一种高灵敏检测贝类中大田软海绵酸的可抛式核酸适配体传感器

一种高灵敏检测贝类中大田软海绵酸的可抛式核酸适配体传感器
作者：陈佳琦吴海燕张旭志郑关超孙晓杰郭萌萌谭志军翟毓秀牟海津
来源：《分析化学》2019年第06期
摘;要;以能够特异性识别大田软海绵酸（Okadaic acid，OA）的核酸适配体作为识别探针，先利用磁力吸附将核壳型纳米金磁微粒（Fe3O4@Au）固定在丝网印刷金电极（Screen-printed gold electrode，SPGE）的表面，然后利用AuS键固定核酸适配体，构建了可抛式核酸适配体传感器，用于贝类中OA的高灵敏测定。

采用电化学阻抗谱进行测试，利用核酸适配体与OA结合前后工作电极表面电子传递阻抗值的变化量与OA浓度对数值之间的线性关系，实现贝类中OA的定量检测。

此传感器制备简单，采用Fe3O4@Au修饰传感界面，通过增大工作电极的比表面积提高核酸适配体的组装量，提高了方法的灵敏度;将核酸适配体作为识别探针，相比抗体的使用大大降低了方法成本;一次性可抛SPGE的应用，省去传统电极使用前必需的繁杂抛光过程。

采用此传感器进行贝类中OA的检测，线性范围为1～800 μg/kg，检出限为1 μg/kg;回收率在92.0%～118.6%范围内，相对标准偏差为5.8%～11.6%。

本方法简便高效且重现性良好，可实现大批量样品的筛查与定量分析。

关键词;大田软海绵酸;核酸适配体传感器;电化学阻抗谱;丝网印刷金电极;高灵敏检测
1;引言
大田软海绵酸（Okadaic acid，OA）是腹泻性贝类毒素（Diarrhetic shellfish poisoning，DSP）的主要致毒组分，由利马原甲藻及部分鳍藻等产毒微藻产生，经双壳贝类滤食性摄入后富集在消化腺内[1]。

OA可引发误食者恶心、呕吐、腹泻;对细胞质内蛋白磷酸酶的活性有强烈的抑制作用[2]，影响正常的细胞活动;甚至对人类细胞具有直接的毒害作用，干扰DNA的修复过程[3]，改变基因的表达，诱导肿瘤形成[4]。

为消除毒素对自身的毒害作用，贝类可通过复杂的生化反应将部分高毒性游离态的OA转化为形态各异的低毒性酯化态衍生物[5]。

此外，因OA具有脂溶性和热稳定性，在加工过程中很难通过常见的加工技术将其去除，甚至可能因贝类脱水及酯化态毒素向游离态的转化，从而导致毒素的毒性增强[6]。

为加强贝类安全的前端防控，欧盟现行法规规定双壳贝类可食性组织中DSP含量不得超过160 μg/kg（以OA计）[7]，为进一步降低食用风险，欧盟食品安全局根据风险评估结果拟将其降低至45 μg/kg[8]。

我国国标NY 5073-2006规定其不得检出[9]。

由于伦理道德等原因，欧盟指令（EC）
No.15/2011规定小鼠生物法作为官方标准方法仅限于2014年底前使用，以液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）作为取代方法，并鼓励建立免疫分析等新型检测方法作为补充方法[10]。

电化学生物传感器因其灵敏度高、快速便携等优势在检测领域得到广泛关注，核酸适配体也因其能与目标物如重金属离子[11]、毒素[12]、抗生素[13]或病毒[14]等高亲和力、高特异性结合的特点[15]，在电化学生物传感器的研制中得到广泛应用[16]。

与传统电极相比丝网印刷
电极（Screen-printed electrode，SPE）具有方便使用、溶液消耗少、三电极体系集成于一体以及使用时不需额外抛光处理等优势[17， 18]。

同时， SPE具有用后可抛的特点，避免了因基质成分或待测物在电极表面的吸附而造成的电极污染或钝化现象[19]。

基于SPE建立的电化学生物传感器具有灵敏稳定、易于小型化的优势[20]。

本研究以丝网印刷金电极（Screen-printed gold electrode，SPGE）为基底电极，研制了可抛式核酸适配体传感器，并引入核壳型纳米金磁微粒（Fe3O4@Au）[21]，以提高方法的灵敏度。

由于贝类体内的OA总量由游离态毒素及酯化态衍生物共同组成，而目前的检测方法通常仅针对游离态OA进行检测[22，23]，故可能会因低估毒素的含量而导致食用风险[24]。

本方法以自行研制的电化学生物传感器为检测手段，同时在贝类样品前处理过程中增加碱性水解步骤，将OA的酯化态衍生物转化为游离态OA[25]，实现了贝类体内OA总量的高灵敏检测。

2;实验部分
2.1;仪器、试剂与材料
CHI660D电化学工作站（上海辰华公司）;T18 basic型均质机（德国IKA 公司）;KQ-300E 型超声波提取仪（昆山市超声仪器有限公司）;Himac CR 22GⅡ型高速离心机（日本Hitachi公司）;N-EVAPTM112型氮气吹扫仪（美国Organomation公司）;Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）;220BT丝网印刷金电极（SPGE，包括金工作电极（Φ=4.0 mm）、对电極和银参比电极，西班牙DropSens 公司）。

大田软海绵酸（Okadaic acid，OA）、鳍藻毒素-1（Dinophysistoxin-1，DTX-1），纯度≥95%（台湾Algalchem公司）;鳍藻毒素-2（Dinophysistoxin-2，DTX-2，CRM-DTX2-b，（3.8±0.2）μg/mL）、蛤毒素-2（Pectenotoxin-2，PTX-2，CRM-PTX2-b，（4.4±0.13）
μg/mL）、虾夷扇贝毒素（Yessotoxin，YTX，CRM-YTX-c，4.3 μmol/L）、DSP阳性贻贝质控样品（CRM-DSP-Mus-c，OA总含量2.4 mg/kg），均购于加拿大国家海洋研究中
心;GoldMag纳米金磁微粒（Fe3O4@Au，30 nm，5 mg/mL，西安金磁纳米生物技术有限公司）;PBS缓冲液试剂片（Phosphate buffered saline tablet）、 6-巯基-1-己醇（6-Mercapto-1-hexanol，MCH）; K3[Fe（CN）6]、K4[Fe（CN）6]·3H2O、KCl（美国Sigma公司）;甲醇（HPLC级，德国Merck公司）; 5'端巯基修饰核酸适配体（Aptamer，5'-SH C6-GGT CAC CAA CAA CAG GGA GCG CTA CGC GAA GGG TCA ATG TGA CGT CAT GCG GAT GTG TGG-3'）由上海生工生物工程股份有限公司合成;其它未作特殊说明的试剂均为分析纯。

实验用水为超纯水（18.2 MΩ· cm）。

实验所用牡蛎、贻贝和扇贝样品于2018年7月购自青岛市水产品批发市场，经LC-
MS/MS方法[26]检测为OA阴性。

样品洗净沥水，去壳匀浆后于20℃冷冻保存。

2.2;溶液的配制
核酸适配体溶液（5 μmol/L）和MCH溶液（1 mmol/L）均由PBS缓冲溶液（10 mmol/L，pH 7.4）配制。

OA标准溶液：以PBS缓冲溶液稀释OA工作液（甲醇配制，1 μg/mL），配制成浓度分别为0.1、0.5、1、5、10、50和80 ng/mL的系列标准溶液。

Fe3O4@Au混悬液：使用前用PBS缓冲溶液清洗2次后，稀释至浓度为1 mg/mL。

检测液用PBS缓冲溶液配制，含5 mmol/L K3[Fe（CN）6]、5 mmol/L K4[Fe（CN）6]和0.1 mol/L KCl。

2.3;样品的前处理
称取2 g匀浆样品，用18 mL甲醇分两次进行毒素提取，涡旋振荡2 min，8000 r/min离心5 min，合并两次上清液，以甲醇定容至20 mL。

准确移取1 mL提取液，加入125 μL 2.5 mol/L NaOH混匀后密封，于76℃下孵育40 min。

待溶液冷却至室温，加入125 μL 2.5 mol/L HCl溶液中和，氮吹近干，再加入1 mL PBS缓冲溶液复溶，涡旋混匀，待测。

2.4;可抛式电化学核酸适配体传感器的构建
丝网印刷金电极（SPGE）使用前置于0.5 mol/L H2SO4溶液中进行预处理，在0～1.25 V 电位范围内以0.1 V/s速率采用循环伏安法（Cyclic voltammetry，CV）扫描5 min，以提高传感界面的粗糙度，利于其功能化修饰[27]。

将SPGE用超纯水冲洗并吹干后，在其工作电极背面对应处固定一个直径4 mm的圆形磁铁，在工作电极表面滴加10 μL 1 mg/mL Fe3O4@Au混悬液，待Fe3O4@Au固定后，滴加10 μL 5 μmol/L核酸适配体溶液，置于湿盒中反应过夜。

用超纯水冲洗后，在工作电极表面滴加10 μL 1 mmol/L MCH溶液反应1 h，以封闭多余的吸附位点，即完成传感器的制备。

2.5;测试方法
在传感器工作电极表面滴加10 μL OA标准溶液或样品溶液，反应45 min，用超纯水冲洗后，在检测液中进行电化学阻抗谱（Electrochemical impedance spectroscopy，EIS）测试，频率范围0.1～10000 Hz，振幅0.01 V，初始电位0.23 V。

记录标准溶液或样品溶液反应前后的阻抗值，进行定量分析。

3;结果与讨论
3.1;传感界面的构建及电化学表征
可抛式核酸适配体传感器的构建及检测原理如图1所示。

适配体序列参考文献[28]，在能够特异性结合OA的核酸适配体的5'端修饰巯基，通过AuS键将核酸适配体直接固定或通过核壳型纳米金磁微粒（Fe3O4@Au）固定在传感界面。

无OA存在时，适配体的空间结构比较松散，阻碍电子在传感界面的传递，导致传感器阻抗值升高;当OA存在时，与核酸适配体结合
后空间结构变得紧密，为电子的传递提供更多的空间，阻抗值下降。

根据传感器反应前后阻抗值的变化量与OA浓度之间的关系实现对毒素的定量检测。

采用CV和EIS对SPGE的修饰过程进行表征，CV结果如图2A所示，电压范围0.3～0.5 V，扫描速率为0.1 V/s。

图2B为电化学阻抗谱的Nyquist图，其高频区的半圆直径对应电极表面的电子传递阻抗Ret。

裸电极表面电子可以自由传递（Ret=41.06）。

核酸适配体的结合增加了电极表面的传质阻力，
导致Ret值显著上升（865.90 Ω）;MCH的封闭进一步阻碍电子的转移，Ret值继续增大（1498 Ω）;当OA与核酸适配体特异性结合后，Ret值下降（1085 Ω），说明二者的结合促进了传感界面电子的传递。

这是因为核酸适配体结合目标物后的空间结构更加紧密，使Ret值降低，与文献报道结果类似[29，30]。

为提高传感界面核酸适配体的组装量，在传感器的构建中引入核壳型纳米金磁微粒
（Fe3O4@Au）以增大SPGE工作电极的比表面积。

当未修饰Fe3O4@Au时，SPGE在核酸适配体固定前后的ΔRet为418.74 Ω，而在修饰Fe3O4@Au后，ΔRet值增至865.90 Ω，表明
Fe3O4@Au的引入可提高传感界面核酸适配体的组装量。

3.2;实验条件的优化
3.2.1;核酸适配体浓度的优化;传感界面核酸适配体的组装量可影响目标物的结合量，进而影响方法的检测性能。

对核酸适配体溶液浓度进行了优化。

分别在已固定Fe3O4@Au的传感界面滴加浓度為1、2、5和10 μmol/L的核酸适配体溶液，反应过夜后，进行EIS测试。

如图3所示，随着适配体浓度的增大，ΔRet随之增大，当适配体浓度为5 μmol/L时，ΔRet达到最大值，随后趋于稳定，表明核酸适配体的结合量已达到饱和。

因此，在后续实验中采用5
μmol/L核酸适配体溶液进行电极组装。

3.2.2;目标物孵育时间的优化;目标物的孵育时间也是影响核酸适配体传感器性能的因素之一。

考察了不同孵育时间时，传感器与OA结合前后的ΔRet值。

如图4所示，随着孵育时间的延长，ΔRet增大，当时间达到45 min以后，ΔRet趋向平稳，因此选择45 min作为孵育时间。

3.3;传感器的分析性能
测定不同浓度的OA标准溶液在适配体传感器上的阻抗响应值，以OA与电极反应前后
ΔRet值为纵坐标， OA溶液浓度对数值为横坐标，绘制标准曲线。

由图5可见，ΔRet与OA 浓度（0.1～80 ng/mL）对数值呈线性关系，线性回归方程为y=189.12lnx+752.59
（R2=0.9976），检出限为0.1 μg/L（S/N=3），空白样品基质与PBS缓冲溶液的响应相当，表明贝类基质对传感器测定基本无干扰，应用于实际贝类样品检测时最低检出浓度为1 μg/kg，与LC-MS/MS方法[26]相比降低了一个数量级，定量范围为1～800 μg/kg。

而传感界面无
Fe3O4@Au修饰时，传感器的线性范围为5～500 μg/kg，实际检测时的最低检出浓度为5
μg/kg。

上述结果表明，传感器构建过程中Fe3O4@Au的引入可显著提高检测方法的灵敏度，并扩大了线性范围。

以OA测试结果为阴性[26]的牡蛎、贻贝和扇贝作为空白基质，分别添加3个浓度的OA 标准溶液（10、100和500 μg/kg），采用本方法测定。

加标回收率及精密度结果见表1。

OA 的平均回收率为92.0%～118.6%，相对标准偏差（RSD）小于12%，表明本方法具有较高的回收率和良好的精密度。

为验证核酸适配体传感器的重现性，分别制备相同批次和不同批次的电极，测定其对10 ng/mL OA溶液的响应。

传感器批内精密度（RSD）为10.0%（n=5），传感器批间精密度为13.2%（n=5），表明此传感器的制备和检测重现性性良好。

3.4;特异性实验
OA与其衍生物鳍藻毒素DTX-1和DTX-2的分子结构非常相似，而YTX和PTX-2也因结构类似而曾被归为腹泻性贝类毒素[31]。

分别配制浓度为10 ng/mL的DTX-1、DTX-2、YTX 和PTX-2进行测试，以考察传感器的特异性。

结果（图6）表明，研制的传感器对OA具有高度特异性，对DTX-1、DTX-2、YTX和PTX-2的响应值接近PBS缓冲溶液的测试背景值，表明此传感器能够专一性识别OA，其它毒素的存在不干扰OA的检测。

3.5;实际样品分析
采用LC-MS/MS方法[26]和构建的核酸适配体传感器测定了实际贝类样品和CRM-DSP-Mus-c阳性质控样品，结果见表2。

7个贝类实际样品中，两个样品中检出OA，但含量均低于欧盟限量水平（160 μg/kg）[7]。

两种检测方法对CRM-DSP-Mus-c质控样品和阴性样品的测试结果较为一致。

4;结论
以OA特异性核酸适配体为识别探针，制备了一种可抛式核酸适配体传感器，用于贝类中OA的高灵敏检测。

与基于抗原-抗体反应原理的电化学免疫传感器相比，核酸适配体的合成和使用更加简便、价廉，传感器的成本大幅降低;通过引入Fe3O4@Au，提高了方法灵敏度，扩大了线性范围; 一次性可抛SPGE的使用，免去了传统电极繁杂的抛光过程，同时避免了因基质成分或待测物在电极表面的吸附而造成的电极污染、钝化或干扰现象;测试方法操作简单。

本方法可作为一种新型的快速检测手段用于贝类样品中OA的日常监测，实现对贝类样品的高灵敏筛查。

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