山葡萄酒MLF乳杆菌最佳培养基的筛选

山葡萄酒MLF乳杆菌最佳培养基的筛选
刘东旭;高鹏飞;丁玉萍;薛秀珍
【摘要】以OD600值作为评价指标,对MRS和改良M17培养基进行比较选择出基础培养基,在基础培养基中添加不同的果汁探究不同果汁对MLF乳杆菌的影响;采用单因素和正交试验对果汁加量、碳源、总氮源和盐液A进行优化,得出最佳组合为:大豆蛋白胨为5.4g/L,胰蛋白胨为5.4g/L,牛肉蛋白胨为3.6g/L,酵母浸粉为3.6g/L,K2 HPO4为0.7g/L,抗坏血酸为0.5g/L,盐液A为2g/L,甘油为8g/L,乳糖为8g/L,葡萄汁为130g/L.此培养基培养MLF乳杆菌,其培养液的OD600值比改良M17培养基高大约32.2%.
【期刊名称】《佳木斯大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2017(035)006
【总页数】5页(P996-1000)
【关键词】山葡萄酒;苹果酸-乳酸发酵菌;培养基;筛选
【作者】刘东旭;高鹏飞;丁玉萍;薛秀珍
【作者单位】佳木斯大学生命科学学院,应用微生物研究所,黑龙江佳木斯 154007;佳木斯大学生命科学学院,应用微生物研究所,黑龙江佳木斯 154007;佳木斯大学生命科学学院,应用微生物研究所,黑龙江佳木斯 154007;佳木斯大学生命科学学院,应用微生物研究所,黑龙江佳木斯 154007
【正文语种】中文
【中图分类】Q93-3;TS261.4
葡萄酒的酿造过程包括主发酵和后发酵两个阶段，主发酵主要由酵母菌将糖转化为酒精，完成酒精发酵(Alcoholic Fermentation AF)，后发酵主要由乳酸菌将苹果
酸转化为乳酸，完成苹果酸-乳酸发酵(malolactic fermentation, MLF)[1]。

苹果
酸-乳酸发酵是酒精发酵结束后，乳酸菌以L-苹果酸(二元酸)为底物，在苹果酸-乳酸酶催化下转变成L-乳酸(一元酸)和CO2的过程[2]。

二元酸向一元酸的转化不光可以使果酒的总酸下降，酸涩感降低，同时也因乳酸在感官上更加柔和圆润，使得葡萄酒的口感得到明显的改善[3]。

苹果酸-乳酸菌是指能进行苹果酸-乳酸转化的
菌种，其主要包括以下几个属的细菌：明串珠菌属(Leuconostoc)、酒球菌属(Oenococcus)、片球菌属(Pediococcus)和乳杆菌属(Lactobacillus)[4,5]。

无论
哪种MLF菌属其自身合成核酸、氨基酸和维生素的能力比较弱，对营养要求均比
较苛刻，需要含有蛋白质、核酸和维生素等天然营养物质丰富的培养基，否则不易生长。

以优良的MLF乳杆菌为菌种，筛选其最佳培养基，并对其配方进行优化。

1.1.1 试验用菌
MLF乳杆菌：佳木斯大学生命科学学院发酵实验室保存的苹果酸-乳酸转化能力高的乳杆菌。

1.1.2 主要仪器
TDZ4-WS低速台式离心机,PHS-3C型精密酸度计
1.1.3 培养基
(1)活化培养基[7](g/L)：葡萄糖10，酵母浸粉5，盐酸半胱氨酸0.5，蛋白陈10，硫酸镁0.2，硫酸锰0.5，番茄汁25mL。

调节pH至4.8，121℃灭菌20min。

(2)MRS培养基[6,9](g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉蛋白胨10，酵母浸粉5，吐温-80 1，柠檬酸氢二铵2，乙酸钠，K2HPO4 2，MgSO4·7H2O 0.58，MnSO4·H2O 0.25，自然pH值，121℃灭菌20min。

(3)改良M17培养基[8](g/L)：大豆蛋白胨6，胰蛋白胨6，牛肉蛋白胨4，酵母浸
粉4，K2HPO4 7，甘油8，乳糖6，抗坏血酸0.5，盐液A 4，自然pH值。

(盐
液A：MgSO4·7H2O 11.5g，MnSO4·H2O 2.8g)，121℃灭菌20min。

1.2.1 果汁的制备及灭菌
(1) 果汁的制备分别取新鲜的番茄，梨以及山葡萄，洗净打碎三层纱布过滤，将果汁移至离心管中2800r/min离心10min，取上清液，备用。

(2) 果汁灭菌采用低温间歇式灭菌(90℃)法。

将装有果汁并密封的大试管，置于90℃恒温水浴锅中保温30min，取出自然冷却至室温；再置于90℃恒温水浴锅保温30min，取出自然冷却至室温；重复三次。

于冰箱中备用。

1.2.2 菌种活化与接种 (1) 菌种活化将保存的菌种按10%的接种量接种到活化培养基中，于25℃恒温箱培养96h，取出备用。

(2) 接种以10%的接种量进行接种。

取活化后的菌悬液于离心管中，4000r/min
离心10min，弃去上清液，将沉淀菌接种于灭菌的培养基。

1.2.3 基础培养基的筛选1.2.3.1 基础培养基的初筛
按1.2.2接种方法将乳杆菌分别接种于MRS培养基和改良M17培养基中，置于25℃培养箱进行培养。

测培养72 h、96 h和120 h培养液的OD600值，每种培养基设置三个重复，结果取平均值。

1.2.3.2 基础培养基添加果汁的筛选
在初筛基础培养基中添加100g/L山葡萄汁或番茄汁或梨汁配制成三种果汁培养基，以不加果汁的初筛基础培养基为空白对照。

按1.2.2接种方法接入乳杆菌，置于25℃培养箱进行培养。

测培养72 h、96 h和120 h培养液的OD600值。

每种培养基设置三个重复，结果取平均值。

1.2.4 单因素试验在不改变培养基中其他成分用量的情况下，分别对加100g/L山葡萄汁改良M17培养基的总氮源(16、18、20、22、24)g/L、碳源(2、4、6、8、10)g/L、盐液A(1、2、3、4、5)g/L及山葡萄汁(50、100、150、200、250)g/L
的添加量进行单因素试验。

测培养48 h、72 h和96 h培养液的OD600值，每
种培养基设置三个重复，结果取平均值。

1.2.5 正交试验在单因素试验基础上，对山葡萄汁改良M17培养基总氮源、碳源、盐液A、葡萄汁进行四因素三水平正交试验L9(34)，因素水平设计见表1.
1.2.6 对比验证试验根据L9(34)正交试验结果，设计对比实验。

以M17培养基为对照，对得到的两组比较好的配方组合进行对比验证试验，筛选最佳培养基。

每组配方做三个重复，结果取平均值。

1.2.7 检测方法
菌体生长量测定：采用测定光密度值的方法。

将培养液混合均匀，迅速倒入离心
管和比色皿中，离心管于4000r/min离心10min，取上清液在波长600nm下测其光密度值OD600。

2.1.1 基础培养基的初筛测乳杆菌在改良M17培养基和MRS培养基中生长量光
密度值OD600，结果见表2。

由表2可得，在接种量相同，培养时间相同的情况下，比较乳杆菌在两种培养基
中培养72h、96h和120h培养液的OD600值及三次的测量结果的平均值，改良M17培养基的OD600值均高于MRS培养基，改良M17培养基三次的测量结果的平均值为1.112，比MRS培养基高出0.121，故选择改良M17培养基作为乳
杆菌生长的初筛基础培养基。

2.1.2 基础培养基添加果汁的筛选
测乳杆菌在改良M17培养基和添加不同果汁的改良M17培养基中培养72 h、96 h和120 h培养液的OD600值，并计算三次测量结果的平均值，结果见图1所示。

通过图1比较4种培养基的OD600值，可以看出在接种量、培养条件、培养时
间均相同的情况下，通过对三次的测量结果的平均值进行分析，发现加果汁培养基试验组均比不加果汁培养基试验组的OD600值高。

其中加梨汁试验组OD600平
均值最高，为1.517，其次为加山葡萄汁培养基试验组，其平均OD600值为
1.463，第三为加西红柿汁的培养基试验组，其平均OD600值为1.079；不加果
汁培养基试验组平均OD600值最低，为0.867。

由于加山葡萄汁培养基OD600平均值仅比加梨汁培养基低0.053，差异不甚显著，因为是筛选山葡萄酒MLF乳杆菌最佳培养基，山葡萄汁比梨汁酸度大，为使筛选
的培养基对菌种具有驯化作用，所以，山葡萄汁+改良M17培养基为山葡萄酒MLF乳杆菌的基础培养基。

2.2.1 氮源总加量
山葡萄汁改良M17培养基氮源有大豆蛋白胨，胰蛋白胨，牛肉蛋白胨，酵母浸粉，在保持大豆蛋白胨﹕胰蛋白胨﹕牛肉蛋白胨﹕酵母浸粉比例3﹕3﹕2﹕2不变的情况下，对氮源总加量进行五个梯度单因素试验，结果见图2。

由图2可知，总氮源加量不同的五个培养基培养MLF乳杆菌72h、96h和120h
培养液的平均OD600值分别为1.15、1.27、1.25、1.24、1.22，氮源总加量为
18g/L的培养基平均OD600值高于其它四组，即氮源总加量为18g/L最好。

2.2.2 碳源加量
山葡萄汁改良M17培养基的碳源只有乳糖，在保持其他成分不变的情况下，对碳源进行单因素试验，结果见图3。

由图3可知，比较72h测得的OD600值：试验组2g/L > 10g/L > 4g/L >
6g/L > 8g/L；比较96h测得的OD600值：试验组6g/L> 10g/L> 2g/L> 4g/L> 8g/L；比较120h测得的OD600值：试验组6g/L > 10g/L> 2g/L> 4g/L> 8g/L；三次测量的OD600值的平均值:试验组6g/L>10g/L> 2g/L > 4g/L > 8g/L。

综上，培养96h、120h及三个时间段测定OD600平均值均为6g/L试验组最高，
即碳源最好加量为6g/L。

2.2.3 盐液A浓度
在其他成分不变的情况下，对山葡萄汁改良M17培养基的盐液A加量进行单因素试验，结果见图4。

由图4可知：比较72h测得的OD600值，试验组5g/L> 1g/L> 2g/L> 4g/L>
3g/L；比较96h测得的OD600值，试验组4g/L> 2g/L> 3g/L> 1g/L> 5g/L；
比较120h测得的OD600值，试验组4g/L> 3g/L> 2g/L> 5g/L> 1g/L；比较三个时间段测定OD600平均值，4g/L试验组明显高于其它四组。

盐液A加量6g/L 试验组最好，即盐液A添加量为4g/L是比较适宜的添加量。

2.2.4 葡萄汁浓度
在其他成分不变的情况下，对山葡萄汁改良M17培养基的山葡萄汁加量进行单因素试验，结果见图5。

由图5可知，比较72h测得的OD600值:试验组100g/L> 200g/L> 150g/L>
50g/L> 250g/L；比较96h测得的OD600值:试验组100g/L> 150g/L> 200g/L> 50g/L> 250g/L；比较120h测得的OD600值;试验组150g/L> 100g/L>
200g/L> 50g/L> 250g/L:比较三个时间段测量结果的平均值，试验组100g/L最高，并且100g/L、150g/L、200g/L三组的OD600的平均值差异不显著，而于50g/L和250g/L两组与其它三组相比差异显著。

所以葡萄汁加量最好试验组为100g/L。

对总氮源、碳源、盐液A、葡萄汁进行四因素三水平正交试验，测25℃培养96h
培养液的OD600值，结果见表3。

通过对表3进行分析，比较极差R可得，RB>RD>RA>RC，四个因素对MLF乳
酸菌的影响主次依次为：碳源 > 盐液A > 葡萄汁 > 总氮源；A因素列：
K3>K1>K2，B因素列：K3>K1>K2，C因素列：K1>K2>K3，D因素列：
K1>K3>K2，因此，正交试验结果的最优组合为A3B3C1D1。

直接观查正交表可得：试验组9(A3B3C2D1)数据最好。

以M17培养基为对照，对组合A3B3C1D1和组合A3B3C2D1进行对比验证试验，测培养72 h、96 h和120 h培养液的OD600值，并计算三个时间段测量结果的平均值，结果见表4.
由表4可知，比较培养72 h、96 h和120 h培养液的OD600值及三个时间段测得的OD600值的平均值，均为试验组A3B3C1D1 > 试验组A3B3C2D1 > 试验
组改良M17，试验组A3B3C1D1培养液的OD600值的平均值比改良M17试验
组高32.2%。

因此，优化培养基的最佳组合为A3B3C1D1，即大豆蛋白胨为
5.4g/L，胰蛋白胨为5.4g/L，牛肉蛋白胨为3.6g/L，酵母浸粉为3.6g/L，
K2HPO4为0.7g/L，抗坏血酸为0.5g/L，盐液A为2g/L，甘油为8g/L，乳糖为8g/L，葡萄汁为130g/L。

通过对山葡萄酒MLF乳杆菌最佳培养基的研究可知，培养基的成分及填加量对MLF乳杆菌的生长有影响，是否加入天然果汁对其影响较大，在改良M17培养基中加入一定量梨汁或葡萄汁对MLF乳杆菌生长促进作用较好。

考虑筛选的是山葡
萄酒MLF乳杆菌最佳培养基，葡萄汁较梨汁酸度大，用添加山葡萄汁的培养基培
养MLF乳杆菌对其耐酸性具有一定的驯化作用，所以选择山葡萄汁+改良M17培养基为基础培养基。

【相关文献】
[1] 张燕,朱济义.中国葡萄酒质量状况及发展探讨[J].酿酒科技,2011,207(9):10-12.
[2] 文连奎,赵薇,张微,等.果酒降酸技术研究进展[J].食品科学,2010, 31(11):325-328.
[3] 夏双梅.苹果酸-乳酸酶高活性菌株的筛选及酿造学特性研究[D].陕西:西北农林大学,2004:1.
[4] Bartowsky E J, Borneman A R. Genomic variations of oenococcus oeni strains and the potential to impact on malolactic fermentation and aroma compounds in wine[J]. Applied Microbiology & Biotechnology, 2011, 92(3): 441-447.
[5] Gagné S, Lucas P M, Perello M C, et al. Variety and variabilit of glycosidase activities in an Oenococcus oeni strain collection tested with synthetic and natural substrates[J].
Journal of Applied Microbiology, 2011, 110(1): 218-228.
[6] 李爱霞.植物乳杆菌苹果酸.乳酸发酵性能及其苹果酸.乳酸酶的研究[D].陕西杨凌:西北农林科技大学,2014:1-3.
[7] 段浩云,田洪涛,檀建新,等.葡萄酒 MLF 高耐受性优良乳酸菌的筛选与鉴定[J].中国食品学
报,2015,15(5):5.
[8] 王美霞,贺银凤.与酵母菌具有共生作用乳酸菌LC5培养基的优化[J].食品科技,2012,37(9):10-15.
[9] 周安玲.葡萄酒苹果酸-乳酸发酵优良乳酸菌的筛选及其发酵特性分析[D].甘肃:甘肃农业大
学.2015:11.
[10] 刘哲君,王海伟,霍建伟,等.肠膜明串珠菌,植物乳杆菌,短乳杆菌的最适培养基的筛选[J] .佳木斯大学学报(自然科学版) ,2005,23(5):668-670.。