构建稳定表达小鼠RAE1ε的B16F10细胞株

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(收稿日期:2019-01-22)
(本文编辑：卜明)
构建稳定表达小鼠RAEI e的B16F10细胞株
陈敏华宁晓敏李冬馄钱莉
【摘要】目的通过转染及流式细胞术筛选获得稳定表达小鼠RAEIe分子的B16F10细胞株。

方法将本研究团队前期构建的含有小鼠RAEIe基因的真核表达载体通过脂质体法转染B16F10细胞，经流式细胞仪(flow cytometry,FCM)筛选后，建立稳定高表达的B16F10细胞株，将该细胞株与NK细胞共培养后，检测IFN-7的分泌情况。

结果建立了稳定表达RAEIe基因的B16F10细胞株，该细胞株上的RAEIe具有刺激NK细胞高分泌IFN-丫的功能「结论获得了稳定表达RAEIe分子的BI6F10细胞株，为后续研究奠定了物质基础。

【关键词】RAEIe；转染；B16F10细胞
［中图分类号JR392.2［文献标识码］A DOl：10.3969/j.issn.1002-1256.2019.07.002
Construction of stable B16F10cell line expressing mouse RAEIe CHEN Min-hua.Medical school of Yangzhou University,Yangzhou,Jiangsu,225001,China.
[Abstract]Objective To establish a stable B16F10cell line expressing mouse RAEIe by using transfect and flow cytometry.Methods The plasmid pVITR02-mcs/RAE1e containing RAEIe cDNA was constructed in the previous study.Bl6F10cells were transfected with pVITRO2-mcs/RAEle plasmid(RAEIe transfectant). Stable B16F10-RAE1W transfectants were sorted for high expression of RAEIe by flow cytometry.NK cells were co -cultured with B16F10-mock or B16F10-RAE18cells and then the IFN-*y in cell culture supernatants were assayed using ELISA kits.Results Stable transfected B16F10cell line expressing RAEIe gene was established and NK cells stimulated with B16F10-RAEIe cells expressed high levels of IFN-y compared to NK cells stimulated with B16F10—mock cells.Conclusions The establishment of stable transfected B16F10cell line has provided solid experimental foundation for further studies.
[Key words]RAEIe；Transfection；B16F10cell line
视黄酸早期转录因子(retinoic acid early transcript1e,RAEIe)是RAE1家族的成员之一，RAE1家族为GP1偶联的细胞膜蛋白，由a、B、Y、6和£五个成员组成⑷。

RAE1家族成员的相似度很高，约为94%-98%,由小鼠第10号染色体上的RAE1基因编码⑵。

RAE1蛋白在正常组织中不表达或表达很低，但在多种肿瘤细胞株和肿瘤组织表面组成性表达且可被视黄酸诱导表达卩⑷。

RAE1蛋白的受体为NKG2D,NKG2D表达在NK、CD8*T细胞和某些垃T细胞亚群表面⑸。

RAE1与NKG2D结合后会给NK细胞和CD8+T细胞提供活化信号,促进NK 细胞和CD8+T细胞杀伤效应，在抗肿瘤免疫中发挥着重要作用⑷。

然而，肿瘤细胞表面持续表达RAE1
基金项目：国家自然科学基金(81001308,81373130)
作者单位:225001江苏扬州，扬州大学医学院(陈敏华，宁晓敏,李冬馄，钱莉):225001江苏扬州.扬州大学附属医院儿科(陈敏华)通信作者：钱莉，Email:qianl@ 蛋白会下调杀伤细胞表面NKG2D的表达，提示肿瘤细胞表面表达的RAE1蛋白可能在肿瘤免疫中具有双重效应(7列。

本研究构建了稳定表达小鼠RAEIe 分子的B16F10转染细胞,为探讨RAEle/NKG2D信号通路在抗肿瘤及肿瘤免疫逃逸中的作用奠定了物质基础。

一、材料和方法
1.材料：jetPEI™DNA转染试剂购自美国polyplus公司；重组小鼠NKG2D/人IgG Fc嵌合蛋白购自美国R&D公司；FITC标记的羊抗人IgG二抗、PE标记的抗NK1.1和APC标记的抗CD3抗体购自eBioscience公司；检测小鼠IFN-丫的ELISA试剂盒购自达科为公司。

2.基因转染细胞的建立与鉴定:将空载体或重组载体用jetPEI™DNA试剂转染预铺于6孔细胞培养板中的B16F10细胞,37°C培养72h后，FCM分析转染细胞中RAEI e的表达。

进一步分选RAEIe阳性
的B16F10细胞，铺板培养,待长至106细胞数时，再用FCM分选RAEle高表达的B16F10细胞,铺板培养至106个/ml细胞数后继续用FCM筛选高表达RAEle的B16F10细胞。

通过上述筛选以及亚克隆复筛，成功获得稳定高表达RAEle分子的B16F10-RAEls基因转染细胞。

3.B16F10-RAE1S细胞结合NKG2D的检测：B16F10-mock细胞和B16F10-RAEle细胞分别与重组小鼠NKG2D/人IgG Fc嵌合蛋白37°C共孵育1 h,用PBS洗涤后，再与FITC标记的羊抗人IgG二抗4°C孵育30min,用PBS洗涤后，FCM上样，检测FITC的表达水平。

4.脾脏NK细胞的制备:无菌分离获取C57BI76小鼠的脾脏，用无菌针芯将脾脏磨碎，经400目钢网滤过并收集单细胞,Tris-NH4Cl裂解红细胞,PBS洗涤2遍，用抗CD3和抗NK1.1抗体QC标记30min, FCM分选CD3-NK1.1+的NK细胞。

5.ELISA法检测B16F10-RAE1S细胞对NK细胞分泌IFN-7的影响：B16F10-mock细胞和B16F10 -RAEle细胞分别与NK细胞共培养24h后收集培养上清,ELISA法检测上清中IFN-7的分泌水平。

实验操作参照达科为公司的说明书进行。

6.统计学方法:计量资料以均数土标准差X±5表示，采用t检验进行统计学分析。

P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果
1.小鼠RAEls基因转染细胞的构建:将本研究团队前期构建的含有小鼠RAEls基因的真核表达载体pVITRO2-mcs/RAEl£〔9】转染B16F10细胞，同时将空质粒pVITR02-mcs转染至B16F10细胞，FCM 检测RAEls的表达水平，结果发现,B16F10-RAE1e 细胞阳性率为5
2.6%，而B16F10-mock细胞阳性率仅为0.19%（图1）,表明小鼠RAEle蛋白在基因转染细胞膜表面表达。

通过FCM分选RAEls阳性的B16F10-RAE1E细胞，铺板，继续培养至106个细胞数后，再次通过FCM分选高表达RAEls的B16F10-RAEle细胞，铺板培养，经过上述FCM的三轮筛选后得到的B16F10-RAEle细胞阳性率为97.8%）,表明RAEls蛋白在B16F10-RAE1S细胞表面得到了稳定的表达。

2.B16F10-RAE1S细胞能结合NKG2D蛋白：为了检测B16F10-RAE1S细胞表面的RAEle是否具有结合其受体NKG2D的能力，本研究分别将B16F10-mock细胞和B16F10-RAE1e细胞与重组小鼠NKG2D/人IgG Fc嵌合蛋白共孵育,洗涤后，再与FITC标记的羊抗人IgG二抗孵育，洗涤后,FCM检测FITC的表达水平。

结果发现,B16F10-RAEle细胞阳性率为96.9%，而B16F10-mock细胞阳性率仅为9.7%（图2）,表明B16F10-RAEle细胞表面的RAEle具有结合NKG2D的能力。

转染厉
筛逸后
BI6F10—mock B16FIO-RAE1C
S
RAElc----------------------------------------------------------
图1FCM检测基因转染细胞表面RAEls的表达
FITC----------------------------------------------------------------------A
图2B16F10-RAEle细胞能结合NKG2D蛋白
3.B16F10-RAE1E细胞刺激NK细胞分泌IFN-丫：将B16F10-mock细胞和B16F10-RAEle细胞分别与小鼠脾脏NK细胞共培养后，检测上清中IFN-7的分泌情况。

结果发现，与B16F10-mock细胞相比，B16F10-RAEle细胞刺激NK细胞分泌高水平的IFN-7（图3），表明B16F10-RAE1S细胞表面表达的RAEle具有生物学活性。

图3BI6FI0-RAEle细胞促进NK细胞分泌IFN-丫
讨论小鼠NKG2D的配体包括RAE1家族成员（RAEla-RAEls）,Multi和H60o人NKG2D的配体包括MICA和M ICB[8]o不管是人的还是小鼠的NKG2D配体均表达在大多数肿瘤细胞系和肿瘤组织表面，而在正常组织中表达极低或不表达。

NKG2D 配体/NKG2D通路可以通过活化NK细胞和CD8+T 细胞发挥抗肿瘤效应⑷。

然而肿瘤细胞可通过多种机制逃逸NKG2D介导的免疫监视，如肿瘤细胞能够
齐齐哈尔医学院学报2019年第40卷第7期Journal of Qiqihar Medical University,2019,Vol.40,No.7・799•
释放可溶性NKG2D配体或者肿瘤细胞表面持续表达NKG2D配体均会下调杀伤细胞表面NKG2D的表达水平【7.问，从而损害nk G2D介导的细胞活化。

本研究团队前期的研究发现,NKG2D配体RAEIe能够促进髓系抑制性细胞的增殖和活化⑴］。

因此, NKG2D配体参与肿瘤免疫逃逸的机制还有待进一步的深入研究。

本研究成功的将小鼠NKG2D的配体RAEIe高表达在黑色素瘤细胞B16F10表面，并保持了RAEIe 分子的生物学活性。

FCM检测发现,抗小鼠RAEIe 抗体可特异性标记RAEIe基因转染细胞，表明RAEIe基因在基因转染细胞内翻译了RAEI e蛋白质并表达于细胞表面。

B16F10-RAE1S细胞可与重组小鼠NKG2D/人IgG Fc嵌合蛋白结合，说明B16F10细胞表面表达的RAEI e具有结合其受体NKG2D的能力。

B16F10-RAEle细胞与小鼠NK细胞共培养后刺激NK细胞释放IFN-7,说明B16F10细胞表面表达的RAEIe具备生物学活性。

综上所述，本研究成功制备了稳定表达小鼠RAEI e基因细胞株,为进一步研究RAEls分子的生物学功能奠定了物质基础。

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(收稿日期:2019-02-13)
(本文编辑:陈颂)
•经验交流.
慢性阻塞性肺病急性加重期血清SAA.PCT的检测
及临床意义
钱宝嵇华夏胡小燕吴艳红夏训和郑永华
(摘要】目的探讨在慢性阻塞性肺病急性加重(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD)期检测血清淀粉样蛋白A(Serum amyloid A,SAA)和降钙素原(procalcitonin,PCT)的临床意义。

方法选择2016年10月一2018年10月在本院住院治疗的AECOPD患者100例作为AECOPD 组，以同期在本院体检的正常成人50名作为健康对照组，分别检测两组血清SAA、PCT、血常规白细胞总数(WBC)的表达水平，分析各项指标之间的差异及诊断的敏感性及特异性。

结果AECOPD组患者血清SAA.PCT水平均显著高于对照组(P<0.05)。

在AECOPD组中，PCT、SAA、WBC的敏感性分别为74%、56%和52%,而特异性分别为84%,100%和100%,PCT的敏感性高于SAA和WBC(P<0.05),但特异性没有差异(P>0.05)<结论SAA和PCT在AECOPD患者中显著升高，可以作为辅助诊断指标指导临床抗生素的使用。

【关键词】慢性阻塞性肺病；血清淀粉样蛋白A；降钙素原；诊断
［中图分类号］R563.9［文献标识码］A D01：10.3969/j.issn.1002-1256.2019.07.003
基金项目：上海市金山区2018年度医药卫生类科技创新资金项目(2018-3-12)
作者单位：201505上海.上海市金山区亭林医院呼吸内科(钱宝、嵇华夏、胡小燕、吴艳红、郑永华).检验科(夏训和)通信作者:郑永华,Email:zhengyonghuaO118@。