2011级硕士研究生细胞培养与细胞操作重点

1.细胞培养的概念
指从体内取出组织、细胞制成单个细胞悬液在体外模拟体内生理环境,在无菌、适当温度和一定的营养条件下,使其生存和生长,并维持其结构和功能特性,继续存活与增殖。

培养过程中细胞不再形成组织。

也可用已建系的细胞株复苏后继续培养,多是癌细胞。

目的:进行后续的生命科学研究—细胞操作
2.利用细胞培养技术进行生命科学研究的优点
1.研究的对象是活的细胞:在实验过程中,根据要求可始终保持细胞的活力,并可长时期的监控、检测甚至定量评估一部分活细胞的情况。

2.研究的条件可以人为控制:根据需要人为控制实验条件,方便观察与分析。

3.研究的样本,可以达到均一性:通过细胞培养所得到的细胞系属同一类型的
细胞;实验条件均一。

4.研究的内容便于观察、检测和记录。

5.研究的范围比较广泛:1.多种学科均可利用细胞培养进行研究。

2.可供实验的组织来源众多。

6.研究的费用相对较经济:细胞培养可以大量提供在同一时期、条件相同、性状相似的样本。

3.试述影响体外培养细胞生长的各种因素。

(一)无毒无污染细胞培养环境:离体细胞缺乏防御能力,在有污染物和毒性物
质的环境中生存可造成细胞生物学特性改变,甚至中毒死亡。

(二)恒定的生长温度:组织和细胞培养的最适温度为35~37℃,培养细胞对低温的耐受力比对高温强。

(三)
合适的气体环境:开放培养时一般把细胞置于95%空气加5% CO2混合气体环境中
(四)pH缓冲系统:培养环境需保持pH值恒定,大多数细胞的适宜pH值为7.2~7.4。

(五)理想的渗透压:细胞必须生活在等渗环境中,大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性。

(六)湿度和光:开放培养相对湿度控制在95%以上。

细胞培养需避光。

(七)其他因素:放射线、机械振动、接触橡胶用品、细胞接种密度的大小都会对细胞产生影响,培养细胞、培养液或其它培养试剂应放在固定的位置,收集细胞时离心速度不宜过大,细胞接种密度对细胞的生长也有影响。

4.细胞培养过程中常见的污染来源和污染类型有哪些?叙述各污染类型的特征。

(一)不洁净空气;(二)消毒不彻底;(三)操作不当;(四)不洁组织标本;(五)使用污染血清
(一)细菌污染的特征
1.多在传代、换液、加样等开放性操作之后发生,
2.常见污染细菌:大肠埃希菌、假单孢菌、白色葡萄球菌、枯草杆菌等,
3.培养液变混浊,pH降低,颜色变黄,
4.由于细菌增殖迅速,发生污染48h以内就很明显,细菌污染易发现
(二)真菌污染的特征
1.较常见,炎热潮湿的季节多发,
2.真菌种类繁多:白念色珠菌、酵母菌等,
3.培养液变化:呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面,肉眼可见,
4.镜下观察:丝状、管状或树枝状菌丝,纵横交错穿行于细胞之间,
5.真菌生长迅速,短时间内抑制细胞生长、产生有毒物质杀死细胞,真菌污染不难发现
(三)病毒污染的特征
1.病毒寄生有种属特异性,污染的概率相对其他微生物较小,
2.病毒颗粒微小,污染难于发现,一般的实验室都没有能力检查,
3.以前病毒的形式整合在细胞染色体上,或以质粒形式存在于胞质中,随细胞分裂传到子代细胞,导致细胞发生变异、转化,形成异倍体细胞系,
4.潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题,
5.还会对进行某种未知病毒分离鉴定造成干扰
(四)支原体污染的特征
1.最常见,培养液中加入的血清通常是支原体污染的来源,
2.支原体:直径0.2~2μm,无细胞壁,形态多样,一般过滤除菌无法去除,
3.适于偏碱条件下(pH7.6~8.0)生存,对酸
耐受性差,对热敏感,对青霉素抗药,4.培养基变化:pH不变,培养液不混浊,培养的细胞形态无明显变化,5.影响:DNA合成、代谢减慢、生长抑制
(五)细胞交叉污染
1.有些变化较轻微、不易察觉,
2.严重时,污染的细胞优势生长,培养的目的细胞生长受抑,最终死亡,
3.目前世界上已有几十种细胞都被Hela细胞所污染,许多实验宣告无效
(六)化学和物理性污染
1.最常见的化学性污染:玻璃制品清洗残留的变性剂、肥皂、未纯化的试剂、水、血清、生长辅助因子,
2.培养环境中的物理因素:放射线、辐射(紫外线或荧光)会对细胞产生影响,
3.一般来说,这两种污染较少发生,在操作过程中只要细心,很容易避免
5.细胞培养过程中,微生物污染的预防措施有哪些?
(一)器皿准备中的预防
1.细胞培养所用器材清洗、消毒要彻底,
2.各种溶液灭菌除菌要仔细,无菌试验阴性后才能使用,
3.操作室及剩余的无菌器材定期清洁消毒灭菌,
4.器皿的运输、贮存过程中,严格操作,谨防污染
(二)操作前的预防
1.事先要严格检查器材、溶液和培养物,不要把污染品或未经消毒的物品带入无菌室内,更不能随便使用,
2.进无菌室前要用肥皂洗手或用5%新洁尔灭浸泡5min,穿隔离衣、戴无菌鞋帽、口罩和手套,
3.操作前提前30min启动超净台的紫外灯消毒,
4.定期清洗或更换超净台的空气滤网,定期检查超净台的空气净化标准
(三)操作过程中的预防
1.进入无菌室后要关好门,尽量少走动,少谈话,
2.超净台内放置的培养瓶瓶口方向不能与风向相逆,
3.工作开始前先用75%酒精棉球擦瓶口和烧灼瓶口,
4.不要过早开启培养液瓶口,开瓶后应保持斜位,避免直立,不再使用培养液应立即封口,
5.操作动作要轻,在安装吸管、开启或封闭瓶口时必须在火焰周围无菌区内,并将吸管冒和瓶口转动烧灼。

不允许用手触及器皿的无菌部分,
6.在进行换液或传代操作时,应专管专用。

吸管不要触及细胞培养瓶瓶壁,如果吸管口接触手和其他物品,应弃去,
7.尽量不要同时操作两种或两种以上细胞株,
8.实验完毕及时清理好工作台面,保持实验室清洁,消毒台面
(四)其他预防措施
1.及早冻存培养物,保留种子细胞,一旦发生污染可复苏,重新培养,
2.为避免诱导抗药细菌,应定期更换培养系统的抗生素,
3.对新购入的细胞株应加强观察,防止外来污染源
6.试述细胞培养所用血清的类型及其主要成分。

血清类型:胎牛血清、新生牛血清、小牛血清兔血清、马血清;胎牛血清质量最好。

牛血清成分:1.蛋白质:白蛋白,球蛋白、激素类蛋白、纤维粘连素促进细胞附着、α2 巨球蛋白抑制胰蛋白酶的作用、转铁蛋白。

2.多肽:血小板促生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子。

3.激素:胰岛素:促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸,与促细胞分裂有关。

类胰岛素生长因子。

促生长激素。

氢化可的松:能兼有促细胞贴附和增殖作用。

4 其他成份:氨基酸、葡萄糖、微量元素:对细胞培养有意义
7.贴壁细胞贴附和铺展的意义。

贴附:贴附于固相表面是锚定依赖性细胞生命活动的基本要求,细胞被接种到培养器皿内以后首先要发生粘附,是细胞培养以后能否成功的第一步.
铺展:(1)铺展状况是调节细胞形状的主要方面:铺展得越好,细胞越扁,细胞与生长基质表面接触面越大。

(2)铺展状况与细胞的生长有密切关系:铺展状况制约细胞的分裂增殖活动过程,只有当细胞铺展到合适的程度DNA合成才开始进行。

8.培养环境中维持5%的CO2的意义。

开放培养时一般把细胞置于95%空气加5% CO2混合气体环境中。

CO2调节培养液的pH值:1.在细胞生长的过程中,会排出一些代谢废物,使培养基的pH值发生变化,当累积到一定程度时,就会影响细胞的生长,所以要用CO2来缓冲。

2.如果没有CO2,要维持培养液的一个相对稳定、正常的pH值,就需要较为频繁的换液,但过于频繁的换液,细胞适应起来便比较困难,从而也会影响细胞的生长状态。

9.原代细胞的各种分离方法及其原理是什么?
(1)离心法:在离心机下1000r/min低速离心10min,离心后不同比重细胞在分层液的不同层,从而把细胞分离开。

(2)机械分离法:吸管吹打、电磁搅拌、摇珠瓶中振荡,细胞团块得以充分的分散,从而制成大量单个细胞的细胞悬液。

(3)消化分离法:应用酶的生化作用和非酶的化学作用进使细胞间的桥连结构松动,块状变成絮状,使细胞分散开。

10.原代培养、传代、细胞系、细胞株
1.原代细胞:是指来源于胚胎、组织、器官及外周血,经特殊分离方法制备而来的初代培养细胞。

2.传代:原代培养细胞形成的单层细胞汇合以后,进行分离培养的过程。

3.细胞系:传代细胞若能稳定生长传至10~20代以上可确立为细胞系。

4.细胞株:通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的克隆化细胞群。

11叙述悬浮细胞、半贴壁细胞和贴壁细胞的传代方法。

1.悬浮生长细胞的传代:离心传代法:将细胞悬液转移到离心管内
800~1000r/min离心5min,弃上清加新的培养液到离心管内吸管吹打成为细胞悬液分瓶(皿)培养;直接传代法:悬浮细胞自然沉淀瓶底用吸管吸去上清1/2~2/3轻轻吹打成细胞悬液等分装入数个培养瓶
2. 贴壁细胞的传代
(1)弃去旧培养液,(2)漂洗:加入2mll 无钙镁PBS,漂洗1次后倒掉,(3)消化:加入消化液,使之铺满细胞表面,显微镜下发现细胞回缩变圆,间隙增大,立即终止消化,(4)吹打:加入完全培养基5ml,用吸管按顺序进行反复吹打瓶壁,(5)调整至合适细胞浓度,分瓶培养
3. 半贴壁细胞的传代:直接吹打,或者硅胶软刮刮除法。

12试述体外培养细胞的生命期及各期特点。

原代培养期:也称初代培养,从体内取出组织接种培养到第一次传代。

特点:(1)原代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。

细胞活跃,可见细胞分裂,但不旺盛。

(2)细胞群是异质的,细胞相互依存性强。

(3)原代培养细胞多呈二倍体核型。

(4)和体内细胞性状相似性大,是检测药物很好的实验对象。

传代期:当细胞增殖达到一定密度后,需要分离出一部分细胞和更新营养液,这一过程叫传代。

1. 在全生命期中传代期的持续时间最长,2. 在培养条件较好情况下,细胞增殖旺盛,并能维持二倍体核型,3.传代10~50次左右,细胞增殖逐渐缓慢,以至完全停止。

衰退期:细胞仍然生存,但增殖很慢或不增殖,最后衰退凋亡。

13.细胞冻存冷冻保护剂的种类和作用原理。

保护剂的种类:1. 渗透性保护剂:甘油、二甲基亚砜、丙二醇、乙二醇。

属低分子中性物质,易与溶液中水分子结合,易于穿透细胞。

2. 非渗透性保护剂:聚乙烯吡咯烷酮(PVP),蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白等。

属大分子物质,不能穿透细胞。

作用原理:冰晶形成之前,优先结合溶液中水分子,降低细胞外溶液的电解质浓度,减少阳离子进入细胞的数量。

1. 与溶液中水分子结合,使溶液粘性增加,冰点下
降,弱化水的结晶过程,减少冰晶形成 2. 维持细胞内外一定的电解质浓度,减少溶质损伤
14.细胞冻存和复苏过程中,为什么要尽可能防止冰晶形成?防止冰晶形成的措施有哪些?
冰晶对细胞的损害:1. 对细胞造成机械损伤,胞内冰晶还可导致超微结构的破坏,2. 细胞外冰晶导致细胞内脱水,电解质浓集,蛋白质变性、沉淀,3. 溶液渗透压和局部pH值变化对细胞形成损伤
措施:1. 程序化冷冻:缓慢冷冻使细胞逐步脱水,细胞内不致产生大的结晶;快速复苏防止小冰晶形成大冰晶,2. 加入冷冻保护剂,3. 抗冻蛋白:降低冰点;吸附于结晶的棱状表面,阻止冰晶的生长,抑制冰晶重结晶;在低温时能与细胞膜作用,封闭离子通道,阻止溶质渗漏,从而保护细胞膜的完整性。

15.培养细胞纯化的方法有哪些?
(一)自然纯化:利用某类细胞的增殖优势,在长期传代过程中靠自然淘汰,不断排挤其他生长慢的细胞,最后留下生长旺盛的细胞,达到细胞纯化的目的。

(二)人工纯化:利用人为手段造成某一细胞生长有利的环境条件,抑制其他细
胞的生长达到纯化细胞目的方法:1. 胰蛋白酶消化法:是常用的纯化方法2. 机械
刮除法3. 反复贴壁法4. 克隆法5. 细胞因子依赖纯化法
16.试述肿瘤细胞培养过程中成纤维细胞的几种排除方法。

原代培养时,培养物中混有正常成纤维细胞,误认为癌细胞,比肿瘤细胞生长快,最终可抑制肿瘤细胞生长,尽早排除,成为肿瘤细胞长期培养建系的关键。

(1)机械刮除法:在镜下,培养皿背面圈下肿瘤细胞的生长部位,然后用橡胶刮刮无标记区域,PBS液洗去被刮掉细胞,继续培养,反复刮除直至完全除掉成纤维细胞。

(2)反复贴壁法:根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点,结合使用不加血清的营养液,把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁,使两类细胞相互分离。

(3)消化排除法:0.5%胰蛋白酶和0.02%EDTA(1:1)混合液消化细胞,成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落,反复处理可把成纤维细胞除净。

(4)胶原酶消化法:0.5mg/ml的胶原酶消化处理,边消化边在倒置显微镜下窥视,当发现成纤维细胞被除掉后,终止消化,PBS洗涤处理一次后,更换培养液,继续培养。

(5)密度梯度离心法:用泛影葡胺和聚蔗糖制备成比重1.025~1.085的密度梯度,加入细胞悬液后,在23℃中2500r/min离心 10min。

比重1.025~1.050层为成纤维细胞,比重1.050~1.085层为上皮细胞。

17.试述细胞凋亡的检测方法及各方法的原理。

(1)细胞凋亡的形态学检测:利用光学显微镜﹑倒置显微镜﹑荧光显微镜﹑共聚焦显微镜﹑电子显微镜﹑扫描电镜等技术,观察细胞的形态变化,凋亡小体的形成等。

(2)磷脂酰丝氨酸PS外翻分析:磷脂酰丝氨酸正常位于细胞膜的内侧,凋亡早期可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面,暴露在细胞外环境中,利用Annexin-V与PS高亲和力特异性结合,将标记了的Annexin-V作为荧光探针利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。

(3)Annexin V/PI双染色法:膜完整细胞对PI(碘化丙啶)拒染,坏死细胞通过。

用Annexin V结合在细胞膜表面作为凋亡的指示,出现Annexin V/PI双染色法。

(4)线粒体膜势能检测:荧光染料JC-1、TMRM等对线粒体膜电位非常敏感,使其结合到线粒体基质上,其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜负性的增高或降低。

(5)DNA片段化分析:细胞凋亡染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成180~200bp 整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱。

(5)TUNEL测定法:细胞凋亡时,内切酶切断DNA,使3’-OH端暴露出来,用荧光素或生物素标记的脱氧尿三磷酸和末端脱氧核苷酸转移酶相反应,DNA断裂点越多,标记物结合越多。

(6)caspase-3测定:caspase-3是促进细胞凋亡的蛋白质,其活性增强,凋亡就极有可能被诱发。

18.培养活细胞的显微镜观察方法有哪几种?染色观察活细胞常用的染料有哪些,各对什么状态的细胞着色?
培养活细胞的显微镜观察方法有:倒置显微镜观察,相差显微镜观察,暗视野显微镜观察,缩时显微摄影技术,激光共聚焦显微镜观察。

常用的染料:(1)中性红染色:常用的活体染色染料,可直接浸染活体细胞后显微镜下观察,或者用于细胞的病毒蚀斑,肉眼计数空斑数目。

此种染料毒性大,染色后细胞不能再培养。

(2)结晶紫染色:对死、活细胞均着色,故只能测出细胞总数。

(3)台盼蓝拒染染色:只对死细胞着色,可测定活细胞数和计算存活百分率。

19.了解几种电镜观察分析培养细胞方法的主要特点和用途。

①透射电镜:分辨率高(0.2nm),放大倍数可达百万倍,可用来观察组织和细胞
内部的超微结构、微生物和生物大分子的全貌。

②扫描电镜:景深长,图像立体感强,可用来观察生物样品的各种形貌特征,分辨力6~10nm,有效放大倍率为20000倍。

③电子探针:采用晶体分光光谱法测定X射线的波长和强度来分析样品成分的仪器,主要用于探测微小区域的元素成分。

④分析电镜:在观察超微结构的同时,对样品中一个极微小的区域进行化学分析,从而在超微结构水平上测定各种细胞结构的化学成分及其变化规律。

⑤扫描透射电镜:能观察较厚的样品,分辨本领和成像质量都很好。

20.熟悉培养细胞活力检测的方法。

在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞;活细胞中生理活动和代谢能力也有差别。

(1)活细胞百分率检测:用台盼蓝染色后,活细胞拒染,死细胞染成蓝色,计数细胞,计算存活率。

(2)MTT法:活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原
为不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。

二甲基亚砜能溶解细胞中的甲臜,在490nm波长处测定其光吸收值,MTT结晶形成的量与活细胞数成正比,间接反映代谢正常活细胞数量。

(3)XTT法:作为线粒体脱氢酶的作用底物,被活细胞还原成水溶性的橙黄色甲臜产物,水溶性甲臜吸光度与活细胞数量成正比。

(4)CCK-8法:被活细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物,
生成的甲臜的量与活细胞数成正比。

(5)3H-TdR 掺入法:用同位素3H标记胸腺嘧啶核苷即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DNA合成代谢过程,通过测定细胞的放射性强度,可以反映细胞DNA的代谢及细胞增殖情况。

21.试述细胞增殖生长状况相关指标的检测方法及各方法的原理。

细胞增殖生长状况相关指标的检测:①细胞计数,测定的重要手段。

②细胞生
长曲线和倍增时间,生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标,是测定细胞绝对增长
数值和细胞增殖基本规律常用的简便方法。

③细胞分裂指数,分裂细胞占全部细胞百分比,表示细胞增殖旺盛程度。

④细胞贴壁率,观察贴壁附着细胞的生存能力和部分底物材料的生物相容性。

⑤克隆形成率,反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。

⑥细胞增殖周期,利用培养细胞来研究细胞动力学、细胞的DNA合成代谢和有丝分裂。

22.细胞DNA、RNA和蛋白质提取方法有哪些,其中核酸提取应注意哪些方面?
(1)单一组分提取法。

(2)多组分同时提取法,应用TRIzol试剂快速分离总RNA,同时又有RNA、DNA和蛋白质多组分分离作用。

TRIzol试剂能抑制细胞释放出的核酸酶,保持RNA 的完整性。

核酸提取应注意:1.保证结构的相应完整性;2.排除其它蛋白质、多糖等大分子的污染;3.提取样品中不含对酶有抑制作用的有机溶剂及高浓度的金属离子。

23.RNA提取过程中为什么要避免RNase污染,预防RNase污染的注意事项有些?
RNA酶(RNase)是导致RNA降解最主要的物质,非常稳定,在极端的条件可暂时失活,因素去除后又迅速复性。

高温高压蒸汽灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的RNase完全失活,广泛存在于皮肤上。

预防RNase污染的注意事项有:①必须戴手套,且经常更换。

②RNA在TRIzol试剂中时不会被RNase污染,提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻
璃器皿。

③配制溶液应使用无RNase的水。

24.试述FCM检测的基本原理及其在临床和科研中的应用。

FCM检测就是细胞在通过仪器测定装置的一瞬间,可快速对大量测定、存贮、显示悬浮在液体中细胞的一系列重要生物、物理、细胞化学指标,进行专业软件的大量细胞数据分析,并可根据预选的指标把指定的细胞群分选出来。

FCM在临床中的应用主要有淋巴细胞亚群分析和白血病分型。

FCM在生物医学科研中的应用有:①研究课题中的细胞生物学指标;②免疫功能紊乱与疾病的相关性;③干细胞研究;④某特定细胞群;⑤血细胞分化、发育研究;⑥细胞因子及受体测定;⑦药物动力、药效分析。

25.叙述蛋白免疫印迹技术(Western Blot)的原理和简要的操作步骤。

原理:Western Blot技术是一种蛋白质的固定和分析技术。

经过聚丙烯酰胺凝胶分离的蛋白质样品,转移到固相载体上以非共价键形式结合,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变,能与特异性抗体结合。

第一抗体与膜上特异抗原结合后,再用标记的二抗来检测,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

操作步骤:①生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白;②SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离;③蛋白质条带原位转移到固相膜上;④将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育,以封闭其非特异性位点;⑤加入特异抗性体(一抗),膜上的目的蛋白与一抗结合后,再加入带标记的二抗; ⑥通过特异性反应显色进行检测;
27.密度梯度离心中速率区带离心和等密度离心原理分别是什么?最主要的区别在哪里?速率-区带离心的原理:不同颗粒之间存在沉降系数差时,在一定离心力作用下,颗粒各自以一定速度沉降,在密度梯度不同区域上形成区带的方法。

等密度离心原理:当不同颗粒存在浮力密度差时,在离心力场下,在密度梯度介质中,颗粒或向下沉降,或向上浮起,一直移动到与它们各自的密度恰好相等的位置上形成区带,从而使不同浮力密度的物质得到分离。

区别:两者的离心离心介质、密度梯度范围与速率—区带离心不同,等密度离心中欲分离的颗粒密度处于离心介质密度范围内,介质梯度不需预先制备。

28.叙述流式细胞仪中两个散射光与细胞特性关系
侧向角散射光(SSC):反映细胞的颗粒性,侧向散射光虽然也与细胞的形状和大小有关,但它对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感,也能对细胞质内较大颗粒给出灵敏反映。

前向角散射光(FSC):反映细胞的大小,对同种细胞群体随着细胞截面积的增大而增大;对球形活细胞经实验表明在小立体角范围内基本上和截面积大小成线性关系;对于形状复杂具有取向性的细胞则可能差异很大,尤其需要注意。

29.为什么无限细胞系的形成主要发生在传代期末或衰退期初?
无限细胞系由正常细胞转化而来,细胞发生转化并非单个分子时件,而是一个多步骤的过程,一般需要多个基因的改变,一个细胞要积累这些基因改变,一般需要较长的时间。

传代期末和衰退期初,有害因素妨碍细胞代谢老化进程加快,使细胞生长与增殖调控严重紊乱细胞获得永生性或恶性性,发生转化。

此期的细胞具有以下特点:1. 老化细胞癌基因容易被激活, 2. 老化细胞基因突变几率较大,3. 老化细胞结构蛋白、酶蛋白、受体蛋白合成减少,摄取营养和修复染色体损伤的能力均下降,4.端粒缩短趋向于永生。

处于传代末期和衰退期的老化细胞发生转化时,更容易将其永生性或恶性性的“遗传优势”传递给子代细胞,从而形成无限细胞系
30细胞核的分离技术和细胞脱核技术
细胞核的分离是将不同组织来源的细胞经匀浆后,进行分级离心、分析,最后得到纯化的细胞核。

全部操作须在冰浴中进行,所用溶液须预冷。

细胞脱核技术,采用物理或化学方法把细胞核从细胞中分离出来,形成无核的胞质体和无胞质的核质体,用作细胞融合、胞质、胞膜、胞核的成分分析以及开展染色质基因转移技术等。