含菌丝体林可霉素发酵液的预分散溶剂萃取

华　东　理　工　大　学　学　报
Journal of East Ch ina U niversity of Science and T echno logy
V o l .29N o.52003210
基金项目:国家自然科学基金(20025618,20236010);上海市教委资
助项目
E -ma il :h lliu @ecust .edu .cn 收稿日期:2002210228
作者简介:张　欣(19732),女,硕士,研究方向:物理化学。

文章编号:100623080(2003)0520496204
含菌丝体林可霉素发酵液的预分散溶剂萃取
张　欣,　张　平,　蔡水洪,　刘洪来3(华东理工大学化学系,上海200237)
摘要:以醋酸丁酯为萃取溶剂,采用预分散溶剂萃取法从含菌丝发酵液中直接萃取林可霉素。

实验结果表明:由于胶状液沫、胶状气沫和菌丝体的相互作用,被萃取液中适量菌丝体的存在有利于萃取和分层,分层效果好于不含菌丝体的林可霉素水溶液。

当发酵液的菌丝体含量控制在15～150g L 时,分层效果较好,油相富集迅速,在实验条件下一次萃取率最高可达78.6%。

关键词:预分散萃取;林可霉素;发酵;溶剂萃取中图分类号:O 242.1文献标识码:A
Pred ispersed Solven t Extraction of L i ncom yc i n
from Ferm en tation Broth Con ta i n i ng M yceliu m
ZH A N G X in ,　ZH A N G P ing ,　CA I S hu i 2hong ,　L IU H ong 2la i
3
(D ep a rt m en t of Che m istry ECU S T ,S hang ha i 200237,Ch ina )
Abstract :T he p redisp ersed so lven t ex tracti on of lincom ycin from ferm en tati on b ro th con tain ing m ycelium tak ing bu tyl acetate as ex tractan t has been studied .R esu lts show that the ex isting of m ycelium avails ex tracti on of lincom ycin and sep arati on of so lu ti on and ex tractan t becau se of the in teracti on am ong the co llo id liqu id ap h ron s ,co llo id gas ap h ron s and m ycelium .T he sep arati on of so lu ti on and ex tractan t is far better than that of m ycelium 2free so lu ti on s of lincom ycin .If the con ten t of the m ycelium in the ferm en 2
tati on b ro th can be con tro lled in the range of 15～150g L ,the system delam inates w ell ,o il p hase en riches qu ick ly and the m ax i m al ex tractivity can reach 78.6%under the exp eri m en tal conditi on .
Key words :p redisp ersed ex tracti on ;lincom ycin ;ferm en tati on b ro th ;so lven t ex tracti on
林可霉素(L incom ycin )属于林可胺类抗生素,由链霉菌产生或经半合成制取[1]。

目前国内对发酵
液中林可霉素的提取主要采用溶剂萃取法。

由于发酵液中含有大量的菌丝和残余培养基等固体物质(约占发酵液体积的10%)及钙、镁、铁等高价无机离子和蛋白质等杂质,它们对后续提取影响较大,必须通过过滤等方法将它们除去。

在实际操作中,由于滤渣粘稠导致过滤速度慢、劳动强度大,而且过滤操作不可避免地夹带一些林可霉素,使产品收率下降。

如何有效地从发酵液中提取林可霉素,提高其产量和质量是目前生产中急需解决的难题。

预分散萃取技术[2～6]的发展,为解决该问题提供了一种可行的途径。

研究表明,预分散萃取技术具有无需考虑乳化、相分离速率快等优点。

但以往的研究均集中于产品的后处理或废水处理,对于从含菌丝体发酵液中直接萃取发酵产物,尚未见文献报道。

本文采用预分散溶剂萃取的方法从含菌丝体发酵液中直接萃取林可霉素,考察发酵、预分散萃取一体化的可行性。

1　预分散萃取原理
预分散萃取是利用表面活性剂,预先将萃取剂
6
94
制成直径为微米级甚至亚微米级、水包油结构的胶状液沫(Co llo id L iqu id A p h ron s,CLA),制备后的CLA处于聚集状态。

萃取时,将稀释了的CLA加入到待萃溶液中,水相中的被萃物通过界面膜进入CLA中的油相。

萃取一定时间后,通入另一种直径略大、与CLA电性相反的胶状气沫(Co llo id Gas A p h ron s,CGA)。

这时,分散在水相中、负载有被萃物的CLA依靠电性吸附在CGA上并逐渐上浮,在上浮过程中达到萃取平衡并逸至液面,CGA和CLA聚并成油相,实现油水分离。

预分散萃取技术用于生物产品的分离提取具有以下优势:传质速率快,CLA的微小结构为传质提供了巨大的表面积,使萃取平衡得以快速建立,比传统萃取要快得多。

两相分层快,由于CGA与CLA 电性相反,可吸附含有被萃物的CLA逸至液面,在CGA的作用下,两相分层的速度相当快,若CGA通入速度合适,只需2～5m in就可以将CLA从水相中负载出来,而对于生物体系的传统萃取来说,这样快的分相速度显然是很困难的。

操作相比小,萃取效率高,适用于低浓度溶质的浓缩,可在1 500～1 1000的低相比条件下操作,萃取效率是相同条件下传统萃取的5～10倍,可以大大减少溶剂用量,有效地浓缩分离被萃物。

油相通过膜相与料液隔开,减少了料液的二次污染。

发酵液中杂质含量较高,有微生物细胞、代谢产物、培养基等,这些杂质的存在不仅影响产物的后续提取过程,而且对发酵过程存在着终产物的抑制作用。

发酵、分离一体化技术不但可以解决高浓度产物的反馈抑制作用,促进产量和原料转化率的提高,而且可以简化产物后处理过程,缩短生产周期。

目前使用的发酵、离子交换和发酵2过滤一体化技术,由于离子交换、过滤均在发酵体系外部进行,并不是真正意义上的发酵、分离一体化过程。

而传统萃取技术分离发酵产物时,不可避免的乳化现象、萃取剂与菌丝体直接接触造成的菌丝体污染问题以及有机溶剂的大量消耗也使一体化技术难以实施。

预分散溶剂萃取技术克服了上述缺陷,强化了过程的传质,使发酵、萃取一体化的实现成为可能。

即在发酵的同时,加入含萃取剂的胶状液沫(CLA)至发酵罐中,被萃物即被萃入CLA中,发酵结束后,通入胶状气沫(CGA)使CLA与发酵液分离。

该过程可以减少产物对发酵过程的抑制作用,提高发酵产物的产率和收率。

2　实验部分
2.1　CLA、CGA的制备
CLA的制备[3～4,7～9]:将一定量水溶性表面活性剂加入水相中,在500r m in左右的转速下搅拌,直至产生丰富的泡沫。

然后按配比慢慢滴加含有一定量油溶性表面活性剂的油相,随着白色CLA生成量的增加,油相的滴加速度可加快。

当滴加至2 3左右油相体积时,容器中已生成的CLA呈凝胶状,使油相不易均匀分散,需要减慢滴加速度。

CGA的制备[3～4,7～9]:制备装置为一带有高速搅拌装置的自制容器。

为了获取高质量的CGA,将搅拌浆叶的形状设计成上下交叉分布,可以防止涡流的形成、同时产生更为强烈的水波冲击容器壁。

当水波重新返回溶液中时,空气以微泡形式被卷入溶液中,形成稳定的CGA。

制备时将含一定量表面活性剂的水溶液高速搅拌(10000r m in),产生强烈的冲击水波,溶液体积迅速膨胀,产生大量泡沫,当溶液体积不变时,CGA即制备完毕。

2.2　含菌丝体林可霉素水溶液的配制
为便于考察菌丝体含量对萃取的影响,实验以浓度为1000u mL、体积为100mL的林可霉素水溶液为参考系统,分别加入0、0.5、1.5、2.5、3、5、10、15、25、30g菌丝固体,考察含不同菌丝体林可霉素溶液的预分散萃取效果和分层效果。

实验所用菌丝体为林可霉素发酵液经高速离心所得。

3　实验结果与讨论
3.1　萃取剂的选择
目前,工厂较多采用正丁醇作为林可霉素的萃取剂,但由于正丁醇极性大,水溶性强,不利于制备CLA。

考虑到林可霉素为碱性抗生素,与红霉素具有相似性,实验中选用醋酸丁酯作为萃取剂来萃取林可霉素,便于今后的工业化应用。

3.2　CLA、CGA表面活性剂
选用十二烷基苯磺酸钠为制备CLA的水溶性表面活性剂,Tw een280为油溶性表面活性剂;选用十六烷基三甲基溴化铵为制备CGA的表面活性剂。

实验表明,上述表面活性剂可以制得稳定、高度分散的CLA和CGA。

3.3　各种因素对萃取效果的影响
3.3.1　萃取平衡时间　由于发酵液中存在菌丝体,有可能会影响CGA的上浮速度,从而使系统达到
794
第5期张　欣等:含菌丝体林可霉素发酵液的预分散溶剂萃取
平衡的时间增加。

实验首先对萃取平衡时间进行了考察,图1为通入CGA 后的时间与萃取率的变化关系,由此看出,在CGA 通入10m in 后,萃取率基本为一常数。

因此,所有实验均在通入CGA 10m in 后取样分析。

图1　通入CGA 时间与萃取率(E )的关系
F ig .1　R elati on sh i p betw een ti m e of CGA
en trance and ex tracti on fracti on (E )
c L incom ycin =4184u mL ;pH =10;T =292.85K ;
CLA So luti on =1 50(V V )
3.3.2　温度的影响　实验发现林可霉素的分配比(D )随着温度的升高而降低。

ln D ～1 T 成线性关系(见图2),由直线斜率计算得∃H =-11.54kJ m o l 。

萃取为一个放热过程,升高温度不利于萃取的
进行,同时,预分散萃取有很大的两相接触面积,达
到平衡的时间短,故一般可以在室温下操作。

3.3.3　菌丝体含量的影响　对不同菌丝体含量的林可霉素水溶液的分层与萃取情况进行了考察,结果如表1所示。

含菌丝体的林可霉素溶液加入CLA 并分散后,表观较为浑浊:约15m in 左右,有部分乳白色CLA 状物出现在溶液上层,此时下层水相仍较浑浊,说明里面仍有大量CLA 存在;通入CGA 后,
不
图2　1 T 与ln D 关系图
F ig .2　R elati on sh i p betw een 1 T and ln D
c L incom ycin =4184u mL ;CLA So luti on =1 50(V V )
含菌丝体的林可霉素溶液几乎看不出有清晰油相出
现,上层仍为少量乳白色CLA 状物,下层水相浑浊;而含菌丝体的林可霉素水溶液分相迅速,CGA 通入完毕后,水相即变清晰,上层乳白色CLA 状物破裂为清晰油相。

当林可霉素溶液中的菌丝体含量较低时(如25g L ),固体状的菌丝体将沉在水相下面,浮出水面的油相较少;当菌丝体含量在50～100g L 时,随着CGA 的通入,固体很快上浮,紧靠在油相下方,油相体积明显较多;而当菌丝体含量在150g L 左右时,一部分固体随CGA 浮至上层,另一部分则沉在水相中。

CGA 的通入不仅有助于CLA 与水相的分离,而且也有助于CLA 的聚并成为清晰油相。

这一性质不仅省去了传统萃取的过滤和预处理步骤,减少了物料和能量损失,而且自动实现破乳,有助于油相的进一步处理。

与不含菌丝体林可霉素溶液相比,由于菌丝体、CLA 和CGA 等的相互作用,发酵液中含适量的菌丝体更易于预分散萃取过程实现相间分离,但菌丝体含量过高对萃取和分离也是不利的。

因此对于含菌丝体发酵液的预分
表1　菌丝体含量对预分散萃取林可霉素的影响
Table 1　Effect of con ten t of the m ycelium on the p redispersed so lven t ex tracti on of lincom ycin
N o .Content of m ycelium
(g ・L -1)V o lum e of o il phase mL Behavi o r of so luti on
D
10N o o il phase
Em ulsi on
2345675152530501000.411.81.471.720.98Separated into th ree phases :up phase is clear o il containing little of contam inati ons ;m iddle phase consisits of m ycelium ;bo ttom is aqueous so luti on
10.0029.7828.6634.4523.4431.5581500.34M ycelium is suspanded betw een o il phase and aqueous phase 1.25910
250300
0.080.05
M o st of the m ycelium depo sit at the bo ttom of cuvette
0.19
Concentrati on of lincom ycin —1000u mL ;CLA So luti on —2
50;T —292.65K ;pH —N eutral 894 华　东　理　工　大　学　学　报第29卷
散溶剂萃取,要获得较好的分层和萃取效果,必须控制菌丝体的含量。

3.3.4　实际含菌丝体发酵液的预分散萃取　工业生产中发酵液的组成和杂质情况比上述实验室模拟发酵液要复杂得多。

最明显的是菌丝体含量比较高,因此需要进行一定倍数的稀释,才能取得较好的分层和萃取效果。

表2列出了不同稀释倍数下的实验结果。

发酵液被稀释2倍和4倍后,即菌丝体含量分别为145g L 和72.5g L 时,萃取效果很好。

显然,在实际生产中,在目前所考察稀释倍数范围内,稀释2倍比较合适。

从表1和表2油相体积看,即使萃取与分层效果都好,菌丝体含量较高时CLA 并不能完全浮上溶液表面与被萃取液分离。

这是由于发酵液中的蛋白质、菌丝体等物质带有负电荷,可吸附带正电荷的CGA ,部分携带有CLA 的CGA 在电性引力作用下
被菌丝体吸附不能上浮。

工厂实际含菌丝体发酵液经适当稀释或稍加过滤后用预分散萃取技术直接萃取是可行的。

3.3.5　pH 的影响　林可霉素为碱性抗生素,分别以L K 和L K +表示其在水相中的两种不同的存在
状态,则林可霉素在水溶液中的离解平衡为
L K +←→pK a
L K +H +
,其p Ka 为7.6。

与醋酸丁酯形成
萃合物的是林可霉素中性分子,调节溶液pH 值大于7.6,则平衡向生成林可霉素中性分子的方向移动,有利于萃取的进行。

但pH 过高,林可霉素易部分失活。

我们对实际含菌丝体发酵液在稀释5倍的情况下考察了溶液pH 值对萃取效果的影响,结果如表3所示。

在实验考察的pH 范围,当pH 为9～10时萃取效果较好。

4　结　论
实验结果表明,发酵液中适量菌丝体的存在有
利于预分散萃取的分层和萃取。

含菌丝体发酵液的分层效果好于不含菌丝体的林可霉素水溶液。

预分散萃取技术应用于含菌丝体发酵液的提取浓缩是可行的。

工业生产中,含适量菌丝体的发酵液分层效果较好,油相富集迅速,一次萃取率在实验条件下最高可达78.6%。

菌丝体含量控制在15～150g L 为宜。

表2　稀释倍数对预分散萃取的影响
Table 2　Effect of dilu ti on on the p redispersed so lven t ex tracti on of lincom ycin
N o .
V o lum e of
undiluted so luti on mL
V o lum e of diluted so luti on mL
Behavi o r of so luti on
V o lum e of o il phase mL D
1100100M o st of the m ycelium depo sit at the bo ttom of cuvette L ittle 6.67
2345
　50252010
　100100100100
　Separated into th ree phases :up phase is clear o il con 2taining little of contam inati ons ;m iddle phase consists of m ycelium ;bo ttom phase is aqueous so luti on
111.22
89.65176.7
　1
66.9850.61
Concentrati on of lincom ycin —3192u mL ;CLA So luti on —2 100;T —292.65K ;pH —N eutral ;Content of the m ycelium —290g L 。

表3　含菌丝体发酵液在不同pH 下的萃取结果
Table 3　Ex tracti on resu lts from ferm en t con tain ing m ycelium at differen t pH
N o .pH Behavi o r of so luti on
D
Extractivity (%)
12345
7.588.078.949.619.99
Separated into th ree phases :U p phase is clear o il containing little of contam inati ons ;m iddle phase consists of m ycelium ;bo ttom phase is aqueous so luti on
66.9879.82138.08149.82210.96
51.1955.4770.4274.2178.58
CLA So luti on —2 100;Concentrati on of lincom ycin —800u mL ;T —292.65K ;D iluti on ti m es —5
(下转第503页)
9
94第5期张　欣等:含菌丝体林可霉素发酵液的预分散溶剂萃取
成ZS M 25分子筛时合成次数对涂层覆盖率的影响。

图5　合成次数对覆盖率的影响
F ig .5　Effect of syn thesis ti m es on coverage
从图中可以看到随着合成次数的增加,金属载
体表面的覆盖率持续增加。

因此重复合成是提高金属载体表面覆盖率的有效方法。

2.6　分子筛涂层热牢固度的考察
为了考察原位合成得到的金属载体表面的分子筛涂层的热牢固度,实验分别对ZS M 25分子筛金属复合材料进行了高温老化和水热老化处理。

经900°C 高温焙烧10h 老化处理和经含w H 2O =0.03的空气气氛下,在600°C 水热老化10h 后的样品称重结果表明,用原位合成得到ZS M 25金属复合材料的质量无任何减少。

可见,用原位合成法得到的复合材料表面的ZS M 25分子筛涂层有很高的热牢固度。

3　结　论
通过原位合成法可以在金属载体上制得结晶度高、热牢固度好的ZS M 25涂层。

研究表明,金属载体的预处理、合成时间及合成次数等都对分子筛涂层
的性能产生较大的影响。

参考文献:
[1]　徐　红.ZS M 25分子筛择形催化剂的工业应用[J ].化工时刊,
1999,4:426.
[2]　Shan Z ,van Koo ten W E J ,O udshoo rn O L ,et al .Op ti m iza 2
ti on of the p reparati on of binderless ZS M 25coatings on stain 2less steel mono lith s by in situ hydro therm al synthesis [J ].M i 2cropo rous and M esopo rous M aterials ,2000,34:81291.
[3]　O udshoo rn O L .Zeo lite Coatings A pp lied in Structured Cata 2
lyst Pack ings [D ].D elft ,T he N etherlands :D elft U niversity of T echno logy ,1998.
[4]　M iyo sh i N ato ,M astumono Sh inich i .NO x sto rage 2reducti on
catalyst (N SR catalyst )fo r automo tive engines :Sulfur po ison 2ing m echanis m and i m p rovem ent of catalyst perfo rm ance [J ].Stud Surf Sci Catal ,1999,121:2452250.
[5]　Shan Z .T he p reparati on of Zeo lite Steel Compo site Pack ings
fo r Catalytic D istillati on [D ].S I NO PEC ,Ch ina :R esearch In 2stitute of Petro leum P rocessing ,1995.
[6]　A ntia J E ,Govind R .A pp licati ons of bindless zeo lite 2coated
mono lith ic reacto rs [J ].A pp l Catal ,1995,131:1072120.[7]　van der Puil N ,C reygh ton E J ,Sie S T ,et al .Catalytic test 2
ing of T i O 2 p latinum silicalite 21compo sites [J ].J Chem Soc ,1996,92:460924615.
[8]　王爱琴,梁东白,徐长海,等.堇青石蜂窝状陶瓷载体上ZS M 25
及A naci m e 沸石的原位合成[J ].催化学报,2000,21(1):192
22.
[9]　韩岩松,关乃佳,刘双喜,等.T S 21分子筛在堇青石蜂窝状载体
上原位合成及其表征[A ].新世纪的催化科学与技术——第十届催化会议论文集[C ].太原:山西科学技术出版社,2000.
1372138.
(上接第499页)
参考文献:
[1]　刘如林.微生物工程概论[M ].天津:南开大学出版社,1995:
293.
[2]　Sebba F .P redispered so lvent extracti on [J ].Chem Ind ,1987,
16:1852187.
[3]　Sebba F .Separati ons using aph rons [J ].Sep Puri M ethods ,
1985,14(1):1272148.
[4]　张　欣.生物产品的预分散溶剂萃取技术研究[D ].上海:华东
理工大学,1999.
[5]　王运东,陈　敏,徐丽莲,等.预分散溶剂萃取:1.胶质液体和气
体泡沫的制备及其性质的研究[J ].清华大学学报,1998,38
(6):42245.
[6]　王运东,徐丽莲,戴猷元.预分散溶剂萃取技术的研究进展[J ].
化工进展,1997,19(6):125.
[7]　L ye G J ,Stuckey D C .Structure and Stability of CLA s [J ].
Co llo id and Surface A :Physichem Eng A spects ,1998,131(1):1192136.
[8]　M atsush ita K ,M o llah A H ,Stuckey D C ,et al
.P redispered so lvent extracti on of dilute p roducts using CGA and CLA :A ph ron p reparati on ,stability and size [J ].Co llo ids and sur 2face ,1992,69:65272.
[9]　W allis D A ,M ichelsen D L ,Sebba F ,et al
.A pp licati ons of aph ron techno logy to bi o logical separati ons [J ].B i o tech B i oeng Symp ,1985,(15):3992408.
3
05第5期余立挺等:金属载体上原位合成ZS M 25分子筛 。