血清丙型肝炎病毒抗体检测作业指导书

血清丙型肝炎病毒抗体检测作业指导书（ELISA）
原理
在微孔条上预包被丙型肝炎病毒（HCV）重组嵌合抗原，采用ELISA法检测丙型肝炎病毒抗体。

样品加入已有样品稀释液的包被抗原反应孔，在随后的温育过程中，若样品中含特异抗体，则该抗体与包被抗原形成抗原抗体复合物被吸附到固相，再加入酶标记的第二，最终形成抗原-抗体-酶标二抗复合物，洗涤除去未结合的游离酶，加入显色剂后显色。

标本采集
2.1 采集前病人准备：受检者应空腹
2.2 标本种类：血清或血浆
2.3 标本要求：采集病人静脉血2ml，室温放置不超过4小时，分离血清备用。

标本储存：2-8°C保存不应超过1周，-20°C不应超过3个月，-70°C长期保存，应避免反复冻融。

标本运输：密封，室温运输。

标本拒收标准：污染、标本量不足、严重溶血或脂血标本不宜作此项检测。

试剂
6.1 试剂名称：丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒
6.2 试剂生产厂家：河南华美生物工程有限公司。

6.3 包装规格：96Test/Kit
6.4 试剂盒组成：包被反应板，样品稀释液，酶标记抗体，阳性对照血清，阴性对照血清，浓缩洗涤液，底物A，底物B，终止液，封口膜，密封袋。

6.5 试剂储存条件及有效期：2-8°C避光保存，有效期6个月。

仪器设备
7.1 仪器名称：自动酶标仪
7.2 仪器厂家：KHB
7.3 仪器型号：ST360
操作步骤
8.1 平衡：将试剂盒各组分取出，平衡至室温（18-25°C），微孔板开封后，余者及时以自封袋封存。

8.2 配液：浓缩洗涤液配制前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按1：19稀释后使用。

8.3 编号：将微孔条固定于支架，按序编号。

8.4 加样品稀释液：用加样器在微孔反应条板孔中加入样品稀释液，每孔100μl，空下四孔准备加对照。

8.5 加标本和留空白：将每份待检标本各10μl分别加入已有样品稀释液的各孔中，留下一孔不加标本作空白对照，标好位置。

8.6 加对照：在预先空下的四孔中用加样器分别加入阴性对照一孔，阳性对照三孔，每孔100μl，标好位置。

对照应在所有标本加完以后再加，以保证阈值准确性。

8.7 温育（一）：充分混匀，加上封板膜，置37℃温育30分钟。

8.8 洗涤（一）：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。

8.9 加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体100μl，轻拍混匀。

8.10 温育（二）：充分混匀，加上封板膜，置37℃温育30分钟。

8.11 洗涤（二）：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。

8.12 显色：每孔加入底物A、B各50μl，轻拍混匀，置37℃暗处20分钟。

8.13 终止：每孔加终止液50μl，混匀。

8.14 测定：用酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各孔OD值（用单波长测定时需设空白对照一孔，30分钟内完成测定，并记录结果）。

结果判断与分析
9.1 临界值（C.O.）的计算：临界值＝0.05＋0.08×阳性对照孔OD值，阴性对照OD均值大于0.1时应重
新试验，小于0.05时以0.05计算。

三孔阳性对照OD 平均值大于阴性对照0.6以上，方可认为试剂盒有效；若一孔阳性对照OD值与三孔阳性对照OD平均值差异大于30%，该孔应舍弃，并用另两孔重新计算OD平均值。

9.2 结果判定：样品OD值S/C.O>=1者为阳性
样品OD值S/C.O<1者为阴性
10. 质量控制：每次用含2NCU/ml HCV抗体的质控血清同步检测，以S/CO值绘制质控图，S/CO值应在控制范围内。

11. 参考范围：阴性
12. 临床意义：在血清中抗HCV抗体阳性表明有急性或慢性HCV感染。

13. 操作性能：灵敏度高。

14. 方法局限性
14.1 某些样本会出现非特异性交叉反应。

14.2 早期感染有可能漏检。

14.3 样品显色深浅与样品中抗体的含量没有一定正相关。

15. 注意事项
15.1 试剂的使用：整个检测工作中应严格防止交叉感染，操作时必须带手套，穿工作衣，严格健全和执行消毒隔离制度。

所有样品，洗弃液和各种废弃物都应按传染物处理。

15.2 试剂的组分：本试剂盒中样品稀释液采用变色技术，在加原始血清或血浆标本后由黄绿色变为兰紫色。

非原始血清或血浆（如稀释标本等）颜色变化不明显或变为其他颜色为正常现象。

15.3 加样：
15.3.1 样品稀释液，待测标本，阴性对照和阳性对照均须用加样器加注，并经常核对其准确性。

15.3.2 阴阳对照无须稀释，直接用加样器加100ul 于各孔中。

15.3.3 阴阳对照应在所有待测标本加完后再加，以保
证阈值计算的准确性。

15.3.4 先统一加显色剂A，后统一加显色剂B，两者顺序不要颠倒，显色计时从加入第一孔显色剂B开始。

15.4 洗涤时各孔均须加满，防止孔口内有游离酶未能洗净。

15.5 温育：注意控制反应时间，温育30分钟应控制在30±1分钟内，温育20分钟应控制在20±1分钟内，避免因反应时间延长造成整体显色升高。

15.6 判断：
15.6.1 测定结果的判定必须以酶标仪读数为准。

肉眼观测显色但OD值低于阈值的标本应判为阴性。

15.6.2 检测时必须设置空白对照，并在结果分析时注意扣除空白值。

15.7 所有样品都应按传染源处理。

15.8 封口膜使用说明
15.8.1 微孔板拆封后，在取出当天所需的微孔条后，其余微孔条可以封口膜封存以避免受潮。

在封存时，
注意勿把封口膜粘贴到微孔条底部，以免影响其透光性。

15.8.2 微孔板温育时，以封口膜覆盖孔口，可避免其他因素对实验带来的非预期的影响。

15.9 不同品名、不同批号的试剂不可混用，以免产生错误结果。

16.当检测系统（仪器）不能工作时，所采取的补救措施：应保证所有操作步骤正确无误；可以比对阴阳对照，肉眼判读；无法准确判读者，应留样待系统正常后复查。

17参考文献：中华人民共和国卫生部医政司编。

全国临床检验操作规程（第二版）415页。

18 其它：必须按规定使用经中国药品生物制品检定所检定并贴有“检定合格”防伪标签的试剂。