维生素C对中华蜜蜂幼虫发育及工蜂生存能力的影响

粮中维生素 C含量对中华蜜蜂工蜂的生存能力有影响。
关键词： 中华蜜蜂；维生素 C；发育；寿命
中图分类号：S894
文献标识码：A
文章编号：1006 -267 X（ 2014 ） 05 -1265 -07
蜜蜂是一种变态发育的社会性昆虫，需经历 卵、幼虫、蛹和成蜂 4 个阶段[1]。 在正常条件下， 由 3～12 日龄的哺育蜂为蜜蜂幼虫提供蜂王浆或 蜂粮等 食 物， 满 足 其 对 各 种 营 养 物 质 的 需 求[2] 。 成年蜜蜂在不同环境、日龄及劳动分工中，所需的 营养差异很大。 然而，充足均衡的营养对蜜蜂正 常的生长发育和代谢有着重要意义。 维生素 C是 一种水溶性的抗氧化剂，在生物体的有氧代谢过 程中能够保护机体免于氧化剂的威胁，在机体的
1000 型，上海安亭科学仪器厂公司）、台式冷冻离
心机 型 公 司 仪 （ 5810R ， Eppendorf ） 、 PCR （ iQ
型 公司 TM2 ，Bio-Rad ） 。
1.4 试验设计 1.4.1 蜜蜂幼虫饲养试验
将 800 只 1 日龄中华蜜蜂幼虫随机分为 5 组， 每组 8 个重复，每个重复 20 只。 其中，对照组（I 组）饲喂基础饲粮（表 1），基础饲粮中维生素 C含 量为1.6 mg/kg；4 个试验组分别饲喂在基础饲粮 中添 加 组 组 组 10 （ Ⅱ ） 、 20 （ Ⅲ ） 、 30 （ Ⅳ ） 、 40 mg /kg（ 组V ）维生素 C的试验饲粮，对应的试 验饲粮中维生素 C含量分别为 11.6、21.6、31.6、 41.6 mg /kg。 由于维生素 C性质不稳定，容易被 氧化分解，每天的饲粮现配现用。
抗氧化过程中发挥着重要的作用[3]。 维生素 C作
为 自 由 基 清 除 剂， 能 与 超 氧 阴 离 子 自 由 基
合（O，2生-·成）抗、过坏氧血化酸氢自（由H基2O，2同）、时羟它自也由可基以（ ·清O除H单）
结 线
态氧，从而保护机体免受内源性氧自由基的损
伤[4]。 维生素 C也是蜜蜂生长发育、繁殖以及维
（V组）维生素 C的试验饲粮。 工蜂饲养试验：将 1 日龄中华蜜蜂工蜂分成 4 组，每组 6 个重复，
每个重复 24 g（约 300 只）。 其中，对照组（Ⅵ组） 饲喂 1 ∶1 的糖水，3 个试验组分别在 1 ∶1 的糖
水中添加 组 组 50（Ⅶ ）、500（Ⅷ ）、2 500 mg /kg（Ⅸ组）的维生素 C。 结果表明：在幼虫发育阶段，
Ⅱ荧 光 定 量 试 剂 购 自 公 TaKaRa 司， 维 生 素 C
浓度在 以上 购自 公司 （25 g，
99.0% ） Sigma 。
1.3 主要仪器
主要仪器有 24 孔细胞培养板（赛业生物科技
公司）、生化培养箱（GZ-250 型 韶 -GSI ， 关市广智
科技设备发展有 限 公 司） 、 普 通 离 心 机 （ 飞 鸽 KA-
用蒸馏水反复冲洗 24 孔细胞培养板，然后用 70%乙醇溶液消毒，再将培养板放于超净工作台 中，打开紫外照射灯，通风干燥 5 h。 将 200 幼 μL 虫饲粮加入到培养板的每个孔中，并置于 34 ℃培 养箱中预热 5 min。 再用移虫针将 1 日龄幼虫从 巢脾中移出，放入盛有营养液的培养板的孔内，每 孔 2～4 只，使幼虫漂浮在营养液表面。 移虫完成 后，将培养板放入恒温恒湿（34 ℃，相对湿度为 95%）的培养箱中，避光培养。 每 12 h 更换 1 次食 物。 每次饲喂 300 mg 幼虫饲粮。 第 2 天之后，饲 养密度降低至 1 只幼虫 孔/ 。 7 ～8 日龄时能在培
除机体代谢过程中产生的过多的超氧阴离子自由
基，在预防疾病、提高机体免疫力以及抗衰老、抗
炎症等方面发挥重要的作用[9]。 研究表明，中华
蜜蜂 Cu/Zn-SOD基因在不同发育时期和不同部位
均有表达特异性，而且在 6 日龄幼虫中的表达量
达到峰值，而在 4 日龄蛹中的表达量最低；头部与
腹部的表达量显著高于胸部[10]。 2013 年，刘俊峰
反转录酶 1.5 μLM-MLV
，3 μLOligo dT，1 μLRNA
酶抑制剂 水 ，18.5 μLDEPC 。 反转录反应条件如下：
体系混匀后，42 ℃反应 60 min，75 ℃反应 5 min。 反
转录产物稀释 10 倍后保存于-80 ℃。
采用 DNAMAN5.0 设计引物，引物序列见表 2。
生存能力方面，随着维生素 C含量的增加，工蜂的平均寿命先增加后下降，且各试验组均显著高
于对照组（P＜0.05），各试验组之间也存在显著差异（P＜0.05）；工蜂的存活率随着维生素 C含量
的增加先上升后下降；3、9、15 日龄工蜂 Cu 基因 /Zn-SOD 的相对表达量均随着维生素 C含量的
增加而减少。 由此得出，中华蜜蜂幼虫人工饲粮中维生素 C的适宜含量为 饲 11.6～21.6 mg/kg；
合计 Total
含量 Content
66.70 6.00 6.00 1.00
20.30 100.00
1.4.2 工蜂饲养试验 选取 4 群群势相同的中华蜜蜂蜂群，隔王产
卵，将即将出房的封盖子放入恒温恒湿（34 相 ℃， 对湿度为 75%） 的培养箱中羽化。 将羽化出的 1 日龄中华蜜蜂工蜂分成 4 组，每组 6 个重复，每个 重复24 约 g（ 300 只）。 其中，对照组（ Ⅵ组） 饲喂 1 ∶1（蔗糖与水的质量比）的糖水，3 个试验组分别 在 1 ∶1 的 糖 水 中 添 加 50 （ Ⅶ 组）、 500 （ Ⅷ 组）、 2 500 mg /kg（Ⅸ组） 的维生素 C。 各组糖水现用 现配。 1.4.3 蜜蜂幼虫饲养方法
5期
韩 旭等：维生素 C对中华蜜蜂幼虫发育及工蜂生存能力的影响
1267
ห้องสมุดไป่ตู้
养板的孔底部看到尿素晶体和纤维状物质，说明 幼虫开始排便，准备化蛹，此时，将大幼虫转移至 化蛹培养板，并放入恒温恒湿（34 ℃，相对湿度为 75%）的培养箱中，避光培养，直至蜜蜂出房。 此 期间是蜜蜂发育的敏感时期，避免移动化蛹培 养板。 1.4.4 工蜂饲养方法
将 1 日龄工蜂以重复为单位随机放入小木箱 （11 cm×13 cm×15 cm） 中，将小木箱放入恒温恒 湿（34 ℃，相对湿度为 65%） 的培养箱中继续饲 养。 为避免应激干扰带来的影响，首次饲喂 24 h 后取出已死亡的蜜蜂，开始正式试验。 在前 3 天 试验中给予充足花粉，补充发育所需的营养。 另 外，每 24 h 更换 1 次食物，并记录和清除已死亡的 蜜蜂，直到蜜蜂全部死亡。 1.5 样品采集 1.5.1 蜜蜂幼虫饲养试验
表 1 中华蜜蜂幼虫基础饲粮组成
Table1 Basaldietcomposition of
larvaeforApiscerana cerana
项目 Items
蜂王浆 Royaljelly
果糖 D- D-fructose
葡萄糖 D-
D-glucose
酵母提取物 Yeastextract
水 Water
持正常的生命活动不可或缺的营养物质[5]。 研究
表明，维生素 C是蜜蜂机体内重要的抗氧化因子，
具有极强的抗氧化能力，是蜜蜂维持正常生命特
收稿日期：2013-12-18
基金项目：江西省青年科学基金项目（ 20122BAB214019） ；国家公益性行业农业专项（ 200903006）
作者简介：韩 旭（1988—），男，安徽滁州人，硕士研究生，从事蜜蜂生物学研究。 E-mail： 634235643@
超氧化物歧化酶（ SOD） 是一类广 泛存 在 于动
物、植物、微生物中的金属酶，根据活性中心结合
的金属离子不同，可以分为铜锌超氧化物歧化酶
铁超氧化物歧化酶 和锰 （Cu /Zn-SOD）、
（ Fe-SOD）
超氧化物歧化酶（Mn-SOD）3 类[8] ，它们通过催化
超氧阴离子自由基发生歧化反应，进而减轻或消
能力的影响未见报道。 鉴于此，本试验拟在总结
前人试验的基础上，进一步开展维生素 C对中华
蜜蜂幼虫发育及工蜂生存能力的影响。
1 材料与方法
1.1 试验动物
试验动物为江西农业大学蜜蜂研究所饲养的
中华蜜蜂。
1.2 主要试剂
总 Trizol 提 RNA 取试剂盒、RNA酶抑制剂购
自全式金公司 反 ，M-MLV 转录酶及 SYBRGreen
实时定量 反应体系为 PCR（RT-qPCR）
10 μL：1 μL
反转录产物，目的基因的上游和下游引物各 0.4 μL，
扩增程序为 预变性 5 μL2 ×SYBR Premix Ex TaqTMⅡ， 3.2 μL ddH2O。
PCR
95 ℃
30 s，95 ℃ 10 s，58.9 ℃
1 min，40 个循环；最后以每 5 s上升 0.5 ℃的速度从
在各重复中选择3个重复进行采样，不参与
生存率的记录和分析。 每重复随机采集 3、9、15
日龄工蜂各 4 只，以 4 只工蜂头部作为 1 个样品，
取样后立即放入液氮速冻，-80 ℃保存，用于 Cu/
Zn-SOD基因相对表达量的测定。
1.6 Cu/Zn-SOD基因相对表达量的测定
用 总 Trizol RNA 提 取 试 剂 盒 进 行 样 品 总
61 ℃升到 95 ℃，记录熔解曲线，每个反转录样品重
等 通过给刚出房的中华蜜蜂 [11]
（ Apiscerana cera-
na）工蜂饲喂不同浓度的维生素 C，发现随着维生
素 C浓度的升高，10 日龄中华蜜蜂的死亡率显著
下降，Cu /Zn-SOD基因相对表达量也呈下降趋势，
但差异不显著。 然而，其试验组只设计了 2 种浓
度的维生素 C，饲喂高浓度维生素 C对蜜蜂生存
随维生素 C含量的增加，6 日龄幼虫、3 日龄蛹和刚羽化蜜蜂的体重均先增加后降低，且均表现
为Ⅱ和Ⅲ组显著高于对照组（ P＜0.05） ；幼虫的化蛹率、羽化率与体重有相似的变化趋势；铜锌超
氧化物歧化酶（Cu/Zn-SOD）基因相对表达量也随维生素 C含量的增加先上升后下降，且各试验
组 6 日龄幼虫和 3 日龄蛹 Cu /Zn-SOD基因的相对表达量均显著高于对照组（P＜0.05）。 在工蜂
通讯作者 吴小波 讲师 *
：
， ，E-mail： wuxiaobo21@
1266
动物营养学报
卷 26
征的重要保障。 早在 1990 年，刘富海[6] 的研究就
表明，在蜜蜂饲粮中添加适量的维生素 C可延长
蜜蜂的寿命。 维生素 C也能有效刺激蜜蜂取食并
对幼虫及成蜂腺体发育有促进作用[7] 。
RNA的提取。 所有操作均按照试剂盒说明书进
行。 将提取的总 RNA溶于 30 的焦 μLRNA-free
磷酸二乙酯（ DEPC） 水中，经琼脂糖凝胶电泳和紫
外分光光度计检测后，放入-80 ℃保存。
用反转录试剂盒对总 RNA进行反转录，反应体
系为 总 50 μL：8 μL RNA，10 μLBuffer，8 μLdNTP，
从每组的8 个重复中各任意选出4 个重复，每 重复随机选取发育正常的 6 日龄幼虫、3 日龄蛹以 及刚羽化蜜蜂（1 日龄成蜂）各 5 只，准确称重，计 算其均值（幼虫需用蒸馏水冲洗掉体表蜂王浆并 用吸水纸擦干）。 另外，从剩余的 4 个重复中，每 重复随机选取 6 日龄幼虫、3 日龄蛹以及刚羽化蜜 蜂各 3 只，立即放入液氮速冻，-80 ℃保存，用于 Cu /Zn-SOD基因相对表达量的测定。 1.5.2 工蜂笼养试验
摘 要： 本试验旨在研究维生素 C对中华蜜蜂幼虫发育及工蜂生存能力的影响。 试验分为蜜
蜂幼虫和工蜂饲养试验 2 部分。 蜜蜂幼虫饲养试验：将 800 只 1 日龄中华蜜蜂幼虫随机分为 5
组，每组 8 个重复，每个重复 20 只。 其中，对照组（I组） 饲喂基础饲粮（维生素 C含量为
1.6 mg /kg），4 个试验组分别饲喂在基础饲粮中添加 10（Ⅱ组）、20（Ⅲ组）、30（ Ⅳ组）、40 mg /kg
动物营养学报 2014，26（5）：1265-1271
ChineseJournalofAnimalNutrition
doi：10.3969/j.issn.1006-267×.2014.05.017
维生素 C对中华蜜蜂幼虫发育及 工蜂生存能力的影响
韩 旭 田柳青 王子龙 颜伟玉 曾志将 吴小波*
（江西农业大学蜜蜂研究所，南昌 330045）