黑枸杞实验(2)

《生物技术制药》
实验报告
学院生命科学技术学院
班级：13级生物技术制品方向
姓名：梁生
电话：188********
同组姓名 : 李旭斌
指导教师：栗孟飞副教授
日期：16年10月31日——16年11月2日
黑枸杞果实总黄酮、酚类以及抗氧化能力的测定
摘要：为了探明黑枸杞成熟果实中总黄酮、酚类的提取的最佳方案，以及抗氧化能力强弱，以成熟的黑枸杞为材料，采用分光光度法对 10%和 70%乙醇不同提取时间的提取液中总黄酮和酚类以及抗氧化能力进行测定。

结果表明，黑枸杞在10%乙醇提取液中总黄酮量几乎一样，在70%的乙醇提取液中总黄酮含量波动较大，初步推测是实验误差所致。

此外在70%乙醇提取液中总黄酮量微高于10%。

由图2可知，10%和70%乙醇提取液中总酚的含量几乎一样。

在利用DPPH和FRAP法测得的10%和70%乙醇提取液抗氧化能力结果中，随着时间的推移，黑枸杞提取液的抗氧化女人哪能力几乎无明显变化，同时黑枸杞70%乙醇提取液的抗氧化能力均分别高于10%乙醇提取液。

该研究结果将对黑枸杞的药用价值的合理开发与利用提供主要依据和参考价值。

关键词：黑枸杞；黄酮；抗氧化能力；酚类
宁夏枸杞的果实枸杞子是名贵的中药，历代《本草》对枸杞的功效均有论述[1]。

中国药典记载枸杞子有滋肝补肾、益精明目的作用，近代中医临床将它作为滋补强壮剂[2]，其还具有促进造血、降血脂及治疗神经衰弱等多种药理作用[3]。

藏医用于治疗心热病、心脏病、降低胆固醇、兴奋大脑神经、增强免疫功能、防治癌症、抗衰老、美容养颜、月经不调、停经等且药效显著。

1 材料与方法
1.1 实验材料
成熟黑枸杞果实采自宁夏回族自治区中卫县。

1.2 实验方法
1.2.1 提取液的制备
取干燥的实验材料，粉碎过 80 目筛；准确称取 1.0 g 粉末，分别用 35mL 10%和 70%乙醇在室温条件下提取 2 h、4h、8h、12h；每次吸取上清液 2ml 于
10ml 离心管中，获得 2 ml 提取液用于总黄酮、总酚类以及抗氧化能力测定。

1.2.2总黄酮含量的测定
采用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法测定总黄酮化合物的含量，参考 Ma 等[6]的测定方法。

具体步骤为：吸取 1.2.1 10%和 70%乙醇提取液 400.0 ul置于试管中，依次加入 2.0 ml蒸馏水和 0.3 ml 5% NaNO2，混合振荡 5min 后，加入 0.3 ml 10%AlCl3，混合振荡 1min 后，加入 2.0 ml 1mol/L NAOH，充分混合后，在510 nm 下测定反应液的吸光值 A，以不加样品溶液的为空白对照。

总黄酮化合物的含量以儿茶素(catechin, CE)为标准品标定。

总黄酮含量(CE mg/g DW) =
(C×V2) / (V1×M×1000)
其中，C 为儿茶素的浓度(mg/ml)，V1 为吸取样品溶液的体积(mL)，V2 为提取液的体积(ml)，A为样品的吸光值，M 为黑枸杞果实材料的干物质重量(g)。

1.2.3总酚类含量的测定
采用福林酚(Folin-Ciocalteu)试剂法测定总酚类化合物的含量，参考Beato 等和康霞等的测定方法。

具体步骤为：吸取1.2.1 70%乙醇提取液50.0 μL置于试管中，依次加入2.0 mL 10% Folin-Ciocalteu和 1.0mL 7.5% Na2CO3，混合振荡5min后，置于水浴锅中37 °C下避光反应1 h，取出在760 nm下测定反应液的吸光值A，以不加样品溶液的为空白对照。

总酚类化合物的含量以没食子酸(gallic acid, GAE)为标准品标定。

采用福林酚(Folin-Ciocalteu)试剂法测定总酚类化合物的含量，参考Beato等[7]和康霞等的测定方法。

具体步骤为：吸取1.2.1 70%乙醇提取液50.0 μL 置于试管中，依次加入 2.0 ml 10% Folin-Ciocalteu和 1.0mL 7.5% Na2CO3，混合振荡 5min 后，置于水浴锅中37 °C 下避光反应 1 h，取出在 760 nm 下测定反应液的吸光值 A，以不加样品溶液的为空白对照。

总酚类化合物的含量以没食子酸(gallicacid, GAE)为标准品标定。

总酚含量(GAE mg/g DW) = (C×V2) / (V1×M*1000)
其中，C 为没食子酸的浓度(mg/ml)，V1为吸取样品溶液的体积(ml)，V2为提取液的体积(ml)，A为样品的吸光值，M 为黑枸杞果实材料的干物质重量(g)。

1.2.4抗氧化能力的测定
为了更为准确、全面地反映提取液的总抗氧化能力，分别采用较为广泛应用的 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl, DPPH)和铁离子还原/氧化能力(Ferric reducing/antioxidant power,FRAP)两种测定方法[8-11]。

1）DPPH法参考Nencini等[12]和Li等[13]的方法测定。

具体步骤为：吸取1.2.1 10%和70%乙醇提取液加20.0 μL，加到提前制备好的7.0 mL 10-4mol/L DPPH 甲醇溶液中，室温黑暗振荡反应30 min，取出在 515 nm 下测定反应液的吸光值A（以不加样品溶液的参比对照，吸光值A0；以70%无水乙醇为空白对照）。

以500 μmol/L 90% 抗坏血酸的甲醇溶液为阳性对照。

样品溶液的抗氧化能力计算方法为：
抑制率(Inhibition percentage, I%) = [(A0－A)/ A0] ×100；其中，A 为样品溶液的吸光值，A0不加样品溶液的吸光值。

2） FRAP 法参考 Li 等[13]、Benzie 和 Strain[15]的方法测定。

具体步骤为：吸取 1.2.1 中 10%和 70%乙醇提取液 20.0 ul，依次加入 5.0 mL 蒸馏水和提前制备好的 4.0 ml FRAP 溶液中(要求现配现用，配制方法为：取 10 倍体积的乙酸盐缓冲液，pH 3.6；1 体积 10 mmol/L 2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪[2,4,6-
tris(2-pyridyl)-s-triazine, TPTZ]的 40 mmol/L HCl溶解液，1 体积的 20 mmol/L FeCl3·6H2O，三者混合均匀)，水浴锅中37 °C 反应 4 min 后，取出在593 nm 下测定反应液的吸光值 A（以不加样品溶液为参比对照，吸光值 A0；以70%无水乙醇为空白对照），以500 μmol/L 抗坏血酸 90%甲醇溶液为阳性对照。

样品溶液的抗氧化能力以500 μmol/L Fe2+ (FeSO4·7H2O) 为参比基础，计算公式为：
FRAP 值(μmol/L) = [(A－A0)/ (AFeSO4·7H2O－A0)] × 500
(μmol/L)；其中样品溶液的吸光值，AFeSO4·7H2O为FeSO4·7H2O 溶液的吸光值，A0不加样品溶液的吸光值。

1.3 统计与分析
每个实验重复 3 次，采用 Microsoft Office Excel 2010 软件进行数据处理与统计分析。

2 结果与分析
2.1黑枸杞成熟果实总黄酮、酚类的含量
如图为成熟黑枸杞果实中总黄酮类（图 1）和总酚类（图 2）的含量。

由图1可知，黑枸杞在10%乙醇提取液中总黄酮量几乎一样，在70%的乙醇提取液中总黄酮含量波动较大，初步推测是实验误差所致。

此外在70%乙醇提取液中总黄酮量微高于10%。

由图2可知，10%和70%乙醇提取液中总酚的含量几乎一样。

图1 黑枸杞中总黄酮含量图2 黑枸杞中总酚含量
2.2黑枸杞黑枸杞提取液的抗氧化能力
图3和图4结果显示，在利用DPPH和FRAP法测得的10%和70%乙醇提取液抗氧化能力结果中，随着时间的推移，黑枸杞提取液的抗氧化女人哪能力几乎无明显变化，同时黑枸杞70%乙醇提取液的抗氧化能力均分别高于10%乙醇提取液。

图3 DPPH法图4 FRAP法
3 小结
1）根据实验数据统计及图像对比，黑枸杞在10%乙醇提取液中总黄酮量几乎一样，在70%的乙醇提取液中总黄酮含量波动较大，初步推测是实验误差所致。

此外在70%乙醇提取液中总黄酮量微高于10%。

由图2可知，10%和70%乙醇提取液中总酚的含量几乎一样。

2）根据实验数据统计及图像对比，在利用DPPH和FRAP法测得的10%和70%乙醇提取液抗氧化能力结果中，随着时间的推移，黑枸杞提取液的抗氧化女人哪能力几乎无明显变化，同时黑枸杞70%乙醇提取液的抗氧化能力均分别高于10%乙醇提取液。