新型sars-coⅴ3cl蛋白酶荧光多肽底物的设计、制备及其酶动力学研究

VOI.28
高等学校化学学报NO.12007年1月 CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES 79~82新型SARS-co !3cL 蛋白酶荧光多肽底物的
设计、制备及其酶动力学研究
万惠新，陈莉莉，李 欣，王 昕，胡定宇，沈 旭，沈竞康
（中国科学院上海生命科学研究院上海药物研究所国家新药研究重点实验室，上海201203）
摘要 以邻氨基苯甲酸（Abz ）为荧光发射基团、2，4-二硝基苯基乙二胺（Eddnp ）为荧光猝灭基团，设计合成
了SARS-CO !3CL 蛋白酶的新型荧光多肽底物：H 2N-E （Eddnp ）STLOSGLK （Abz ）-CONH 2.用液相色谱-质谱
（LC-MS ）联用技术进行了表征，表明该多肽底物能被SARS-CO !3CL 蛋白酶识别，并在OS 之间被专一性酶解.另外，利用该多肽底物的荧光共振能量转移（FRET ）特性，对SARS-CO !3CL 蛋白酶的酶解动力学性质
进行了研究，结果表明，此荧光多肽底物可以作为荧光探针，应用于SARS-CO !3CL 蛋白酶活性的测定及其
抑制剂的筛选.
关键词 荧光共振能量转移（FRET ）；SARS-CO !3CL 蛋白酶；荧光探针；液相色谱-质谱
中图分类号 O629.72；O643 文献标识码 A 文章编号 0251-0790（2007）01-0079-04
收稿日期：2006-02-10.
基金项目：上海市科委科技攻关项目（批准号：03DZ19602）资助.
联系人简介：沈竞康（1951年出生），男，博士，研究员，博士生导师，主要从事药物化学研究.E-maiI ：jkshen@ 冠状病毒SARS-CO !是引起“严重急性呼吸系统综合症”（SARS ）的病原体［1］，其主要蛋白酶
SARS-CO !3CL 在SARS-CO !病毒复制过程中起着关键性的调控作用［2］，抑制SARS-CO !3CL 蛋白酶
的活性，能阻断SARS-CO !病毒的复制过程，从而有效地遏制SARS-CO !病毒的进一步转染［3］.因此，
SARS-CO !3CL 蛋白酶成为治疗SARS 的重要靶点.建立灵敏可靠的SARS-CO !3CL 蛋白酶活性检测方法和其抑制剂筛选方法，是SARS-CO !3CL 蛋白酶抑制剂研发过程中的重要环节.目前SARS-CO !
3CL 蛋白酶抑制剂筛选时所采用的多肽底物序列为TSAVL OS GFRK ［4］和ATVRL OA GNAT ［5］，它们分别
在OS 和OA 之间被SARS-CO !3CL 蛋白酶选择性水解.据文献［2］报道，猪的传染性胃肠炎病毒TGEV （POrcine transmissibIe gastrOenteritis virus ）3CL 蛋白酶的15肽底物VSVNSTL OS GLRKMA （1）也能够被SARS-CO !3CL 蛋白酶在OS 之间专一性水解.
前文［6］曾基于TGEV 3CL 蛋白酶15肽底物的12肽短缺肽VNSTL OS GLRKM ，设计合成了具有
FRET 特性的荧光多肽底物并成功地应用于SARS-CO !3CL 蛋白酶的活性测定及其抑制剂筛选［7］.在
此基础上，我们试图进一步合成具有更小分子量及良好FRET 特性的水溶性荧光多肽底物.本文报道了7肽化合物STL OS GL （2）的合成，并在其两端采用水溶性较好的FRET 基团对Abz-Eddnp 进行修饰，得到水溶性荧光多肽底物H 2N-E （Eddnp ）STL OS GLK （Abz ）-CONH 2（3）
.经LC-MS 研究结果证实，该荧光底物可以被SARS-CO !3CL 蛋白酶识别，并在OS 之间专一性酶解.此外，用该荧光多肽底物作为分子探针，对SARS-CO !3CL 蛋白酶的酶解动力学性质进行了研究.
1 实验部分
1.1 仪器及试剂
ThermO Finnigan LCO DECA XP 液相色谱-质谱联用仪；Brucker 400MHz 核磁共振仪；HITACHI F-2500荧光分光光度计；SGW X-4显微熔点仪.
氨基酸、Rink-amide AM 树脂和Wang 树脂均购自上海吉尔生化有限公司；Eddnp 参照文献［8］方法合成；乙腈和甲酸均为色谱纯（TEDIA 公司）；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCI ）和其它常规试剂
购自上海医药集团化学试剂公司；SARS-Co !3CL 蛋白酶由中国科学院上海药物研究所沈旭研究员课
题组表达纯化［9］.
色谱条件：YMC-Pack MB-ODS （3"m ，2.0mm X 50mm ）色谱柱；流动相A ：水（体积分数为0.1%的甲酸），流动相B ：乙腈（体积分数为0.1%的甲酸）；流速0.2mL /min ；从5%~95%梯度洗脱12min.质谱条件：电喷雾离子化，正离子方式（ESI +）检测，m /z 扫描范围为105~1500；喷雾电压为4.5kV ，加热毛细管温度为275C ，毛细管电压为45V ，脱溶剂气流量：150L /h.荧光扫描条件：1mL 荧光比色皿，狭缝宽度为5nm ；固定激发波长!ex =320nm ，扫描发射波长!em =350~500nm ；扫描速度为300nm /min ；每次扫描前以空白Tris-HCI 缓冲溶液（20mmoI /L ，pH =7.0）为基准调零.
1.2 合 成
1.2.1 Fmoc-Lys （Boc-Abz ）-OH 的合成 参照文献［10］方法合成.收率60%，熔点66~68C ，
［"］20D =-6.2
（c 1.0，DMF ）.1H NMR （CDCI 3），#：1.61（9H ，s ），1.4~2.0（6H ，m ），3.30~3.53（2H ，m ），4.13~4.21（1H ，m ），4.30~4.39（3H ，m ），7.32（1H ，d ， =9.6Hz ），7.27~7.41（5H ，m ），6.90（1H ，m ），7.55（2H ，d ， =9.6Hz ），7.74（2H ，d ， =10.0Hz ），8.26（1H ，d ， =11.2Hz ），8.28~8.31（1H ，dd ， =2.8，9.6Hz ），8.90（1H ，d ， =2.8Hz ），10.06（1H ，s ）；LC-MS ，m /z ：586（M —H ）.
1.2.2 Fmoc-GIu （Eddnp ）-OH 的合成 参照文献［8］方法合成.收率80%，熔点144~146C ，
［"］20D =-6.1
（c 1.0，DMF ）.1H NMR （DMSO-d 6），#：1.82~2.24（4H ，m ），2.54~2.56（2H ，m ），3.57~3.61（2H ，m ），3.97~4.03（1H ，m ），4.24~4.32（3H ，m ），7.35~7.40（2H ，dd ， =7.2，7.6Hz ），7.44~7.48（2H ，dd ， =7.2，7.6Hz ），7.76（2H ，d ， =7.2Hz ），7.94（2H ，d ， =7.6Hz ）；LC-MS ，m /z ：578（M +H ）.
Table 1 Physical data of the substrate 3and hydrolyzed products 4and 5Compound Purity （%）t R /min MS ，m /z （CaIcd.）399.0 6.86 645.2!（1287）498.0 6.22785.4（784）599.0 5.66522.4（521）
!The base peak of the characteristic ion is the peak of the doubIe- charged ion of compound 3.
1.2.3 多肽的合成 参照文献［8，11］方法，用
Rink-amide AM 树脂和Wang 树脂作为固相载体，
采用经典的Fmoc-固相多肽合成方法制得多肽粗
品，经半制备HPLC 分离纯化得多肽纯品：荧光底
物H 2N-E （Eddnp ）STL OS GLK （Abz ）-CONH 2（3）
及其酶解产物H 2N-E （Eddnp ）STLO-OH （4）和H 2N-SGLK （Abz ）-CONH 2（5）
.多肽产物的物理数据见表1.1.3 酶动力学实验
固定SARS-Co !3CL 蛋白酶的终浓度为4"moI /L ，测定荧光底物3在不同浓度（10~1000
"moI /L ）
下的初速度10.从加入酶溶液开始，在60min 内每隔10min 测定一次，记录发射波长!em =410nm 处的荧光强度，绘制荧光强度（FIuorescence intensity ）对时间t 的关系曲线.60min 后向反应液中加入过量酶溶液，并在25C 恒温槽中保温至体系观察不到荧光强度的变化时，记录荧光强度.动力学数据处理及作图参考文献［7~12］方法完成.2 结果与讨论
2.1 荧光底物的设计与合成
根据Forster 规则，一般相隔约为10个氨基酸序列时，底物荧光猝灭效率较高，当肽链增长时荧光
猝灭效率降低［13，14］.因此，对TGEV 3CL 蛋白酶的15肽底物SVNSTL OS GLRKMA （1）（图1）两侧氨基
酸适当缩减，应用固相合成方法合成了一系列1的短缺肽，经LC-MS 方法检测，确认7肽序列2：STL OS GL （图1）仍然能被SARS-Co !3CL 蛋白酶专一性地在OS 之间酶解.另据文献［10］报道，Abz 的发射光谱和Eddnp 的吸收光谱在400nm 附近有较大范围的重叠；同时，Abz 和Eddnp 都具有良好的水溶解性.因此，选用Abz 和Eddnp 分别作为共价连接荧光发射基团和荧光猝灭基团，在7肽序列STLOSGL （2）（图1）的C 端和N 端分别延伸Lys 和GIu 氨基酸单元，荧光基团对Abz 和Eddnp 分别与Lys 和GIu 的侧链共价连接.通过固相多肽合成方法制备了衍生化的多肽底物3和酶解产物4，5.
08高等学校化学学报 VoI.28
Fig.1 Design of the FRET substrate of SARS-Co!3CL pro
2.2 荧光底物的稳定性检测及酶解位点的确证［15］
荧光底物3在缓冲溶液中于25C保温l1后，用LC-MS检测溶液的组成.在总离子流质量色谱图上，只有荧光底物3的特征峰［图2（A）］，没有其它杂质生成，说明荧光底物3在实验条件下足够稳定，不会因自身降解而产生干扰.当荧光底物3和SARS-CO!3CL蛋白酶在相同条件下保温l1后，在总离子流质量色谱图上除了有荧光底物3的特征峰外，还有两个新峰出现［图2（B）］，其保留时间（5.66和6.22min）和分子量（522.2和785.l）分别与合成的酶解产物4和5相同.3个物质的ESI质谱图如［图2（C~E）］所示.将上述样品继续保温21后，图2（A）中荧光多肽底物3的峰面积积分基本不变，而图2（B）中荧光多肽底物3的峰面积积分减小，酶解产物4和5的峰面积积分增加.可以确认荧光多肽底物3可被SARS-CO!3CL蛋白酶在OS之间专一性酶解.
Fig.2 LC-MS spectra of the FRET substrate3（A，B）and ESI spectra of its enzymatically
hydrolyzed mixture（C—E）
（A）HPLC grap1Of FRET substrate3（l00"mOI/L）in20mmOI/L pH=7.0Tris-HCI buffer after l1incubatiOn at25C；
（B）HPLC grap1Of t1e mixture Of FRET substrate3（l00"mOI/L）and SARS-CO!3CL prO（4"mOI/L）in20mmOI/L pH=7.0
Tris-HCI buffer after l1incubatiOn at25C；（C）substrate3；（D）cOmpOund4；（E）cOmpOund5.
2.3 应用FRET荧光底物3测定SARS-Co!3CL pro酶动力学常数!
m 和!
cat
Fig.3 Fluorescence emission spectra of FRET substrate 3（"）and its hydrolyzed segment5（#）Fig.4 Michaelis-Menten double-reciprocal plot
在波长!
ex
=320nm的光源激发下，l0"mOI/L荧光底物3和相同浓度的酶解荧光肽段5所产生的
荧光发射光谱明显不同（图3）.在发射波长!
em =4l0nm处，酶解荧光肽段5的荧光强度比荧光多肽
l8
NO.l万惠新等：新型SARS-CO!3CL蛋白酶荧光多肽底物的设计、制备及其酶动力学研究
底物3的荧光强度高15倍以上，表明荧光底物3具有有效的FRET特性，C端荧光发射基团Abz所产生的荧光能够被N端荧光猝灭基团Eddnp有效猝灭［14］.
不同浓度的荧光底物3与SARS-Co!3CL蛋白酶在缓冲溶液中保温，记录反应体系荧光强度随时
间的变化，计算出SARS-Co!3CL蛋白酶对不同浓度［c（S）］荧光底物3的酶解反应初速度1
0，以1/1
对1/c（S）作图，经线性回归，得到MichaeIis-Menten双倒数直线（图4），求得酶动力学常数K
m
=525.5 "moI/L，K cat=1.29min-1，K cat/K m=2.45mmoI-1·L·min-1.结果表明，SARS-Co!3CL蛋白酶对文献［4~7］报道的荧光底物的亲和性与本文所用荧光底物3的亲和性相当.
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Design and Synthesis of a Novel Fluorescent Peptide Substrate of SARS-co!3cL pro and Studies on Its Enzymatic Kinetics WAN Hui-Xin，CHEN Li-Li，LI Xin，WANG Xin，HU Ding-Yu，SHEN Xu，SHEN Jing-Kang!
（State Key Laboratory of Drug Research，Shanghai Institute of Materia Medica，
Shanghai Institutes for Biological Sciences，Shanghai，201203，China）
Abstract A noveI fIuorescent peptide substrate，H
2N-E（Eddnp）STL OS GLK（Abz）-CONH
2
，based on fIuo-
rescence resonance energy transfer（FRET）technigue，was designed and synthesized by soIid-phase peptide synthesis.Abz/Eddnp was used as the fIuorescence donor and guenching pair.The highIy fIuorescent Abz group was efficientIy guenched by energy transfer to the Eddnp group.The fIuorescent substrate was specificaI-Iy hydroIyzed by SARS-Co!3CL pro between S with15-foId increase in fIuorescence and the cIeavage site was
determined by HPLC-MS.The studies on its enzymatic kinetics（K
m =525.5"moI/L and K
cat
=1.29min-1）
eIucidate that the synthetic fIuorescent peptide substrate is suited to be used as a fIuorescent probe in determi-nation of the activity of SARS-Co!3CL pro and screening assays for its inhibitors.
Keywords FIuorescence resonance energy transfer（FRET）；SARS-Co!3CL pro；FIuorescent probe；LC-MS
（Ed.：H，J，Z）28高等学校化学学报VoI.28
新型SARS-CoⅤ 3CL蛋白酶荧光多肽底物的设计、制备及其
酶动力学研究
作者：万惠新， 陈莉莉， 李欣， 王昕， 胡定宇， 沈旭， 沈竞康， WAN Hui-Xin， CHEN Li-Li， LI Xin， WANG Xin， HU Ding-Yu， SHEN Xu， SHEN Jing-Kang
作者单位：中国科学院上海生命科学研究院上海药物研究所国家新药研究重点实验室,上海,201203刊名：
高等学校化学学报
英文刊名：CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES
年，卷(期)：2007,28(1)
被引用次数：1次
1.Rota P A;Oberste M S;Monroe S S查看详情[外文期刊] 2003
2.Anand K;Ziebuhr J;Wadhwani P查看详情[外文期刊] 2003
3.Huang C K;Wei P;Fan K Q查看详情[外文期刊] 2004
4.Fan K;Wei P;Feng Q查看详情 2004
5.Kuo C J;Chi Y H;Hsu T A查看详情 2004
6.Chen S;Chen L L;Luo H B查看详情 2005
7.Chen L L;Gui C S;Luo X M查看详情[外文期刊] 2005
8.Robson L M;Lira C A;Elaine D N查看详情[外文期刊] 2001
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13.Grahn S;Ullmann D;Jakubke H D Design and synthesis of fluorogenic trypsin peptide substrates based on resonance energy transfer[外文期刊] 1998(2)
14.Mittoo S;Sundstrom L E;Bradley M查看详情[外文期刊] 2003
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2007(10)
引用本文格式：万惠新.陈莉莉.李欣.王昕.胡定宇.沈旭.沈竞康.WAN Hui-Xin.CHEN Li-Li.LI Xin.WANG Xin. HU Ding-Yu.SHEN Xu.SHEN Jing-Kang新型SARS-CoⅤ 3CL蛋白酶荧光多肽底物的设计、制备及其酶动力学研究[期刊论文]-高等学校化学学报 2007(1)。