慢病毒包装和应用实践

慢病毒包装和应用实践
目录
第3代慢病毒包装载体
转移质粒
（表达载体）
包装质粒 包装质粒
包装质粒
需全新构建，在MCS （多克隆位点）加入目的序列
为产生高滴度的病毒颗粒，需要
利用转移质粒和包装质粒同时共
转染细胞 无需全新构建，一次提取后分装
慢病毒包装转移质粒的结构介绍----对照质粒
◆LTR：长末端重复序列（long terminal repeat）反转录病毒的基因组的两端各有一个长末端重复序列
(5'—LTR和3'—LTR)，不编码蛋白质，但含有启动子，增强子等调控元件。

参与前病毒进入宿主基因组，调控病毒基因的表达。

◆Psi：衣壳包装序列
◆RRE：Rev反应元件
◆cPPT ：中央聚嘌呤—中央末端序列
◆WPRE：突变的土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件
◆U3PPT：多聚腺苷酸化相关序列
●Promoter：启动子序列
●GFP：绿色荧光蛋白
慢病毒包装转移质粒的结构介绍
CMV：Cytomegalovirus promoter 来源于巨细胞病毒的启动子
EF1α: 延伸因子1α启动子
MCS：multiple cloning site 多克隆位点
PGK：phosphoglycerate kinase 1 promoter 磷酸甘油酸激酶基因启动子Puro：嘌呤霉素抗性基因
2A：自剪切肽
IRES：内部核糖体进入位点序列（Internal ribosome entry site）。

慢病毒包装转移质粒的结构介绍----启动子
慢病毒包装转移质粒的结构介绍----多克隆位点
◆多克隆位点含有限制性内切酶切割位点
◆可用相应的酶将环状载体线性化，形成粘性末端或平末端
◆这些酶切位点在载体上一般有且只有一个
◆传统的载体构建方法需要依赖于对这些位点的切割
IRES
：(internal ribosomal entry sites)内部核糖体结合位点：一段较短的RNA序列（约150-250BP），这类RNA序列能折叠成类似于起始tRNA的结构，从而介导核糖体与RNA结合，起始蛋白质翻译。

由PGK启动的mRNA 转录，核糖体能分别结合到编码了EGFP和Puro蛋白的序列上，将两种蛋白翻译出来。

（同一条mRNA，分别翻译成蛋白）
(1)双向或多启动子分别单独启动多个基因表达 ;
(2)单一启动子启动多个基因以融合蛋白形式表达 ;
(3)多个质粒共转染及多病毒载体共感染 ;
(4)在不同基因之间插入内部核糖体结合位点 (internal ribosomal entry sites,IRES) ;
(5)在不同基因开放阅读框中间插入蛋白酶剪切位点
介导多个基因同时成功表达载体构建技术
2A序列自剪切肽 (2A self-cleaving peptides)：该序列一般为18-22氨基酸的肽片段，能够在细胞内通过自我剪
切将不同的基因编码蛋白释放出来。

（同一条mRNA，一起翻译成蛋白后再切割）
确定基因名称或编号，以及物种（我们以FoxQ1基因为例，物种是人）
打开NCBI数据库，需要找到目的基因并下载序列，选择在栏目内找到“Nucleotide”，搜索栏内填入“FoxQ1”，点击“search”。

找到目标序列后，点击序列前面的“小方格”，将其选定。

然后下载序列。

选定后，点击页面右上角的“Send to”，选择“file”，再将format选择为“FASTA”格式，点击“Create file”，将序列下载到自定的文件夹内。

中洪博元生物丨专注模式动物只做真实数据
转移载体的构建----目的基因片段的获得
下载的序列为FASTA格式，可用写字板打开或者专业软件，如DNA star和SnapGene 打开。

PCR扩增目的序列，长片段可以采用overlapping PCR
或者合成这段序列，用于载体构建
◆需要在片段两端设计用于酶切克隆的位点和线性化的载体相匹配
◆如果使用In-Fusion 等方法，还需要设计两段和载体互补的序列
转移载体的构建----载体的线性化
◆单酶切（切割之后形成互补切口）
1.需要做载体的去磷酸化
2.需挑选正向连接的克隆子
◆双酶切（切口序列通常不同），避免使用到同尾酶
◆载体线性化之后跑胶纯化回收，提高克隆筛选效率
◆使用一些非常规技术： Gateway Cloning, In-Fusion
等
转移载体的构建----片段连接和转化
◆片段和载体的连接：
将酶切后的骨架载体和酶切回收到的目的片段利用T4 DNA连接酶按一定比例过夜连接。

◆连接产物的转化和筛选
转化的具体操作步骤如下：
（1）取冰上溶解的100 μL 感受态细菌至超净工作台，加入10 μL连接产物，轻柔混匀，冰浴 30 min。

（2）转入42℃热激 90s，迅速放于冰上 1 min。

（3）加入400μL LB培养液，放于37℃摇床150 rpm/min 复苏50 min。

（4）8000 rmp离心2 min，去除部分上清，剩余沉淀轻轻悬起，涂布于含有100 μg/mL Amp 的LB平板上，37℃培养16h。

（5）挑取平板上克隆做菌落PCR验证，将阳性克隆接种于LB培养液（含有100 μg/mL Amp）中，37℃培养22h，用质粒提取试剂盒提取载体。

转移载体的构建----阳性克隆的确定
对目的片段和两侧载体序
列进行测序，
确定其序列和多克隆插入
位点没问题。

菌落PCR验证
从酶切位点两侧设计引物，
PCR产物长度和预期相符
包装慢病毒所用细胞的培养
◆
慢病毒包装通常在293T细胞中完成
◆293T是HEK（human emborynic kidney，人源胚胎肾细胞）细胞的变种，是由人的胚胎肾细胞经转染腺
病毒E1A（抑制pRb)后得到的可以体外增殖的细胞系。

HEK细胞再经SV40大型T抗原转染（抑制p53)后得到HEK293T。

含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以在该细胞内复制。

◆293T使用磷酸钙转染法即可获得很好转染效果，实现瞬时表达
◆293T对生长密度较敏感，传代次数多之后易突变。

状态较差时（细胞边界模糊，易脱落）
正常状态
细胞转染
Lipofectamine 3000 转染流程
●可在含血清培养基中实现转染
●可无需做换液
1.细胞培养至60%覆盖度，提前一天换液
2.根据转染试剂说明书制备质粒-脂质体复合物
◆使用无血清(无抗)培养基（Opti-MEM）
◆注意质粒的比例:（transfer vector:Packing mix= 1:1;
pMDL:VSVG:REV=5:3:2）
◆需要孵育一定时间
3.将复合物逐滴加入培养基中并混匀
4.可在6小时之后做一次换液（可选）
病毒液收集和纯化要点：
◆细胞培养至48小时，收集一次病毒上清液，给细胞换液，再培养24小时后收集一次上清。

◆如果条件不允许，病毒液可以保存在4℃，2-3天之后再浓缩，但切勿冻融
◆超速离心注意事项：
1.离心管的平衡，误差在0.1克内
2.离心管的密封
3.离心管需要用培养基补满，避免高速离心时变形
◆也可用病毒浓缩试剂按说明书完成浓缩（如使用PEG8000）
◆超滤管也可以起到纯化和浓缩的作用
◆浓缩完的病毒液分装冻存，取一管出来做滴度测试，其余勿反复冻融。

慢病毒滴度测定方法
◆
p24蛋白ELISA 检测法或基于胶体金技术的验毒棒
流式分析，检测荧光阳性的细胞数
◆◆◆ qPCR 定量分析转染细胞中病毒基因组整合的片段Control
Lenti-GFP
示例：携带有GFP 基因的慢病毒转染细胞后，在宿主内能表达荧光蛋白，通过流式分析仪能检测出接种不同病毒量的细胞中荧光信号呈阳性的数目，从而计算病毒滴度
慢病毒的效果验证
◆通常在病毒转染48-72小时后能检测到明显的分子水平变化：mRNA转录水平，蛋白翻译水平
◆细胞的表型变化视具体的蛋白功能而定：增殖、迁移、侵袭、凋亡、周期等
◆可能出现的情况：
1.若转染细胞后无荧光信号，但平行的293细胞有信号：
可能是目的细胞不易感。

解决思路：适当加大病毒量，利用低速离心转染法（400 X g, 2h）
2.目的细胞有荧光但无目标分子的检测信号（qPCR和WB）：慢病毒转染没问题，绿色荧光蛋白启动子正常工作。

解决问题思路：A. 先确认目的蛋白和绿色荧光蛋白是否位于同一启动子下？
P CMV MCS IRES GFP
pLV-CMV-IRES-GFP
B.包装病毒前先做启动子活性筛选能提高预期成功率
C.过表达蛋白是否对细胞有毒性，是否易降解
基因敲降的一些问题
基因敲降实验是基于RNA干扰原理：
1.小RNA序列的特异性：能专一地打到靶基因是个概
率问题
2.小RNA的分子作用机制：促进靶基因mRNA降解还是
抑制蛋白翻译
3.目的细胞中反馈机制：核糖体翻译效率会加强出现
负反馈，反而上调。

4.检测结果的判读建议：以蛋白的变化趋势为准
中洪博元生物丨专注模式动物只做真实数据
基因敲除的有效工具：CRISPR/Cas9系统 基因突变的几种情况： ◆插入或缺失3N 序列：导致蛋白氨基酸增多或缺失◆个别碱基发生置换：不影响蛋白序列或仅个别氨基酸错误 ◆移码突变：从突变位置开始发生氨基酸错误◆翻译提前终止： 出现截短的蛋白(Non-homologous end joining, NHEJ) 非同源性末端接合导致基因缺失或插入：出现移码突变或蛋白翻译提前终止
Homology directed repair (HDR) 同源修复（以等位基因替代）导致基因内碱基替换。