免疫印迹法（PDF）

免疫印迹法
免疫印迹法（immunobiotting test，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），因与Southern早先建立的检测核酸的印迹方法 Southern blot 相类似，亦被称为Western-blot。

免疫印迹法分三个阶段进行。

第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。

此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。

第二阶段为电转移：将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min 转移即可完成。

此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。

第三阶段为酶免疫定位：将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。

常用的HRP底物为3，3’-二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。

阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。

本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。

在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验。

抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒，可方便地在实验室中供检测用。

根据出现显色线条的位置可判断有无针对病毒的特异性抗体。

一． SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
基本原理是聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体acr聚合成长链并通过双功能化合物甲叉双丙烯酰胺Bis交联而成的三维网状结构凝胶。

聚丙烯酰胺凝胶的机械性、弹性、透明度、粘着度取决于凝胶的总浓度，总浓度越大，平均孔径越小，机械强度越强。

T是Acr与Bis的总百分浓度，C是Acr：Bis的重量百分比，T恒定，C为4%时，有效孔径最小，C大于或小于4%时，有效孔径均变大；C恒定，T增加，有效孔径降低。

聚合过程由TEMED(四甲基乙二胺)和过硫酸铵激发。

阴离子去垢剂SDS能破坏蛋白质中的氢键和疏水键，按一定比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷量，掩盖了各种蛋白质分子间的天然电荷差异；加入巯基乙醇使电泳的迁移率不再爱原有分子形状的影响。

蛋白质的迁移率将主要取决于其分子量的大小
基本步骤：
1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)
可以使用适当的裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。

对于某些特定的亚细胞组份蛋
白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，用SDS上样缓冲液，裂解能力强，能提取细胞总蛋白，可用来检测多种蛋白，包括磷酸化蛋白。

另外，常用的还有非离子去垢剂缓冲液裂解法，低渗缓冲液裂解法。

可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提.
2.蛋白质浓度测定：
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。

根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。

因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。

更方便的方法是选用成套的裂解液和定量试剂盒测定蛋白质。

如果浓度过高，可按比例稀释，读出蛋白浓度后，再折算回原样品浓度。

3. 电泳(Electrophoresis)
配制SDS-PAGE凝胶，在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

例如2X 或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

注意：Acr和Bis单体对神经系统和皮肤有毒性作用，TEMED对粘膜和上呼吸道组织及皮肤有很大的破坏作用
4．电泳结果检查：
如果要做Western Blot，是否需要先检查电泳结果呢？能先看看结果如何再进行下一步转膜当然最好。

考马斯亮蓝使用简便快速，可以分辨1ug左右的条带，是最经济通用的蛋白PAGE胶电泳染色方法。

银染操作复杂一些但分辨率高很多，可以分辨2-5ng蛋白。

可是由于考马斯亮蓝染色或者银染经过固定不可逆结合，会干扰后面的Western Blot实验，很多人会选择省略掉这一步——同样的样品跑2块胶，一块染色一块转膜，一般也可以说明问题。

如果想在转膜前看看电泳结果，你需要用SYPRO Tangerine——这种金色荧光蛋白染料灵敏度很高——检测4ng-8ng蛋白，接近银染，但使用非常简单，最重要的是由于不用酸碱或者有机溶剂固定，不干扰蛋白活性，特别适合Western转膜前的染色，或者非变性胶的活性蛋白的检测（比如染色后还需要在胶上进行活性检测等等）。

可惜SYPRO Tangerine价格挺贵的，500ul（5000x）要2000元，即使很节约的用只够大概100多次呢。

所以最经济实惠的方法是：丽春红S，直接染色转移膜，检测转膜效果，充分脱色后不干扰Western结果。

丽春红的检测灵敏度和考马斯亮蓝差不多。

二. 电转移：
通常有两种方法：毛细管印迹法和电泳印迹法。

毛细管法转移效率较低。

现在多用电泳印迹法，这种方法是用有空的塑料盒有机玻璃板将凝胶和硝酸纤维素膜夹成“三明治”状，而后浸入两个平行电极中间的缓冲液中进行电泳，选择适当的电泳方向就可以使蛋白质离开凝胶结合在硝酸纤维素膜上。

转移膜的选择：Western Blot印迹常用的转移膜主要是硝酸纤维素膜（Nitrocellulose Blotting Membranes，NC）和偏二氟乙烯(PVDF膜,Polyvinylidene-Fluoride），此外也有用尼龙膜、
DEAE纤维素膜做蛋白印迹。

膜的选择要根据a.膜与目的蛋白分子的结合能力（也就是单位面积的膜能结合蛋白的载量），以及膜的孔径（也就是拦截蛋白的大小）；b.不影响后续的显色检测（也就是适和用于所选的显色方法，信噪比好）；c.如果后继实验有其他要求，比如要做蛋白测序或者质谱分析，还要根据不同目的来挑选不同的转移膜。

几种膜的特点：
NC膜 尼龙膜 PVDF膜 灵敏度和分辨率 高 高 高
背景 低 较高 低
结合能力
80－110 ug/cm2 >400 ug/cm2 125－200 ug/cm2（适合于SDS存在下与蛋白质的结合）
材料质地 干的NC膜易脆 软而结实 机械强度高 溶剂耐受性 无 无 有
操作程序 缓冲液润湿,避免气
泡
缓冲液润湿 使用前100%甲醇润湿
检测方式 常规染色，可用放射
性和非放射性检测
不能用阴离子染料
常规染色，比较于NC膜，
可用考马斯亮蓝染色，可用
于ECL检测，快速免疫检测
适用范围 0.45um 一般蛋白
0.2um一分子量小于
20kD蛋白0.1um一分
子量小于7kD蛋白
低浓度小分子蛋白、酸性蛋
白、糖蛋白和蛋白多糖(主
要用在核酸检测中)
糖蛋白检测和蛋白质测序
价格 价格较便宜 便宜 较贵
1. 硝酸纤维素（NC）膜
硝酸纤维素膜是蛋白印迹最广泛使用的转移介质，其优点是对蛋白有结合能力强，适用于各种显色方法，包括同位素，化学发光（Luminol类）、常规显色、染色和荧光显色；背景低，信噪比高；使用也很简便，不需要甲醛预处理，只须在无离子水面浸润排出膜内气泡，再在电泳缓冲液中平衡；而且容易封闭，也不需要特别严谨的清洗条件。

转移到NC膜上的蛋白在合适的条件下可以稳定保存很长时间，但是纯的硝纤膜在比较脆，容易卷，不适合用于需要多次重复清洗的用途。

选择硝纤膜时要注意的是选择合适的孔径，通常20KD以上的大分子蛋白用0.45um孔径的膜，小于20KD的话建议选择0.2um的，如果小于7KD的话最好选择0.1um的膜。

另外由于NC膜上结合的蛋白会因
为一些去污剂而被代替，因此在封闭时最好使用较温和的Tween20，而且浓度不要超过0.3%（据说0.05%效果最好）。

常见生产公司有Schleicher & Schull；Millipore；PALL Invitrogen、GE （Amersham）、Santa Cruz 等
2.尼龙膜
尼龙膜更多是用于核酸的转移，也有见于蛋白印迹。

与NC相比，优点是结合力强，结实，柔软不易卷曲，机械强度大，便于操作。

缺点是背景高，而且当转移缓冲液中存在有SDS时蛋白质容易从尼龙膜上泄漏（通过甲醛固定可以缓解这一情况）。

另外，不能直接染色.
但是有些公司如pierce有的产品保有尼龙膜高灵敏度的优点和摒弃背景影响大的缺点，采用了合适的signal-to-noise 比例来调整，从而达到了200ug/cm2的蛋白结合能力，同时有比大多数尼龙膜甚至比一些NC膜都要小的低背景
3．聚偏二氟乙烯（PVDF）膜
聚偏二氟乙烯（PVDF）膜作为基质的转印膜由Millipore公司在1985年首先推出。

与硝酸纤维素膜相比，PVDF膜在蛋白质截留能力，机械强度和化学相容性上都更优越的性能
（Pluskal,etal.,1986)。

市售硝酸纤维素膜的典型结合量是80-100μg/cm2,而PVDF膜结合量是100-200μg/cm2（而结合强度PVDF比硝纤膜强6倍！）。

在艾滋病毒（HIV）血清学检验中直接比较PVDF和硝酸纤维素膜，PVDF膜具有更好的截留总HIV抗原能力并提高抗体检测糖基化被膜抗原的性能。

而且PVDF膜最大的优点是具有更好的机械强度和化学耐受性。

这使PVDF膜在各种染色应用和多重免疫检测中成为理想选择；而且单个凝胶的泳道复本可用于多种目的，如考马斯亮蓝染色后切出条带并进行N-末端测序、蛋白消化，肽分离，内部测序和免疫检测。

特别是需要做N端蛋白测序，能经得起多次清洗。

所以PVDF也是要做蛋白测序的唯一选择。

此外，一些强疏水蛋白用PVDF膜效果会更好一些。

PVDF膜适用的检测方法也不少，如化学发光、常规显色、同位素和标准染色，但不适合荧光。

PVDF膜特别注意的是需要100%甲醇预处理（不超过15秒）再用缓冲液平衡。

PVDF膜同样分0.45um和0.2um的，后者孔径小，对小分子蛋白有较好的拦截吸附，背景可能会比前者稍高。

常见的公司有Millipore ，Bio-Rad，Pierce，Pall Life Science，Invitrogen，Whatman等。

三．酶免疫定位
1. 封闭
Western的灵敏度某种程度上受限于封闭做的好不好。

脱脂奶是最常用的经济配方但是用这种封闭剂由于里面可能有痕量的生物素和碱性磷酸酶，可能造成背景污染而不适合生物素—亲和素的检测方法，脱脂奶也不适合碱性磷酸酶检测（AP）方法。

如果采用碱性磷酸酶检测系统，封闭剂最好用6%酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmol/L EDTA磷酸缓冲盐加热65度1小时确保碱性磷酸酶失活（可以加0.05%叠氮化钠，新鲜最好）。

现在HRP是越来越普遍的选择。

但是叠氮钠(NaN3)对辣根过氮化物酶(HRP)有灭活作用，如果用HRP检测系统则封闭液不要加叠氮化钠为好。

如果选用AP 作为显色方法，封闭时就要选择Tris缓冲体系。

2．抗体的的选择
一抗一般只要是说明书上注明mb就可以用于westen blot /单抗专一性高，但是经过SDS-PAGE变性胶电泳的蛋白质可能由于原来的识别位点构象发生改变而不被识别，因此多抗虽然不如单抗专一性高，但是更容易得到结果。

一般一抗最好选择源于兔或者小鼠，因为后继的检测试剂盒一般都是针对兔鼠的居多，因而选择范围更大通用性也更强。

除了无标记的一抗，还有生物素等各种标记一抗和用荧光标记的一抗直接检测而降低背景和非特异结合，但是同时也少了二抗的级联放大信号扩增，信号也会比较弱。

所以需要选择荧光信号特别明亮的标记。

一抗的稀释度通常需要预实验摸条件，可以根据说明书上建议的WB稀释度附近做2—3个梯度，如果是用化学发光法检测，由于灵敏度高而建议将稀释度再放大一些。

二级试剂的作用是信号扩增，选择是根据一抗的标记形式而决定的，对于无标记的一抗，可以选择对应一抗来源种属的标记二抗，或者更便宜的标记蛋白A（来自金黄葡萄球菌Protein A可以高度亲和来自人，兔，豚鼠的IgG，但对大鼠、山羊和鸡的IgG亲和力弱）。

不过，二抗是更可靠的选择——除了要选择对应一抗的来源种属，也要根据你准备采用的检测方法选择合适的标记。

3．标记的选择
Western Blot一般都选择酶促作为检测方法。

酶促反应可以搭配不同的底物从而实现不同的显色方法，如化学发光Chemiluminescent和底物显色Colormetirc/Chromogen。

前者灵敏度很高,灵敏度已经达到pg级别，甚至还有 Femto级别的，灵敏度超过了同位素；而后者由于直接显色而操作简便且成本低。

最常用的有辣根过氧化物酶HRP（Horseradish Peroxidase，属于过氧化物酶POD类）和碱性磷酸酶AP（Alkaline Phosphatase），此外还有还有葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase）、β半乳糖苷酶β-Galactosidase。

HRP 辣根过氧化酶是最常见的酶促发光或显色的交联酶，由于HRP比活高、特异性更强、分子量小（40kD）、稳定和作用底物范围广的优点而得到广泛使用。

HRP的底物种类有不少，主要可以分为化学发光底物和生色底物2大类。

HRP的生色底物显色有DAB，4-CN ，CN/DAB，AEC和TMB等（而得到可溶性产物的底物如OPD，ABTS等则适用于ELISA）中，与化学发光法中的酶促基团发光不同，底物显色主要是利用底物在有HRP和过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化积累这一过程检测WB的结果。

3'3'二氨基联苯胺（DAB）是最常用的底物，可以和HRP作用形成褐色不溶性产物，灵敏度高，特异性好，缺点就是需要现配现用，显色后光照数小时会褪色，不能永久保存，需要拍照记录，而且有毒。

由于DAB显色是褐色，不如4-CN反差大容易拍照，有的厂家还推出了DAB+4-CN混合底物，结合了DAB灵敏度高和4-CN背景低，易成像的优点，能获得很好的黑色沉淀成像。

用金属离子增强信号的DBA显色试剂灵敏度可以高达20pg。

TMB的signal-to-noise信噪比高，成分安全，特别合适于灵敏度要求高的WB，但是也要避免由于灵敏度高而引起的高背景，因此可以相应的延长封闭的时间和注意洗涤的次数；ACE各方面性质与DAB相似，但灵敏度要比DAB差一点。

化学发光底物发光信号发光信号当然越强，持续的时间越长，背景低灵敏度高越好，化学发光法由于仅在酶和底物都存在的时候才会发光，不同于生色反应般形成不溶的产物于膜上累积，所以特别适合同一张膜对不同的目标蛋白分别进行多次检测。

目前最高检测灵敏度已经达到低飞克（Femto）级别而成为安全且灵敏度最高的WB检测方法。

碱性磷酸酶AP也是常用的显色交联酶，很早就被用于检测系统——包括固定化抗原（WB）检测和核酸检测。

其优点是底物显色更稳定，不像HRP那样需要新鲜配制的H2O2一类的不稳定成分，作为试剂盒可以保存时间更长。

但是做过AP实验的经常会遇到膜上显色背景偏高的问题，分子克隆III解释说由于在我们常用的封闭剂：脱脂奶粉和牛血清白蛋白BSA中富含AP，这样当然显色背景会高。

所以分子克隆III推荐的AP适用封闭剂是6%的酪蛋白+1%聚乙烯吡咯烷酮+10mmo lEDTA 65度加热一小时确保AP失活后再用于封闭。

一些研究的样本自身也含有较高水平的碱性磷酸酶，虽然实验上很容易实现抑制内源AP影响，但实际上容易被忽略。

AP显色底物生成的产物主要是蓝紫色，容易拍照。

现在由于HRP系的化学发光底物已经不断改进而使得灵敏度不断提高，化学发光显色上HRP和AP不相上下，但是生色反应来说，AP显色的灵敏度还是比一般的HRP显色底物要高。

AP也有这两种常用的检测方法的不同底物，常用的是
BCIP(5-Bromo-4-Chloro-3’-Indolyphosphate p-Toluidine Salt) ，NBT (Nitro-Blue Tetrazolium Chloride)和INT。

BCIP NBT BCIP/NBT BCIP/INT
学名 5-Bromo-4-chloro-
3-indolyl
phosphate,
toluidine salt nitro-blue tetrazolium chloride
作用 与O2反应形成沉淀 氧化反应 BCIP除了可以和O2反
应，也可以用NBT作为
电子受体
氧化反应
灵敏度 100pg 100pg 30pg 一般
沉淀颜色 紫色 蓝紫色 蓝紫色 棕红色
用途 AP显色 AP或者葡糖氧
化酶 AP，原位杂交和免疫组
化
AP和免疫组
化
还有一些比较特殊的底物，比如Pierce公司的Fast Red，是为Western印迹，点印迹和免疫组化过程中检测AP而专门设计，这种底物产生的是亮红色沉淀，经过优化，灵敏度高，其中最有趣之处在于其双染色的好处：由于这种亮红色沉淀可以与不溶的HRP底物沉淀无论是NC还是尼龙膜上都能形成醒目的对比，因此可以进行两次显色，检测不同的蛋白。

AP的化学发光底物可快速产生强信号，因此可以获得非常漂亮灵敏的WB结果，而且不需要像生色底物那样等待半小时才能看结果。

例如Invitrogen的WesternBreeze检测灵敏度达到Femto 飞克级别的AP化学发光法检测试剂盒，而且发光持续时间长达5天。

而且优化后的背景极低。

Pierce 公司的产品—Lumi-Phos Wb灵敏度可以达到低pg级，而且可以使用尼龙膜。

Lumi-Phos Wb的发光持续时间是8个小时。

四：免疫印迹技术的注意事项：
1．免疫印迹技术所测定的只是目的蛋白的相对含量。

因此不能确定一种细胞含有多少目的蛋白，只能确定该蛋白存在与否及其它条件下与其他细胞相比蛋白的含量是高还是低。

2．比较一种目的蛋白在不同细胞或者同一细胞不同条件下的相对含量时，各样平的总蛋白量必须相等。

3．选用合适的SDS-PAGE胶浓度，使目的蛋白可以得到较好的分辨。

4．开始电泳和转移欠，一定要确认电极的正负极接头是否正确。

5．在免疫检测中，要注意封闭非特异性结合位点。

6．抗体反应在封口塑料袋内进行，一定要取出袋内的所有旗袍，否则会导致抗体结合不均匀。

7．操作要轻柔，带手套，不要再转移抹上造成任何刮痕。

在整个操作中，转移膜要始终在液体中，不能干燥。

附：参考价格：
碧云天
产品编号 产品名称 包装 价格
P0028 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒 100次 680.00元
产品编号 产品名称 包装 价格
P0012 BCA蛋白浓度测定试剂盒500次 258.00 元
产品编号 产品名称 包装 价格
P0006 Bradford蛋白浓度测定试剂盒 1000次 78.00 元
康成生物
产品名称 货号 规格 价格
细胞及组织总蛋白抽提试剂盒 KC-415 1 Kit 388元
KC™高敏化学发光试剂盒（超级灵敏度）KC-425 1 Kit 1388元
KC™化学发光试剂盒（高灵敏度） KC-420 1 Kit 600元 北京欣经科 生物技术有限公司
18402-50MM-PA 硝酸纤维素
膜0.2u
硝酸纤维
素膜0.2u
{直径
50mm(0.2u)}
7/张Cole-parmar
18401-47MM-PA 硝酸纤维素
膜0.45u
硝酸纤维
素膜0.45u
{直径
47mm(0.45u)}
7/张Cole-parmar
18403-80MM-PA 硝酸纤维素
膜0.45u
硝酸纤维
素膜0.45u
{直径
80mm(0.45u)}
20/张Cole-parmar
18405-30CMX3M 硝酸纤维
素膜0.45u
硝酸纤维素
膜0.45u
{30cm*3m(0.45u)}
1900/
卷
Amersham
RPN303C
18406-15X20CM 尼龙膜
0.45u
尼龙膜
0.45u
{15*20cm(0.45u)}75 Amersham Amersham
18407-30CMX3M 尼龙膜
0.45u
尼龙膜
0.45u
{30cm*3m(0.45u)}1900
Amersham
RPN303N
Amersham
RPN303N
18408-15X20CM 尼龙膜
0.45u
尼龙膜
0.45u
{15*20cm(0.45u)}75/张Bio-Rad
18409-10X15CM 尼龙膜
0.45u
尼龙膜
0.45u
{10*15cm(0.45u)}60/张
Bio-Rad
162-0154
原装
18415-30CMX3M Bio Trace
PVDF 聚偏
二氟乙烯印
迹膜
Bio Trace
PVDF 聚偏
二氟乙烯印
(30cm*3m) 1950/卷 Gelman
18414-15X20CM Bio Trace
PVDF 聚偏
二氟乙烯印
迹膜
Bio Trace
PVDF 聚偏
二氟乙烯印
(15*20cm) 90/张 Gelman
晶美
DAB-Ni KIT (Black) zymed 240 ml 1022.00 DAB KIT (Brown) zymed 240 ml 952.00。