基因工程的基本技术
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3）、Taq酶(热稳定性)：
§常规酶 §高保真酶：ExTaq §La Taq酶
4）、反应缓冲液成分：
§ BSA、Tween20、DTT、明胶----保护酶作用 § Tris.cl提供缓冲作用
整理ppt
35
4、影响PCR 产量、质量的因素：
§(1)、 Taq酶：常用1U/25µL 浓度低，扩增产物不够； 浓度高，非特异性扩增增加； 酶的活性；
§(2)、 dNTP的浓度：
常用100-200µmol/L，不能低于20µmol/L，
特异性、保真性；
整理ppt
36
§(3)、模板：主要考虑纯度及使用量 对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等杂质则
难以成功。使用量从几个ng到100ng.
§(4)、引物浓度：
0.1-0.5µmol/L之间，过多则非特异扩增增
加，形成引物二聚体；
§(5)、 Mg2+浓度：常用 0.5-2.5mmol/L；
影响：酶的活性、引物-模板退火、特异性
整理ppt
37
§(6)、 PCR反应程序设定：
(1)、变性温度和时间： 要求变性彻底，但要考虑酶的半衰期：92.5℃
（2小时）95℃ （40min）97℃ （5min）94℃变性 比较彻底，酶的半衰期也不短。
30sec 30sec 1min
30 cycles 循环数
Heat denature Primers annealing Extension
72 C 5 C
Last extension
4 C endless
Ending reaction
整理ppt
40
6、PCR的种类
•特异PCR •RT-PCR •反向PCR
操作简单； 分辨范围：100bp-60kb； 有效范围：200bp-50kb； 分辨率：100bp左右
低熔点琼脂糖：用于DNA的回收（65℃）
整理ppt
21
聚丙烯酰胺凝胶： 常用于微卫星、测序分析； 分辨范围：5-500bp； 分辨率：1bp
注意：有神经毒性！！
整理ppt
22
B 凝胶浓度:
TPE （Tris+ EDTA+磷酸）:缓冲能力低
TNE （Tris+ EDTA+醋酸钠）
整理ppt
24
电泳缓冲液的选择
➢TBE缓冲力大于TAE；
➢高分子量的DNA选用TAE，否则选用TBE；
➢基因组DNA酶切电泳选用TAE； ☆ 实验技巧：
大家注意 了！
☻问题：电泳缓冲液使用一定时间后由于离子的富集
8.0 60-400
12
40-200
15
25-160
20
6-100
凝胶浓度的选择：取决于整待理pp检t 测的DNA的大小
原来如 此！
23
4 、电泳缓冲液
pH值：偏碱性，带负电荷 离子浓度：离子浓度高 电流大
发热快胶溶解
种类：
TAE （Tris+EDTA+醋酸）:电流大，易产生离子富集
TBE （Tris+ EDTA+硼酸）:缓冲能力最强
(2)、引物退火温度Tm与时间； Tm值由引物ATGC数决定每A、T计为2℃， G、C
计为4℃，时间一般为40秒到60秒
(3)、 引物延伸温度与时间： 72℃最佳，30-100nt/s，也有用68 ℃如La Taq
(4)、循环数：
25-35 cycles 之间，过多则非特异扩增增
加；平台效应；
整理ppt
整理ppt
9
2、质粒DNA的提取
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传 因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环 的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细 胞中。
质粒具有自主复制
和转录能力，能在子
代细胞中保持恒定的
拷贝数，并表达所携 带的遗传信息。
基因组DNA
整理ppt
质粒DNA
10
ⅰ质粒DNA提取方法： 碱裂解法、煮沸法、 SDS法等
DNA的密度。
整理ppt
26
☺ DNA染色剂
荧光染色剂,溴化已锭： （ EB, Ethidium bromid） 吸收300~360nm UV（紫外光） 放出590nm可见光（橙红色）
硝酸银：常用0.1%
Goldview染料
吸收紫外光，放出绿光（双链DNA）或橙红
色光（单链DNA）
整理ppt
同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物
的引导下合成与模板DNA互补的新链，实现DNA
的扩增。
整理ppt
30
2、 PCR反应过程： 变性：DNA双链变为单链； 退火：引物与模板结合； 延伸：合成互补链；
上述过程通过PCR仪的 程序设计及自动运作完 成。
整理ppt
32
3、 PCR反应体系：
体系成分：模板DNA、引物、Taq酶(热稳定 性)、 dNTP、反应缓冲液（Mg2+ 、 BSA、Tween20、 。 DTT 、 Tris.cl ）
电泳类型：
琼脂糖凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶整电理p泳pt
19
（一）、影响电泳迁移率的因素
1、分子本身的影响 ➢分子的大小：小则快 ➢带电荷数：多则快 ➢分子构型：超螺旋>解螺
旋
2、电场：直流电场 ➢电压高则快 ➢电压太高则结果不准确 常用3~5V/CM
整理ppt
20
3、支持物介质
A 种类：
琼脂糖（agarose）凝胶：
浓度大，筛孔小，适合小分子电泳；
浓度小，筛孔大，适合大分子电泳
♦ 凝胶分辨DNA的能力：
琼脂糖
浓度 分辨范围(kb)
0.3%
5-60
0.6%
1-20
0.7%
0.8-10
0.9%
0.5-7
1.2%
0.4-6
1.5%
0.2-3
聚丙烯酰胺凝胶
浓度 分辨范围(bp)
3.5 1000-2000
5
90-500
§、溶液Ⅱ： 0.2 mol/L NaOH， 1%SDS(w/v)， 现配现用；
§、溶液Ⅲ：3 mol/L KAc，用冰醋酸调pH值至
5.2；
整理ppt
12
实验步骤
1、接种、摇菌； 2、把菌液放入Ep管中，离心，弃上清； 3、加入200μL预冷的含Rnase的溶液I，涡旋
混匀；
4、加入200μL的溶液Ⅱ，温和混匀，室温静 置5min；
ⅱ 碱裂解法原理：
在碱性条件下，双连DNA氢键断裂， 结构破坏变性，环状超螺旋质粒不充分 变性。在中性条件下变性质粒恢复原来 构型，而线性大分子细菌DNA不能复性呈 不溶物而经离心除去。
整理ppt
11
抽提质粒DNA所需的溶液：
§、溶液Ⅰ：50 mol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl （pH8.0），10 mmol/L EDTA (pH8.0)；
•RAPD •锚定PCR •套式PCR
•不对称PCR
•长程PCR
•锅柄PCR
•免疫PCR
•定量PCR
•原位PCR
整理ppt
41
（1）特异PCR 扩增所用的引物是特异的，扩出的产物也是特
定的。
F R
（2）RT-PCR： 是一类以mRNA为最初模板的基因的扩增。
5`CAP
整理ppt
AAAAAAAAAA TTTTTTTTTTT
27
（三）凝胶电泳过程
1、制胶：称取一定量的琼脂糖用电泳缓冲液融解后倒 入制胶槽配制；
2、放胶：胶放入电泳槽，加入电泳缓冲液至没过胶2 －3mm,
3、点样：把DNA样品加入上样缓冲液混匀上样 4、电泳：接通电源，调好电压 5、看结果：紫外光观察。
整理ppt
28
（四）、电泳种类
•1、单向电泳
•2、脉冲电场电泳（CHEF）
10、用TE（pH8.0，）溶解质粒DNA，并加 入RnaseA达浓度为10μg/ml，37℃放置1小 时
11、取1μL质粒DNA用于电泳检测。
整理ppt
14
ⅲ 抽提出质粒的构型：
1）超螺旋质粒DNA:在提取质粒过程中， 超螺旋DNA占大部分。
2）开环质粒DNA：如果质粒DNA两条链中 有一条链发生一处或多处断裂，分子就能 旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状 分子，称开环DNA。
整理ppt
33
1）、引物（寡聚核苷酸）
§一般成对出现，长度为15-30个核苷酸； § 使用浓度： 0.1-0.5uM，高达1uM； § 引物设计原则：
1、G+C含量45-55%； 2、Tm值高于55； 3、引物特异性； 4、引物扩增跨度； 5、是否形成引物二聚体
整理ppt
34
2）、模板DNA：
§基因组DNA、质粒DNA、其它DNA片段； §质量要求：不高
第二章 基因工程操作的基本技术
整理ppt
1
整理ppt
2
主要内容
PCR技术
基因工 程技术
DNA重组技术
重
组
子
克
隆 整理ppt
3
第一节
基因工程的基本技术 之一
整理ppt
4
一、核酸提取技术
核酸包括脱氧核糖核酸（ DNA ）和核糖 核酸（RNA）;
脱氧核糖核酸（ DNA ）包括线状基因组 DNA和环状DNA（质粒DNA）。
整理ppt
5 l (1) 4 l (2mM) 1 l(0.1mM) 1 l(0.2 M) 1 l(0.2 M) 0.6 l(2U/50 l) 1 l 36.5 l 50 l
39
§ PCR thermal program 设计的反应程序
94C 1min
相应作用
Heat denaturation
94 C Tm 72 C
5、加入200μL的溶液Ⅲ，温和混匀，冰浴 15min；
6、离心，吸上清至另一EP管；
整理ppt
13
7、加等量的氯仿/异戊醇（V：V=24：1）抽 提，离心；
8、移取上清液，加入2倍体积无水乙醇，混 匀，-20℃静置5min，离心，弃上清；
9、用70%乙醇洗DNA沉淀2次，离心，倒掉 乙醇，吹干；
作用，DNA在凝胶中出现跑不动现象。
解决办法：
一是更换成新配置的电泳缓冲液；
二是把电泳槽中倒出混匀后重新使用。－－－WHY?
整理ppt
25
（二）、电泳指示剂和DNA染色剂
☺ 电泳指示剂
Ⅰ、类型：溴酚兰，二甲苯青
Ⅱ、作用 使样品呈现颜色，便于加样；
(3) 与一些高浓度蔗糖或其它物质增加
整理ppt
5
1、植物组织中基因组DNA的提取
思考：DNA如何从细胞中取出？
整理ppt
6
ⅰ植物组织中基因组DNA的提取原理：
用机械研磨使组织和细胞破碎，然后加 入SDS、CTAB等离子型表面活性剂，使细 胞膜和核膜破裂，解聚核中的核蛋白（并与 蛋白质形成混合物），然后在酚和氯仿等表 面活性剂的作用下使蛋白变性，再经离心除 去组织和变性蛋白，上清夜加乙醇使DNA沉 淀。
42
（3）反向PCR： 根据已知序列扩增两侧序列的方法。
酶切
引物1 引物2
酶切
未知序列 已知序列 未知序列
此PCR操作过程：
酶切基因组DNA
连接环化目的DNA
用引物1和引物2组整合理p扩pt 增出侧翼序列
3）线状质粒DNA：如果质粒DNA的两条链在 同一处断裂，则形成线状DNA。
整理ppt
15
抽提出的质粒三种构型 电泳结果：
1）开 环 2）线 状 3）超螺旋
整理ppt
-
电 泳 方 向
+
16
DNA的浓缩与纯化（P31-33）
♪ DNA的浓缩：
＠ 乙醇沉淀法
＠ 正丁醇抽提法
＠ 聚已二醇浓缩法
♫ DNA的纯化：
整理ppt
7
再思考：
1、研磨破碎组织必 须在低温下进行。
------为什么？ 防止DNA降解。
2、幼嫩组织DNA 的得率高还是低？
得率高！
整理ppt
8
ⅱ 提取DNA的质量鉴定： DNA的相对完整性：凝胶电泳 DNA的纯度：测OD值
吸收峰： DNA 紫外光260nm 蛋白质 紫外光280nm
比值： OD260/280 = 1.8-2.0 较纯 OD260/280 < 1.8-2.0 杂质多
－
＋
•3、反转电场电泳（FIGE）
整理ppt
29
技术3： PCR技术
(polymerase chain reaction)
中文名称：聚合酶链式反应
1、PCR原理：
变性温度下， DNA双链变性双螺旋解开成
单链DNA，在退火温度中人工合成的特异引物
根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合，
然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸温度下不
＠氯化铯－溴化已锭连续梯度离心法
＠离子交换层析法
＠琼脂糖凝胶电泳洗脱法
＠“基因纯”试剂纯化
整理ppt
17
二、凝胶电泳技术
电泳目的：对核酸分子进行分离和检测
整理ppt
18
核酸分子分离的原因：
在碱性环境下，核酸分子带负电荷， 在外加电场的作用下，分子在凝胶多孔性 刚性滤孔中从负极向正极泳动，其中主要 由于分子筛效应和电荷效应达到分离不同 大小核酸分子的目的。
38
5、PCR例子（Example of reaction solution） 以普通PCR 50l reaction solution 为例)
§反应体系配置：
10PCR buffer 25mM MgCl2 dNTP Mixture (10mM each) primer 1 （10 M) primer 2 (10 M) Taq polymerase (5U/ l) DNA template (0.1 g/ l) ddH2O total
§常规酶 §高保真酶：ExTaq §La Taq酶
4）、反应缓冲液成分：
§ BSA、Tween20、DTT、明胶----保护酶作用 § Tris.cl提供缓冲作用
整理ppt
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4、影响PCR 产量、质量的因素：
§(1)、 Taq酶：常用1U/25µL 浓度低，扩增产物不够； 浓度高，非特异性扩增增加； 酶的活性；
§(2)、 dNTP的浓度：
常用100-200µmol/L，不能低于20µmol/L，
特异性、保真性；
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§(3)、模板：主要考虑纯度及使用量 对纯度要求不高，但含有酚、氯仿等杂质则
难以成功。使用量从几个ng到100ng.
§(4)、引物浓度：
0.1-0.5µmol/L之间，过多则非特异扩增增
加，形成引物二聚体；
§(5)、 Mg2+浓度：常用 0.5-2.5mmol/L；
影响：酶的活性、引物-模板退火、特异性
整理ppt
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§(6)、 PCR反应程序设定：
(1)、变性温度和时间： 要求变性彻底，但要考虑酶的半衰期：92.5℃
（2小时）95℃ （40min）97℃ （5min）94℃变性 比较彻底，酶的半衰期也不短。
30sec 30sec 1min
30 cycles 循环数
Heat denature Primers annealing Extension
72 C 5 C
Last extension
4 C endless
Ending reaction
整理ppt
40
6、PCR的种类
•特异PCR •RT-PCR •反向PCR
操作简单； 分辨范围：100bp-60kb； 有效范围：200bp-50kb； 分辨率：100bp左右
低熔点琼脂糖：用于DNA的回收（65℃）
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聚丙烯酰胺凝胶： 常用于微卫星、测序分析； 分辨范围：5-500bp； 分辨率：1bp
注意：有神经毒性！！
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B 凝胶浓度:
TPE （Tris+ EDTA+磷酸）:缓冲能力低
TNE （Tris+ EDTA+醋酸钠）
整理ppt
24
电泳缓冲液的选择
➢TBE缓冲力大于TAE；
➢高分子量的DNA选用TAE，否则选用TBE；
➢基因组DNA酶切电泳选用TAE； ☆ 实验技巧：
大家注意 了！
☻问题：电泳缓冲液使用一定时间后由于离子的富集
8.0 60-400
12
40-200
15
25-160
20
6-100
凝胶浓度的选择：取决于整待理pp检t 测的DNA的大小
原来如 此！
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4 、电泳缓冲液
pH值：偏碱性，带负电荷 离子浓度：离子浓度高 电流大
发热快胶溶解
种类：
TAE （Tris+EDTA+醋酸）:电流大，易产生离子富集
TBE （Tris+ EDTA+硼酸）:缓冲能力最强
(2)、引物退火温度Tm与时间； Tm值由引物ATGC数决定每A、T计为2℃， G、C
计为4℃，时间一般为40秒到60秒
(3)、 引物延伸温度与时间： 72℃最佳，30-100nt/s，也有用68 ℃如La Taq
(4)、循环数：
25-35 cycles 之间，过多则非特异扩增增
加；平台效应；
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2、质粒DNA的提取
质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传 因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环 的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细 胞中。
质粒具有自主复制
和转录能力，能在子
代细胞中保持恒定的
拷贝数，并表达所携 带的遗传信息。
基因组DNA
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质粒DNA
10
ⅰ质粒DNA提取方法： 碱裂解法、煮沸法、 SDS法等
DNA的密度。
整理ppt
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☺ DNA染色剂
荧光染色剂,溴化已锭： （ EB, Ethidium bromid） 吸收300~360nm UV（紫外光） 放出590nm可见光（橙红色）
硝酸银：常用0.1%
Goldview染料
吸收紫外光，放出绿光（双链DNA）或橙红
色光（单链DNA）
整理ppt
同的脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则在引物
的引导下合成与模板DNA互补的新链，实现DNA
的扩增。
整理ppt
30
2、 PCR反应过程： 变性：DNA双链变为单链； 退火：引物与模板结合； 延伸：合成互补链；
上述过程通过PCR仪的 程序设计及自动运作完 成。
整理ppt
32
3、 PCR反应体系：
体系成分：模板DNA、引物、Taq酶(热稳定 性)、 dNTP、反应缓冲液（Mg2+ 、 BSA、Tween20、 。 DTT 、 Tris.cl ）
电泳类型：
琼脂糖凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶整电理p泳pt
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（一）、影响电泳迁移率的因素
1、分子本身的影响 ➢分子的大小：小则快 ➢带电荷数：多则快 ➢分子构型：超螺旋>解螺
旋
2、电场：直流电场 ➢电压高则快 ➢电压太高则结果不准确 常用3~5V/CM
整理ppt
20
3、支持物介质
A 种类：
琼脂糖（agarose）凝胶：
浓度大，筛孔小，适合小分子电泳；
浓度小，筛孔大，适合大分子电泳
♦ 凝胶分辨DNA的能力：
琼脂糖
浓度 分辨范围(kb)
0.3%
5-60
0.6%
1-20
0.7%
0.8-10
0.9%
0.5-7
1.2%
0.4-6
1.5%
0.2-3
聚丙烯酰胺凝胶
浓度 分辨范围(bp)
3.5 1000-2000
5
90-500
§、溶液Ⅱ： 0.2 mol/L NaOH， 1%SDS(w/v)， 现配现用；
§、溶液Ⅲ：3 mol/L KAc，用冰醋酸调pH值至
5.2；
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实验步骤
1、接种、摇菌； 2、把菌液放入Ep管中，离心，弃上清； 3、加入200μL预冷的含Rnase的溶液I，涡旋
混匀；
4、加入200μL的溶液Ⅱ，温和混匀，室温静 置5min；
ⅱ 碱裂解法原理：
在碱性条件下，双连DNA氢键断裂， 结构破坏变性，环状超螺旋质粒不充分 变性。在中性条件下变性质粒恢复原来 构型，而线性大分子细菌DNA不能复性呈 不溶物而经离心除去。
整理ppt
11
抽提质粒DNA所需的溶液：
§、溶液Ⅰ：50 mol/L葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl （pH8.0），10 mmol/L EDTA (pH8.0)；
•RAPD •锚定PCR •套式PCR
•不对称PCR
•长程PCR
•锅柄PCR
•免疫PCR
•定量PCR
•原位PCR
整理ppt
41
（1）特异PCR 扩增所用的引物是特异的，扩出的产物也是特
定的。
F R
（2）RT-PCR： 是一类以mRNA为最初模板的基因的扩增。
5`CAP
整理ppt
AAAAAAAAAA TTTTTTTTTTT
27
（三）凝胶电泳过程
1、制胶：称取一定量的琼脂糖用电泳缓冲液融解后倒 入制胶槽配制；
2、放胶：胶放入电泳槽，加入电泳缓冲液至没过胶2 －3mm,
3、点样：把DNA样品加入上样缓冲液混匀上样 4、电泳：接通电源，调好电压 5、看结果：紫外光观察。
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（四）、电泳种类
•1、单向电泳
•2、脉冲电场电泳（CHEF）
10、用TE（pH8.0，）溶解质粒DNA，并加 入RnaseA达浓度为10μg/ml，37℃放置1小 时
11、取1μL质粒DNA用于电泳检测。
整理ppt
14
ⅲ 抽提出质粒的构型：
1）超螺旋质粒DNA:在提取质粒过程中， 超螺旋DNA占大部分。
2）开环质粒DNA：如果质粒DNA两条链中 有一条链发生一处或多处断裂，分子就能 旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状 分子，称开环DNA。
整理ppt
33
1）、引物（寡聚核苷酸）
§一般成对出现，长度为15-30个核苷酸； § 使用浓度： 0.1-0.5uM，高达1uM； § 引物设计原则：
1、G+C含量45-55%； 2、Tm值高于55； 3、引物特异性； 4、引物扩增跨度； 5、是否形成引物二聚体
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34
2）、模板DNA：
§基因组DNA、质粒DNA、其它DNA片段； §质量要求：不高
第二章 基因工程操作的基本技术
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1
整理ppt
2
主要内容
PCR技术
基因工 程技术
DNA重组技术
重
组
子
克
隆 整理ppt
3
第一节
基因工程的基本技术 之一
整理ppt
4
一、核酸提取技术
核酸包括脱氧核糖核酸（ DNA ）和核糖 核酸（RNA）;
脱氧核糖核酸（ DNA ）包括线状基因组 DNA和环状DNA（质粒DNA）。
整理ppt
5 l (1) 4 l (2mM) 1 l(0.1mM) 1 l(0.2 M) 1 l(0.2 M) 0.6 l(2U/50 l) 1 l 36.5 l 50 l
39
§ PCR thermal program 设计的反应程序
94C 1min
相应作用
Heat denaturation
94 C Tm 72 C
5、加入200μL的溶液Ⅲ，温和混匀，冰浴 15min；
6、离心，吸上清至另一EP管；
整理ppt
13
7、加等量的氯仿/异戊醇（V：V=24：1）抽 提，离心；
8、移取上清液，加入2倍体积无水乙醇，混 匀，-20℃静置5min，离心，弃上清；
9、用70%乙醇洗DNA沉淀2次，离心，倒掉 乙醇，吹干；
作用，DNA在凝胶中出现跑不动现象。
解决办法：
一是更换成新配置的电泳缓冲液；
二是把电泳槽中倒出混匀后重新使用。－－－WHY?
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25
（二）、电泳指示剂和DNA染色剂
☺ 电泳指示剂
Ⅰ、类型：溴酚兰，二甲苯青
Ⅱ、作用 使样品呈现颜色，便于加样；
(3) 与一些高浓度蔗糖或其它物质增加
整理ppt
5
1、植物组织中基因组DNA的提取
思考：DNA如何从细胞中取出？
整理ppt
6
ⅰ植物组织中基因组DNA的提取原理：
用机械研磨使组织和细胞破碎，然后加 入SDS、CTAB等离子型表面活性剂，使细 胞膜和核膜破裂，解聚核中的核蛋白（并与 蛋白质形成混合物），然后在酚和氯仿等表 面活性剂的作用下使蛋白变性，再经离心除 去组织和变性蛋白，上清夜加乙醇使DNA沉 淀。
42
（3）反向PCR： 根据已知序列扩增两侧序列的方法。
酶切
引物1 引物2
酶切
未知序列 已知序列 未知序列
此PCR操作过程：
酶切基因组DNA
连接环化目的DNA
用引物1和引物2组整合理p扩pt 增出侧翼序列
3）线状质粒DNA：如果质粒DNA的两条链在 同一处断裂，则形成线状DNA。
整理ppt
15
抽提出的质粒三种构型 电泳结果：
1）开 环 2）线 状 3）超螺旋
整理ppt
-
电 泳 方 向
+
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DNA的浓缩与纯化（P31-33）
♪ DNA的浓缩：
＠ 乙醇沉淀法
＠ 正丁醇抽提法
＠ 聚已二醇浓缩法
♫ DNA的纯化：
整理ppt
7
再思考：
1、研磨破碎组织必 须在低温下进行。
------为什么？ 防止DNA降解。
2、幼嫩组织DNA 的得率高还是低？
得率高！
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ⅱ 提取DNA的质量鉴定： DNA的相对完整性：凝胶电泳 DNA的纯度：测OD值
吸收峰： DNA 紫外光260nm 蛋白质 紫外光280nm
比值： OD260/280 = 1.8-2.0 较纯 OD260/280 < 1.8-2.0 杂质多
－
＋
•3、反转电场电泳（FIGE）
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技术3： PCR技术
(polymerase chain reaction)
中文名称：聚合酶链式反应
1、PCR原理：
变性温度下， DNA双链变性双螺旋解开成
单链DNA，在退火温度中人工合成的特异引物
根据碱基互补配对原则与单链DNA特异结合，
然后在DNA聚合酶的作用下，在延伸温度下不
＠氯化铯－溴化已锭连续梯度离心法
＠离子交换层析法
＠琼脂糖凝胶电泳洗脱法
＠“基因纯”试剂纯化
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二、凝胶电泳技术
电泳目的：对核酸分子进行分离和检测
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核酸分子分离的原因：
在碱性环境下，核酸分子带负电荷， 在外加电场的作用下，分子在凝胶多孔性 刚性滤孔中从负极向正极泳动，其中主要 由于分子筛效应和电荷效应达到分离不同 大小核酸分子的目的。
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5、PCR例子（Example of reaction solution） 以普通PCR 50l reaction solution 为例)
§反应体系配置：
10PCR buffer 25mM MgCl2 dNTP Mixture (10mM each) primer 1 （10 M) primer 2 (10 M) Taq polymerase (5U/ l) DNA template (0.1 g/ l) ddH2O total