，李福后，陈立国.茯苓菌丝体液体培养条件研究［J］.食用菌，2006（2）：6－8. ［7］李真鹍，段启，李改云.茯苓多糖含量测定方法研究［J］.中兽医医药杂志，2011，26（5）：26－27.
［8］李羿，李晨，游元元，等.茯苓发酵罐补料液体发酵的研究［J］.化学研究与应用，2011，23（7）：847－851.
［9］张敏，高晓红，孙晓萌，等.茯苓的药理作用及研究进展［J］.北华大学学报（自然科学版），2008，9（1）：63－68.
［10］陶文沂，敖宗华，许泓瑜，等.药食用真菌生物技术［M］.北京：化学工业出版社，2007.59－60.。