提高nisin产量

通过增加乳酸乳球菌肽的免疫\抗菌基因来提高乳酸乳球菌的产肽量
摘要研究增加抗菌基因对产乳酸乳球菌肽的影响。

使用的菌是MG1363。

长度为60-kb乳酸乳球菌肽抗菌质粒pND300，来自于不产乳酸乳球菌肽的菌中，该质粒有５个编码基因与乳酸乳球菌肽的抗性有关，这些基因与产乳酸乳球菌肽的基因很相似。

将pND300转入MG1363的结果是抗菌肽的产量显著增加。

将抗菌基因亚克隆到pSA3得到pND314，再转入MG1363，可以使菌株生长的得更快，同时伴随着产肽速度的提高。

研究表明，将pND300或pND300亚克隆的抗菌基因转入MG1363，都会使肽产物的动力学参数明显改变。

观察结果表明这些处理可能被成功地用于提高乳酸乳球菌肽经济效益。

介绍
乳酸乳球菌肽是一种细菌素，它由某些乳酸乳球菌产生。

它相当受关注，因为它被用作抗菌剂而广泛应用于食品，保健品和化妆品中。

它作为高效防腐剂的意义在于它具有光谱抗菌性，能够抗几乎所有的革兰氏阳性菌及其孢子。

乳酸乳球菌肽的决定基因是一个转座子，通过变位它可以从一个菌转移到另一个菌中。

与乳酸乳球菌肽合成相关的基因已经被鉴定并整合在了一个操纵子上。

Nis A是编码乳酸乳球菌肽的结构基因，nis B and nis C编码的产物与肽的成熟有关，nis T与转移有关，nis P与分泌有关。

乳酸乳球菌肽的生物合成通常由nis R 和nis K基因调控的。

该操纵子中的抗性基因也已被鉴定。

抗性原理被称为乳酸乳球菌肽免疫(nisin immu-nity)，也叫菌株对抗其自身产物的自我保护机制。

Nisin免疫由基因nis I，nis F, nis E，nis G调控。

又观察到了另一个抗性原理。

该原理被称作乳酸乳球菌肽抵抗（nisin resistance)，也叫不产肽菌株的迟钝。

它由质粒上的基因决定，而且似乎是一个单独的基因决定。

尽管调控nisin免疫和抵抗的基因已经被鉴定，但这两个抗性机制的精确途径还没有确定。

有人推测，菌的产肽水平会受其抗性的影响。

最近，一个可以编码抗性的60-kb的质粒(pND300)被鉴定了，它来自于不产肽的菌株中，它编码的肽的抗性与肽的免疫很相似。

pND300含有nis R，nis K，nis F, nis E，nis G，但不含nis I。

将pND300上含这些基因的长度为12-kb的片段亚克隆到pND314上。

这篇文章报道了提高乳酸乳球菌肽免疫＼抗菌基因，对合成的影响。

乳酸乳球菌肽免疫＼抗菌基因由pND300和pND314携带转入产乳酸乳球菌肽宿主中，然后研究菌的生长和肽的合成。

材料方法
菌株，质粒和培养基
乳酸乳球菌亚种，乳酸菌(ATCC11454)含有一个缀合转座子Tn Nip，它可以调控乳酸乳球菌肽的合成，免疫＼抗菌性，以及对蔗糖的利用。

使用的乳酸菌有MG1363,
LM0230(pND300), LM0230(pND314) and LM0230(pND326)，所用质粒如表１所示。

使用黄色微球菌作指示菌。

培养基是M17，再添加0.5%葡萄糖(M17G)或蔗糖
(M17S)。

微生物培养条件以及培养基的制备方法参见以前。

微生物过程
使用电穿孔法，基因脉冲器设定为2.5 kV,200 Ω和25 μF。

结合实验使用渗透杂交法，并添加糜蛋白酶。

转化结合子的阳性筛选使用M17S加10 μg ml -1红霉素(Em)，或M17G加10 μg ml -1红霉素和500μg ml -1乳酸乳球菌肽(Nis)。

提质粒方法同以往。

分批培养和乳酸乳球菌肽的测定
菌株按以前的方法制备，接种量根据培养液浊度为A 620接近1.0来计算。

培养条件是厌氧分批式环境，500-ml Quickfit-type生物反应器。

pH 6.0，温度30 ℃。

通过向培养基上方通强度为150 cm 3 min -1的N2和CO2来维持厌氧环境。

每小时收集一次样本，测吸光度值和乳酸乳球菌肽。

样品中乳酸乳球菌肽的测定方法同以前，肽的积累量为相对的价值。

结果
共研究了三种菌，第一种只携带Tn Nip，另外两种菌既携带Tn Nip又携带增加的抗性基因。

第一种菌构建：将L. lactis LM0230(pND326)的质粒电转化到L. lactis MG1363得到L. lactis MG1363(pND326)，pND326含有红霉素抗性基因，用作最后的阳性筛选。

再将L. lactis ATCC11454中的Tn Nip结合到L. lactis MG1363(pND326)上，最后得到L. lactis MG1363(pND326)（Tn Nip），它能产乳酸乳球菌肽，抗乳酸乳球菌肽，还能利用蔗糖，记作Nip +。

第二种菌构建：将L. lactis LM0230(pND300)的质粒通过结合法转入L. lactis
MG1363(pND326)，得到L. lactis MG1363(pND326) (pND300)，再将L. lactis ATCC11454中的Tn Nip结合上去，得到L. lactis MG1363(pND326) (pND300)
（Tn Nip），记作Nip +和Em r。

第三种菌构建：将L. lactis LM0230(pND314) 的质粒电转化到L. lactis MG1363，得到L. lactis MG1363(pND314)，再将L. lactis ATCC11454中的TnNip结合上去，得到L. lactis MG1363(pND314) （Tn Nip），记作Nip +和Em r。

如表2所示
lactis MG1363和lactis MG1363(pND326)的生长过程
分批培养这两种菌来观测pND326对菌的生长是否有影响。

结果是，它们的生长过程很相似，A 620最大吸光度值分别为13.5和14.5。

增加抗菌基因对乳酸乳球菌肽生成的影响
对菌进行培养，测量菌的生长速率和产乳酸乳球菌肽的水平。

第一种菌L. lactis
MG1363(pND326)（Tn Nip）只含Tn Nip，作对照菌。

第二种菌和第三种菌，分别为L. lactis MG1363(pND326) (pND300)（Tn Nip）和L. lactis MG1363(pND314)
（Tn Nip），都含有额外的抗菌基因，作试验菌。

A 620最大吸光度值分别为8.1, 7.4 和10.9。

第一种菌和第二种菌的生长速率很相似，第三中菌的生长速率明显比它们高。

如Fig. 1a所示。

乳酸乳球菌肽生成速率最高的是第三种菌，这似乎与它有更高的生长速率有关。

第二种菌的乳酸乳球菌肽产量最高。

如Fig. 1b示。

我们观测的结果很可能与额外增加的乳酸乳球菌肽基因有关。

实验都进行了四次重复。

讨论
１.产乳酸乳球菌肽的菌的生长速率和最大吸光度值通常都比不产的菌低。

比如，将一个编码乳酸乳球菌肽的转座子转入一个菌中，菌的生长速率和最大吸光度值会显著降低。

本研究也论证了这一点，MG1363(pND326)的A max为14.5，
MG1363(pND326)（Tn Nip）的A max为8.1。

生长速率的减少可能是由于乳酸乳球菌肽的生成给细胞造成额外的负担。

然而，将pND314转入产乳酸乳球菌肽的菌中，则会使菌的生长速率和最大吸光度值都增加。

没有其他例子说明产乳酸乳球菌肽的菌的生长速率可以通过改变菌的基因组成来提高。

伴随着菌的生长速率的提高，乳酸乳球菌肽的生成速率加快。

２.已经知道，乳酸乳球菌肽的生成与菌的生长有关，乳酸乳球菌肽的最大生成量与菌的组成有关。

已经论证出，给细胞提供额外的能量也不会产生更多的乳酸乳球菌肽，表明乳酸乳球菌肽的生成与菌的生长密切相关。

此外，提供不同的糖，就会得到不同的A max，生成不同水平的乳酸乳球菌肽。

因此，菌生长速率提高很可能使乳酸乳球菌肽生成速率提高。

将pND314转入，使得菌生长速率提高，也使肽的生成速率提高。

３.尽管乳酸乳球菌肽的生成速率与菌的生长速率有关，但是它们并不成直接的比例关系。

特定的低生长速率反而有助于特定的高乳酸乳球菌肽的生成速率。

比如，用难吸收的糖和营养物创造一个营养限制环境，就会有一个低的特定生长速率，更高的特定的生成速率。

此外，培养基的营养物浓度低比浓度高时，乳酸乳球菌肽的特定生成速率更高。

总之，在连续培养中，乳酸乳球菌肽合成的最高水平出现在低的特定的生长速率时。

４.特定的菌耐受乳酸乳球菌肽的最高浓度不同，也会影响肽的生产水平。

有研究表明，不同的菌携带相同的乳酸乳球菌肽转座子会产生不同最高浓度的肽。

尽管额外的营养提供给菌去生产乳酸乳球菌肽，但是超过那种菌的乳酸乳球菌肽的最高浓度之后，产肽量也不会再增加。

原因可能是由于终产物限制。

而且已经证明了，酸乳球菌肽的生产受高浓度酸乳球菌肽的限制。

因此，酸乳球菌肽的最大产量似乎是依赖于菌的。

５.环境或基因修饰并不能轻易改变一个菌产酸乳球菌肽的最高浓度，但是，下面这种情况可以做到。

它采取两相分批培养，产生的酸乳球菌肽会转移到有机相中，从而降低水相中酸乳球菌肽的浓度。

这比单一相分批培养生产的酸乳球菌肽的总量明显调高。

又报道了另外一种情况，一个产乳酸乳球菌肽的菌变成一个自然抗红霉素的突变体需要有一个增加的抗酸乳球菌肽的特性并且有一个增加的产乳酸乳球菌肽的特性。

当四个基因在突变菌株中表达时，突变菌与亲代菌并无不同。

因此，在这种情况下，乳酸乳球菌肽的产量提高的原因并不是由于抗菌蛋白水平的增加。

而是抗乳酸乳球菌肽的能力增加，而且也受到红霉素抗性突变的多重影响。

总之，需要指出是此研究只是实验室水平的，没有在发酵罐中进行。

６.在此项研究中，将pND300转入产乳酸乳球菌肽的菌中能够提高乳酸乳球菌肽的最高浓度。

pND300中含有５个抗菌基因中的４个基因，这些基因可能有助于提高乳酸乳球菌肽的生成水平，通过提高乳酸菌对乳酸乳球菌肽的抗性来实现。

因此，pND300能修饰乳酸乳球菌肽的合成过程。

对抗菌系统的单独元件进行详细分析可能会显著提高乳酸乳球菌肽的生成速率和水平。