环介导逆转录等温扩增技术_RT_LAMP_在丙型肝炎病毒基因检测中的应用

环介导逆转录等温扩增技术(RT 2LAMP)在丙型肝炎
病毒基因检测中的应用
李启明1,马学军1,2,周蕊1,彭夫望1,高寒春2,匡治州1,侯云德1,2
(11中国疾病预防控制中心　病毒病预防控制所,北京　100052;
21北京金迪克生物技术研究所,北京　100176)
摘要:该文介绍了一种便捷、灵敏而又特异的环介导逆转录等温扩增基因检测技术,该技术分别使用特异对应于靶序列中8个基因区段的3对特殊引物,并在反转录酶和Bst 2DNA 聚合酶的作用下对靶序列进行等温核酸扩增反应,整个检测反应只需1～2h 。

利用这种技术成功检测了丙型肝炎病毒基因,对60份经Real 2time PCR 或RT 2PCR 验证阳性的血清样品检测,阳性符合率为98%。

同时,对扩增终产物进一步进行酶切分析,并与HIV 、HBV 和不同亚型流感病毒RNA 进行交叉反应和特异性测试,均与预期结果吻合。

将Real 2time PCR 定量后的RNA 系列稀释后对检测方法的灵敏度进行了测试。

结果显示,该技术的检测灵敏度在理论上可达到10个拷贝的RNA 分子。

以上结果证明,RT 2LAMP 扩增技术是一种检测程序简单、灵敏度和特异性较高的基因检测手段,在丙型肝炎病毒的快速检测方面具有一定的开发潜力。

关键词:丙型肝炎病毒;环介导逆转录等温扩增;实时监控聚合酶链反应
中图分类号:R37312+1 文献标识码:A 文章编号:1000-8721(2006)05-0334-05
收稿日期:2006-04-29;修回日期:2006-05-24
基金项目:科技部重大专项禽流感防治研究(2004BA519A47,
2004BA519A34(加强))(2002CB513202)
作者简介:李启明(1973-),甘肃省人,博士生,主要从事分子诊断的研究工作。

通讯作者:马学军,E 2mail :maxj2004@yahoo
丙型肝炎病毒是一种常见的RNA 病毒,它可以通过血液和母婴传播等方式感染人而造成丙型肝
炎的流行。

目前,在临床上丙型肝炎的实验室诊断还是采取传统的EL ISA 方法,即利用基因工程抗原检测血清中的抗体。

由于该病毒在感染早期不能产生检测量的抗体,而抗原量又极微,无法用常规的免疫诊断方法检测出病毒。

而在基因诊断方面普遍采用的套式R T 2PCR 方法不但繁琐,而且因为低特异性和易交叉污染,往往结果并不可靠,在临床上造成许多窗口期的病原被错检或漏检,很难作为一种临床上的常规方法进行推广。

因此,发展一种简便、高特异且灵敏的核酸检测方法对丙型肝炎的预防和控制工作显得尤为重要。

文中介绍了一种被称为逆转录环介导等温核酸扩增技术(R T 2LAMP ),该方法最初由Notomi 等人设计并应用于病毒检测[1]。

在检测过程中,核酸链通过在等温环境中的循环置换扩增实现对靶序列的放大。

由于反应中使用了3对特异性引物,只有在3对引物均与特异的靶序列结合时扩增反应才能进
行,因此这种检测方法的特异性很高。

相对于其它传统扩增方法,尤其对RNA 的扩增,这种扩增很大程度上提高了检测的灵敏度并节省了反应时间。

因为其中的一对引物专门用于增加扩增模板而减少反应时间[2,3],加之反转录和扩增反应在等温统一环境中一步完成,省去了反转录步骤和改变温度所需的时间。

整个检测过程在65℃等温条件下只需1～2h 就可完成。

最终的扩增产物在核酸电泳的凝胶上呈现出典型梯状条带。

值得一提的是,R T 2LAMP 的扩增反应中可以形成可视的焦磷酸镁沉淀,因此肉眼也可观察到阳性反应管中的白色混浊物。

目前,日本已利用这种特性研制出专门用于LAMP 检测的实时监控浊度仪,可以实现对LAMP 扩增过程的全程实时监控[4-6]。

也有研究者通过在终产物中加入染料的方法直接用肉眼观察结果[6]。

目前,国内尚无有关LAMP 技术的报道,但国外已有较多文献连续报道了该检测技术在不同动植物病毒检测中成功应用的实例,如对西尼罗病毒、SARS 病毒、麻疹病毒、口蹄疫病毒、山药嵌纹病毒的检测以及登革病毒的分型等[6-12]。

该文首次采用了R T 2LAMP 技术对从临床上获得的60份不同丙型肝炎病人的临床血清进行了检测,并对这种方法在丙肝病毒检测中的特异性和灵敏度进行了探索性实验室研究。

第22卷　第5期2006年9月 病 毒 学 报CHIN ESE JOURNAL OF VIROLO GY
Vol.22 No.5
September 2006
材料与方法
1　材料　AMV 反转录酶购自Promega 公司、exo 2Bst DNA
聚合酶购自BioLab 公司,内切酶S m a Ⅰ购自宝生物公司,Betaine 购自Sigma 公司,RNA 提取试剂盒(Viral RNA Mini
K it )为Qiagen 公司产品,Real 2time PCR 试剂盒由深圳匹基
公司购得,Real 2time PCR 仪为Mx3000p (Stratagene )。

临床样品:60份丙肝病毒血清样品中20份由甘肃省临床检验中心提供,40份由湖北省干细胞研究中心提供。

2　探针、模式分子与引物设计　通过BLAST 、Align X 和Primer510程序选择了丙型肝炎病毒基因5’U TR 区的相对
保守段,并设计RT 2LAMP 的6条引物(序列见表1),其中包
括两条外引物(F3、B3)和两条内引物(FIP 、BIP ),两条环结合引物(Loop1、Loop2),引物在靶序列中的对应位置如图1所示(引物FIP 由F1和F2组成,引物BIP 由B1和B2组成)。

Real 2time PCR 的引物与探针引用试剂盒的推荐序列,以上所有序列和探针均由Ta K aRa 生物技术公司合成。

3　H CV 的RT 2LAMP 检测
使用Viral RNA Mini K it (Qiagen )
提取血清中的丙肝病毒的RNA ,提取方法依照说明书进行。

Real 2time PCR 的循环参数为:48℃反转录50min ,95℃预变性10min ;95℃变性
15s ,60℃退火45s ,共45个循环。

操作步骤按匹基公司提供
的试剂盒说明书进行。

表1　引物和探针序列
Table 1　Nucleotide sequences of the primers and probes
LAMP
Primer and probe Sequence (5’-3’)
F3ACCCAACACTACTCGGCTA G B3
ATCACTCCCCTGTG A GG AAC
FIP (F1+F2)A G A GCCATA GTGGTCTGCGGTGG ATCCAA G AAA GG ACCCGGTC BIP (B1+B2)TCCTGG A GGCTGCACG ACACTTACTGTCTTCACGCA G AAA GC Loop 21ATACTAACGCCATGGCTA G Loop 22G A GTACACCGG AATTGCCA G Primer F
TCAATGCCTGG A G ATTTGG Real 2time PCR
Primer R ACTCGCAA GCACCCTATCA G
Probe
[6-FAM ]CTA GCCG A GTA GTGTTGGGTCGCG[TAMRA -Q ]
图1　HCV 的RT 2LAMP 引物设计示意图
Figure 1　Oligonucleotide primers used for RT 2LAMP of HCV
The underlined letters indicate the sequences and location of primers in the HCV genome 1
Italic shows the location of S ma Ⅰsite 1
RT 2LAMP 反应体系如下:F3与B3,5pmol ;BIP 与FIP ,
40pmol ;Loop 21与Loop 22,20pmol ;其它反应组分终浓度为
1mmol/L dN TP ,1mmol/L Betaine ,6mmol/L MgSO 4,215μl
10×Bst 2DNA Polymerase Buffer ,8U Bst 2DNA polymerase ,
10U AMV 反转录酶,5μl HCV RNA 样品,补水至25μl ,混匀,65℃,水浴115h 。

115%琼脂糖凝胶电泳,观察结果。

4　RT 2LAMP 扩增产物的酶切鉴定　按20μl 体系进行酶切鉴定。

取5μl HCV 的RT 2LAMP 扩增终产物,2μl 10×
・
533・　5期 李启明等:环介导逆转录等温扩增技术(RT 2LAMP )在丙型肝炎病毒基因检测中的应用
Buffer ,1μl S m a Ⅰ内切酶,30℃,温浴3h ,琼脂糖凝胶电泳,观察结果。

5　血清样品的RT 2LAMP 检测　将40份湖北省干细胞研
究中心提供的经Real 2time PCR 验证阳性血清样本和20份甘肃省临床检验中心提供的经RT 2PCR 验证阳性血清样本作为RT 2LAMP 检测验证样本。

取140μl 血清用Virus RNA
Mini K it 试剂盒提取病毒RNA ,进行RT 2LAMP 检测,实验
方案与HCV 的RT 2LAMP 检测中相同。

6　RT 2LAMP 的灵敏度检测　取1份提自血清中的HCV 核
酸样品,用TaqMan 法进行Real 2time PCR 定量。

以标准品绘制标准曲线,依照标准曲线计算出该样品的核酸拷贝数。

将上述样品在101～105Copies/5μL 的稀释区间进行10倍系列稀释,并用稀释后的样品进行RT 2LAMP 的灵敏度测试,具体实验方案与HCV 的RT 2LAMP 检测相同。

结 果
1　H CV 的RT 2LAMP 检测及RT 2LAMP 扩增产物
的酶切鉴定
图2　HCV 的RT 2LAMP 检测及扩增产物的酶切鉴定
Figure 2　Detection of gene of HCV by RT 2LAMP (A );
Restriction analysis of RT 2LAMP products (B )
1,5.RT 2LAMP without HCV RNA ;2,3.RT 2LAMP of HCV RNA from different sera ;4.Result of RT 2LAMP with HIV RNA ;6.RT 2LAMP with HCV RNA ;7.RT 2LAMP products with HCV RNA after digestion with S ma I ;M.DNA marker (2000,1000,750,500,250,100bp ).
实验中对不同实验室提供的HCV RNA 样品进行了R T 2LAMP 检测,图2A 列举了其中的检测结
果。

阳性样品的R T 2LAMP 扩增结果(泳道2、3)中电泳条带呈阶梯状分布,与理论结果相符。

阴性(泳道1)与HIV RNA (泳道4)扩增结果只有引物聚体带出现。

由此可见,用这种方法对HCV RNA 的检测是成功的。

其实,我们在每次试验中均做1份其它病毒核酸对照,曾先后使用过HIV 、不同亚型流感病毒和HBV 的核酸,均呈现出良好的特异性,在该结果中只列举了HIV 的结果。

图3显示了自然
光下R T 2LAMP 扩增结果,可见阳性管中的反应液
已明显浑浊,这是因为扩增后形成的焦磷酸离子和溶液中的镁离子结合而形成焦磷酸镁沉淀所致[4]。

图2B 显示了HCV 的R T 2LAMP 扩增终产物的酶切结果,泳道6为扩增后产物,泳道7为扩增产物经内切酶S m a Ⅰ消化后的结果。

理论计算中,扩增产物经内切酶S m a Ⅰ消化后应成为两条主带(97bp 、109bp )以及少量其它大小不同的条带,途中结果与理论值完全相符。

这些结果均证明R T 2LAMP 对HCV RNA 的扩增特异性较高。

图3　RT 2LAMP 的可视结果
Figure 3　RT 2LAMP reaction visualized in reaction tube 1.RT 2LAMP without HCV RNA ; 2.RT 2LAMP with HCV RNA.
3　H CV 患者血清样本的检测
将60份HCV 患者血清样本经R T 2LAMP 检测
后的结果显示在表2中。

表中结果说明R T 2LAMP 、R T 2PCR 、Real 2time PCR 三种检测方法之间的检测符合率达到98%。

其中1份Real 2time PCR 检测阳性样品未被R T 2LAMP 检出,可能是因为该样品的RNA 拷贝数低于R T 2LAMP 的检测灵敏度或Real 2time PCR 检测中的假阳性结果造成。

表2　H CV 患者血清样本的RT 2LAMP 检测结果
Table 2　Detection results of HCV patient
serum samples by RT 2LAMP
Methods
Samples of HCV patients
RT 2LAMP Positive no 1
RT 2PCR Positive no 1
Real 2time PCR Positive no 1
Lanzhou (n =20)2020ND Wuhan (n =40)
39
ND
40
4　灵敏度测试
图4显示了用1份Real 2time PCR 定量后的
RNA 样品(结果未显示)进行R T 2LAMP 灵敏度测试的结果。

泳道2～6中结果均呈现出典型的LAMP 扩增带型,且信号依次增加。

说明R T 2LAMP 检测的灵敏度理论上可达到大约10个拷贝
的水平。

・633・病 毒 学 报 22卷　
图4　RT2LAMP在HCV病毒检测中的灵敏度测试结果Figure4　T est of sensitivity of RT2LAMP with HCV genome
1.RT2LAMP products without HCV RNA;
2.RT2LAMP products with10copies of HCV RNA;
3.RT2LAMP products with102copies of HCV RNA;
4.RT2LAMP products with103copies of HCV RNA;
5.RT2LAMP products with104copies of HCV RNA;
6.RT2LAMP products with105copies of HCV RNA;
M.DNA marker(2000,1000,750,500,250,100bp).
讨 论
综合文中的实验结果,作者认为R T2LAMP检测技术基本克服了目前在HCV基因诊断方面存在的一些弊端。

首先,该技术省略了单独的逆转录和套式PCR的二次扩增步骤,加之扩增反应在等温条件下进行,没有核酸的变复性过程,不但节省了大量的时间又减少了RNA酶和扩增核酸的污染机会。

更重要的是,扩增反应只有在六条引物完全与识别的靶序列8个结合区匹配的情况下才能顺利进行,所有这些特性都在很大程度上减少了扩增反应的背景,从而使检测特异性得到改善。

文中以HCV的临床血清作为R T2LAMP技术的检测样本,分别对该技术在RNA病毒检测的特异性与灵敏度方面进行了测试和评估。

从显示的结果分析,R T2LAMP与Real2time PCR方法显示的结果存在很高的符合率;且与Real2time PCR相比,该技术在可操作性和检测时间及设备要求方面拥有更大的优势。

对扩增产物的酶切分析和平行的HIV 病毒特异性测试结果也进一步证明了该技术有较高的特异性。

在目前所有利用R T2LAMP技术进行RNA检测的报道中,其灵敏度测试大多使用人工合成的模式RNA分子,此文首次在灵敏度测试中使用了临床样品进行验证。

其灵敏度可达到10个拷贝分子的水平,这也与文献报道中最少可检测6个拷贝模式RNA分子的灵敏度相近。

当然,由于反转录效率的影响因素很多,10个拷贝RNA分子的检测灵敏度只是依据实验结果的一种理论推断。

但这也足以显示该技术在病毒临床检测应用中的巨大潜力。

同理,上述优势在DNA分子检测中也应能被体现[1-4]。

总之,R T2LAMP是一种便捷、特异而又灵敏的快速基因检测技术,如果进行进一步优化、完善和推广,该技术将会在遗传和传染病的早期诊断及预防控制方面发挥重要作用。

该文对R T2LAMP技术在丙型肝炎病毒检测中的应用和评估也为今后该技术的推广利用积累了实验室经验。

(致谢:本课题中的样品分别由湖北省干细胞研究中心和甘肃省临床检验中心提供,特在此表示衷心感谢。

)
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Detection of HCV G ene by R everse T ranscription Loop 2mediated Isothermal
Amplif ication Method
L I Qi 2ming 1,MA Xue 2jun 1,2,ZHOU Rui 1,PEN G Fu 2wang 1,G AO Han 2chun 2,
KUAN G Zhi 2zhou 1,HOU Yun 2de 1,2
(11State Key L aboratory f or Molecular V i rology and Genetic Engi neeri ng ,Beiji ng 100052,Chi na ;
21Beiji ng Ji ndike Biotech Instit ute ,Beiji ng 100176,Chi na )
Abstract :A simple ,sensitive R T 2LAMP (Reverse Transcription Loop 2mediated Isothermal Amplification )method for detection of hepatitis C virus (HCV )RNA is described 1The method employs a set of six specially de 2signed primers that recognize eight distinct sequences of the target for sensitive ,specific amplification of nucleic acid under isothermal conditions 1The whole reaction can be completed within 1-2h 1In this study ,sixty spec 2imens from HCV patients that had been tested positive by Real 2time PCR or R T 2PCR were analyzed by R T 2LAMP ,the results showed a good correlation among Real 2time PCR ,R T 2PCR and R T 2LAMP (98%)1The specificity of the R T 2LAMP assay was further validated by cross 2reaction with different virus genomes and re 2striction analysis of the amplified products 1When the sensitivity of this assay was tested by serial 102fold dilu 2tions of RNA molecules from clinical sample ,it was found that the R T 2LAMP method was able to achieve theo 2retically a sensitivity of 10RNA molecules 1Thus ,we conclude that this established R T 2LAMP assay has poten 2tial usefulness for rapid detection of HCV 1
K ey w ords :hepatitis C virus (HCV );Reverse Transcription Loop 2mediated Isothermal Amplification (R T 2
LAMP );Real 2time PCR
Correspondi ng author :MA X ue 2j un ,E 2mail :maxj 2004@yahoo 1com 1cn
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833・病 毒 学 报 22卷　。