功能性便秘幼儿肠道菌群的16SrDNA和REP-PCR检测分析及效果评价

功能性便秘幼儿肠道菌群的16SrDNA和REP-PCR检测分
析及效果评价
组中分离纯化提取DNA，按说明书进行操作，提取后迅速置于-20℃环境下保存待用。

1.2.1 16SrDNA检测首先，采用1%琼脂糖凝胶电泳对基因组DNA进行检测抽提;其次，利用聚合酶链反应（PCR）法进行扩增，并用2%的琼脂糖凝胶电泳检测混合后的同一样本的PCR产物，并采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）对PCR产物进行切胶回收，随即采用Tris-HCl对其进行洗脱;然后，根据电泳检测的初步定量结果，采用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统（Promega公司）对PCR产物进行检测定量，随即根据每个样本的测序量具体要求，对其按比例进行混合;最终，构建Illumina平台文库，并采用Illumina平台测序。

1.2.2 REP-PCR检测采用BOX-PCR、ERIC-PCR、ERIC2-PCR、（GTG）5-PCR进行细菌基因组内重复序列检测，同时采用REP-PCR技术对其进行分析。

其中，BOX-PCR、ERIC2-PCR和（GTG）5-PCR采用单引物扩增，ERIC-PCR和REP -PCR采用双引物扩增。

引物序列为：BOXA -1R 5′-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3′;ERIC1f 5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，ERIC2r 5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′（ERIC2r作为单引物用于ERIC2 -PCR）;（GTG）5 5′-GTGGTGGTGGTGGTG -3′;REP1r 5′-IIIICGICGICATCIGGC -3′，REP2I 5′-ICGICTTATCIGGCCTAC-3′。

所有引物均来自Invitrogen 公司（美国英杰生命技术有限公司）。

扩增体系（50 μL）由50 ng DNA模板，1.5 U Hot Start Taq DNA聚合酶（TaKaRa，Dalian，China），1×PCR buffer（包含2.5 mmol/L MgCl2），2 mmol/L引物，200 mmol/L dNTP组成。

REP-PCR 扩增过程：除预变性95℃ 7 min和最后65℃延伸16 min外，还需进行35个循环，每一循环的过程在94℃环境下进行3 s的变性，在92℃的环境下进行30 s的变性，随即退火1 min，并在
65℃的环境下进行8 min的延伸。

其中，REP-PCR和（GTG）5 -PCR应在40℃的环境下进行退火，ERIC-PCR、ERIC2-PCR和BOX-PCR应该在50℃的环境下退火。

1.2.3 凝胶电泳分析采用1.5%的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行分离，随后应用溴化乙锭（EB）染色，并在5 V/cm的条件下电泳，时间为3 h，电泳结果在UVI全自动凝胶成像分析系统（UVItec）上拍照，最后采用Quantity One 1-D Analysis Software进行指纹图谱相似性分析。

1.3观察指标
①比较两组的肠道常驻菌及优势菌群在门水平差异性;②比较两组的肠道常驻菌及优势菌群在属水平差异性;③计算16SrDNA和REP-PCR检测的灵敏度和特异度：假设真阳性人数为a，假阳性人数为b，假阴性人数为c，真阴性人数为d，则灵敏度=[a/（a+c）]×100%，特异度=[d/（b+d）]×100%。

1.4统计学方法
采用SPSS21.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t 检验。

计数资料以[n（%）]表示，采用Z检验，并绘制ROC曲线以AUC值评价各指标诊断价值，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 两组的肠道常驻菌及优势菌群在门水平差异性比较
对照组肠道菌群中放线菌门（Actinobacteria）水平明显低于观察组（P<0.05），对照组肠道菌群中变形菌门（Proteobacteria）水平明显高于观察组（P<0.05），两组肠道菌群中无壁菌门（Tenericutes）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、梭菌属门（Fusobacteria）水平比较无明显差异（P>0.05），见表2。

2.2 两组的肠道常驻菌及优势菌群在属水平差异性比较
对照组肠道菌群中副杆状菌属（Parabacteroides）、拟杆菌属（Bacteroides）水平明显低于观察组，对照组肠道菌群中普氏菌属（Prevotella_9）水平明显高于观察组（P<0.05），见表3。

2.3 两种检测方法的灵敏度和特异度比较
16SrDNA检测的灵敏度为87.17%，特异度为92.03%，REP-PCR检测的灵敏度为85.29%，特异度为84.25%，差异有统计学意义（P<0.01），见表4、封三图1。

3讨论
便秘是临床上常见的幼儿疾病，儿童便秘中约有95%为功能性便秘，其发病机制尚不清楚，治疗手段尚不成熟。

功能性便秘的发生受饮食、地域等多方面影响，因此，时代的快速改变导致婴幼儿功能性便秘发病率迅速增高，目前已成为全球性疾病[12]。

陈焕等[13]在报道中指出，尽早诊断及治疗是提高功能性便秘治疗效果的关键，能预防幼儿功能性便秘的恶化，同时能减少功能性便秘对幼儿生长发育的影响，具有重要的临床意义。

因此，临床越发致力于功能性便秘的诊断和治疗。

现阶段，多项报道指出，正常机体胃肠道中存在大量细菌并构成肠道微生态平衡，细菌种数多达500种，总数量高达1×1014个，而功能性便秘的发生受肠道菌群失衡的影响，表现为放线菌门、副杆状菌属、拟杆菌属水平升高，变形菌门、普氏菌属水平降低，可引起神经系统和肠功能改变，尤其当患儿处于0～3岁生长发育关键阶段时，治疗的不及时会严重阻碍患儿身体各系统的发育及智力的完善，大小便失禁成为患儿常见症状[14-15]。

因此，通过对肠道菌群进行分析可为功能性便秘的临床检测和治疗提供新的方向。

据研究，人粪便重量的60%是細菌，因此，肠道菌群的分析主要借助于粪便标本，是远端结肠腔内环境的主要代表[16]。

以往，临床培养分离细菌的方法有较多局限，仅有25%的细菌能被检测出，敏感性差且受培养基影响大[17]。

功能性便秘患儿肠道菌群的分析为疾病的治疗提供了指导，基于患儿肠道菌群的改变，多项研究指出，可以通过菌群的调整来达到治疗效果，针对性更高。

如李豪等[18]通过应用双歧杆菌三联活菌制剂联合常规药物治疗功能性便秘，总体疗效提高，且预后质量更佳。

谢尚奎等[19]应用益生菌治疗便秘大鼠，恢复大鼠肠道菌群状态效果显著，并减少肠道排空时间。

因此，通过分析患儿肠道菌谱并进行针对性的改变，是一种新的治疗理念，值得进一步研究。

近年来，随着分子生物学的发展，传统细菌培养逐渐被分子技术所取代。

多项研究发现，几乎所有原核生物体内存在16SrDNA，最重要的是16SrDNA可以长久地保持其原有结构，并不随着生物进化而发生改变，因此，16SrDNA被临床用于检测肠道菌群，具有灵敏度、特异度高等优势，可以检测出绝大多数菌群。

目前，已有少量研究将16SrDNA检测应用于菌群的分析，如李柏胜等[20]将16SrDNA检测用于肝硬化患者肠道细菌毒性的研究，检测效果显著。

而本研究是将16SrDNA检测应用于多功能便秘患儿的肠道菌群分析，原理一致，研究结果显示，16SrDNA检测的灵敏度为87.17%，特异度为92.03%，价值显著。

同时，相关文献报道，一般情况下，细菌基因组内存在大量重复性较高的短序列，在此基础上，临床逐渐衍生出REP-PCR技术，尤其是BOX-PCR、ERIC-PCR、ERIC2-PCR、（GTG）5-PCR、REP-PCR等技术，其检测机制为通过提供清晰准确的DNA指纹图谱来显示菌群种类，特异度和灵敏度表现出一定的优势，目前在生物遗传多样性方面已有广泛应用，而本研究是将REP-PCR技术应用于微生态菌群多样性的分析中，原理一致，本研究结果显示，REP-PCR 检测的灵敏度为85.29%，特异度为84.25%，价值显著。

通过分析正常幼儿和患儿的肠道菌群在门、属水平的差异，研究结果显示，在门水平，对照组肠道菌群中放线菌门水平明显低于观察组，对照组肠道菌群中变形菌门水平明显高于观察组，两组肠道菌群无壁菌门、厚壁菌门、拟杆菌门、梭菌属门水平比较无明显差异，同时，在属水平，对照组肠道菌群中副杆状菌属、拟杆菌属水平明显低于观察组，对照组肠道菌群中普氏菌属水平明显高于观察组，
证明多功能便秘的肠道菌群具有明显的特异性改变，两种分子检测方法具有显著优势，对临床诊治指导价值高。

综上所述，应用16SrDNA和REP-PCR检测分析功能性便秘幼儿肠道菌群具有重要价值，并针对性指导治疗，值得在临床推广。

[参考文献]
[1] 徐娜娜，范文廷，毕茹茹，等. 功能性便秘患者肠道菌群分析及肠道菌群调节作用的研究进展[J]. 临床检验杂志，2018，36（1）：34-36.
[2] Huang Y，Wang X，Li X，et al. Successful fecal bacteria transplantation and nurse management for a patient with intractable functional constipation：A case study[J]. Holistic Nursing Practice，2016，30（2）：116.
[3] 黄文献，王和平，王玉蕾，等. 高通量测序检测肺炎婴幼儿抗生素治疗前后肠道菌群变化[J]. 中国微生态学杂志，2016，28（5）：497-500.
[4] Liu D，Li T，Zheng H，et al. Study on alterations of physiological functions in aged constipation rats with fluid-deficiency based on metabonomic and microbiology analysis[J]. Rsc Advances，2017，7（76）：48136-48150.
[5] 付雯，刘兴隆，张珑琼，等. 3种方法治疗肠道菌群失调合并过敏性哮喘大鼠对肠道菌群的影响[J]. 重庆医学，2017，46（25）：3477-3479.
[6] 杜喜峰，冯晋兴，于爱真，等. 深度测序分析早产儿坏死性小肠结肠炎肠道菌群多样性变化[J]. 中国妇幼保健，2017，32（19）：4700-4702.
[7] Meij TG，Groot EF，Eck A，et al. Characterization of microbiota in children with chronic functional constipation[J]. Plos One，2016，11（10）：e0164731.
[8] 黄林生，屈潇，孔程，等.合生元对慢性功能性便秘患者肠道特定菌群的影响及其功能注释[J].中国全科医学，2019，22（3）：296-301.
[9] 刘龙，龚晗，杨彪，等. 鹅肥肝形成中肠道生理指标、菌群及代谢物的变化[J]. 扬州大学学报：农业与生命科学版，2016，37（4）：37-42.
[10] 蒋艾廷，李宝坤，金丹，等. 新疆塔城传统酸奶中乳酸菌的多样性及发酵特性分析[J]. 食品工业科技，2017，38（15）：122-128.
[11] 耿岚岚，刘明南，龙高，等. 儿童功能性胃肠病罗马Ⅳ标准[J]. 中华儿科杂志，2017，55（1）：4-14.
[12] 阿孜尔古丽·阿布都克日木，马兰英，孙玉萍，等. 维吾尔族结肠癌患者肠道菌群的分布情况研究[J]. 现代生物医学进展，2016，16（12）：2227-2230.
[13] 陈焕，唐维兵. 婴儿功能性便秘的诊治现状[J]. 中国医师杂志，2017，19（3）：349-351.
[14] 高祀龙，刘颖，刘曼，等. 酒精性肝病患者肠道菌群变化与肝功能的相关性研究[J]. 广东医学，2017，38（16）：2484-2486.
[15] Ren RR，Sun G，Yang YS，et al. Chinese physicians’perceptions of fecal microbiota transplantation[J]. World Journal of Gastroenterology，2016，22（19）：4757-4765.
[16] 张弘，蒋勇军，张远瞩，等. 基于PCR-DGGE和拟杆菌（Bacteroides）16S rRNA 的岩溶地下水粪便污染来源示踪研究：以重庆南山老龙洞地下河系统为例[J]. 环境科学，2016，37（5）：1805-1813.
[17] Tully DC，Ogilvie CB，Batorsky RE，et al. Differences in the selection bottleneck between modes of sexual transmission influence the genetic composition of the HIV-1 founder virus[J]. Plos Pathogens，2016，12（5）：e1005619.
[18] 李豪，杨永志，袁耀宗，等. 双歧杆菌三联活菌制剂治療功能性便秘临床疗效Meta 分析[J]. 中国微生态学杂志，2016，36（8）：724-728.
[19] 谢尚奎，任东林，鲜振宇，等. 结肠慢传输型便秘大鼠肠道菌群的变化及益生菌的干预效果[J]. 广东医学，2016，37（3）：325-327.
[20] 李柏胜，谢兰丰，刘岩红，等. 肝硬化自发性细菌性腹膜炎患者粪便大肠杆菌毒力基因Colv和腹水细菌分布的相关性[J]. 肝脏，2017，22（5）：424-426.
（收稿日期：2019-03-14）
感谢您的阅读！。