PCSK9及 IDOL 在姜黄素促进 HepG2细胞摄取 LDL-C 中的作用

PCSK9及 IDOL 在姜黄素促进 HepG2细胞摄取 LDL-C 中
的作用
欧露;张彩平;刘英;乔新惠;麻燕妮;欧淳;胡小波;田英;龙石银
【摘要】Aim To explore the lipid-lowering mecha-nisms of curcumin from the molecular levels and pro-vide scientific basis for clinical development of lipid-lowering drugs.Methods Using oil red O staining and enzymic to determinate the levels of cholesterol in HepG2 cells.Moreover,uptaking of DiI-LDL was also measured.The expressions of mRNA and protein were detected by RT-Q-PCR and Western blot.Results The red lipid droplets and the levels of TC and FC sig-nificantly increased in HepG2 cells after treated with curcumin.The orange red fluorescence was higher than that of control.Curcumin could promote the expression levels of mRNA and protein of SREBP2 and LDLR, what′s more,curcumin c ould reduce the expression of the mature PCSK9 level and IDOL protein.Conclu-sion Curcumin accelerates LDL-C uptake probably via downregulating the expression of PCSK9 and IDOL in HepG2 cells.%目的：从分子水平探讨姜黄素的降脂机制，为姜黄素作为降脂药物的临床开发提供科学依据。

方法本研究运用油红 O 染色、酶法测定细胞内胆固醇含量，荧光染色检测细胞胆固醇摄取，RT-Q-PCR 及 Western blot 检测姜黄素对HepG2细胞内胆固醇代谢相关因子在 RNA 和蛋白水平的表达。

结果姜黄素组的 HepG2细胞内红色脂滴明显增多，且TC 及FC 含量增高。

DiI 标记 LDL，姜黄素组 HepG2细胞橙红色荧光高于对照组。

姜黄素能升高 SREBP2和 LDLR 的mRNA 和蛋白水平的表达；降低 PCSK9蛋白成
熟体及 IDOL蛋白表达。

结论姜黄素可能通过下调 PCSK9及 IDOL 的表达，进而减少 LDLR 降解，促进 HepG2细胞摄取 LDL-C。

【期刊名称】《中国药理学通报》
【年(卷),期】2015(000)009
【总页数】6页(P1286-1291)
【关键词】姜黄素;低密度脂蛋白受体;前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9型;诱导低密度脂蛋白受体降解蛋白;固醇调节元件结合蛋白2;3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还
原酶
【作者】欧露;张彩平;刘英;乔新惠;麻燕妮;欧淳;胡小波;田英;龙石银
【作者单位】南华大学生物化学与分子生物学教研室，湖南衡阳 421001;南华大
学生物化学与分子生物学教研室，湖南衡阳421001;常德市职业技术学院医学系，湖南常德 415000;南华大学生物化学与分子生物学教研室，湖南衡阳 421001;南华大学生物化学与分子生物学教研室，湖南衡阳 421001;南华大学生物化学与分
子生物学教研室，湖南衡阳 421001;南华大学生物化学与分子生物学教研室，湖
南衡阳 421001;南华大学生物化学与分子生物学教研室，湖南衡阳 421001;南华大学生物化学与分子生物学教研室，湖南衡阳 421001
【正文语种】中文
【中图分类】R282.71;R329.24;R344.81;R972.6;R977.3;R977.6
中国图书分类号：R282．71；R329．24；R344．81；R972．6；R977.3；
R977.6
网络出版时间：2015－8－10 14：37 网络出版地址：http：／／
www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．021．html
血浆LDL-C水平增高是冠心病（coronary heart disease，CHD）最重要的危险
因素，降低LDL-C水平是防治心血管疾病的首选策略［1］。

血浆中绝大部分
LDL-C主要经LDLR途径代谢，LDLR数量、结构及功能异常等引起的高胆固醇血症增加了AS-CVD患病风险［2］。

LDLR的表达同时受到转录水平及翻译后水平两方面的共同调节，转录水平主要受固醇调节元件结合蛋白2（sterol regulatory element binding protein 2，SREBP2）的调节，诱导低密度脂蛋白受体降解蛋
白（inducible degrader of low-densi-tylipoprotein receptor，IDOL）及前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶9型（proprotein convertase subtilisin／kexin type 9，PCSK9）则对LDLR进行翻译后水平的调节。

IDOL具有E3泛素连接酶的作用，通过介导LDLR泛素化经溶酶体途径降解［3］，影响细胞表面LDLR的分布。

他
汀类药物作为3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶的竞争性抑制剂［4］，可通过升高LDLR表达，降低血浆LDL-C水平，但同时却升高了具有降低LDLR功能的PCSK9的表达，导致他汀类降脂作用受限［5］。

为此，寻求具有降低IDOL及PCSK9表达，升高细胞表面LDLR水平的联合用降脂新药，仍是当前ASCVD防
治的研究焦点。

姜黄素（curcumin）属二酮类化合物，是从姜科、天南星科植物的根茎中提取的
植物多酚［6］。

研究表明姜黄素可明显升高HepG2细胞LDLR的mRNA及蛋白水平，通过激活SREBP2并使得其靶基因LDLR表达水平增高［7］，起到降脂的作用。

然而，Tai等［8］则认为是通过肝细胞核因子1α（hepa-tocyte nuclear factor 1α，HNF-1α）抑制转录水平PCSK9的表达，降低LDLR从溶酶体途径降解，进而使HepG2细胞表面LDLR水平升高。

因此，为进一步研究姜黄素的降脂机制，本实验以HepG2为对象，探讨姜黄素对LDLR的转录及翻译后水平调节，
为姜黄素作为降脂药物的临床开发提供科学依据。

HepG2细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库；DMEM培养基和无
支原体胎牛血清（FBS）购于美国Gibco公司；姜黄素和25-羟胆固醇（25-HC）购自美国Sigma公司；人源性LDL购自广州弈源公司；人源性LPDS购自美国Biomedical Technol-ogies Inc．公司；油红O和DMSO购自美国Amresco公司；组织总胆固醇／游离胆固醇酶法测定试剂盒（E1015／E1016）购自北京普利莱基因技术公司；总RNA提取试剂盒（TRIzo1 Reagent）购自康为世纪生物科
技有限公司；DiI-LDL购自Invitrogen公司；兔抗人的LDLR、IDOL和PCSK9
抗体购自Abcam公司，山羊抗人的SREBP2抗体购自R＆D公司，辣根过氧化物酶（horseradishperioxidase，HRP）标记的二抗：山羊抗兔和兔抗山羊均购自
上海优维宁生物科技公司。

其余均为进口或国产分析纯试剂。

2．1 实验分组油红O染色及胆固醇含量酶法测定分组：①Basal，②Control （25 mg·L－1LDL），③
curcumin（25 mg·L－1LDL＋25 μmol·L－1curcu-min），④Vehicle（25 mg·L－1LDL＋体积分数为0.000 625的DMSO）。

DiI-LDL、RT-Q-PCR及Western blot实验分组：①Basal，②Control（25 mg·L－1LDL），③LPDS（体积分数为0．1的LPDS），④25-HC（10 mg·L－125-HC），⑤curcumin（25 mg·L－1LDL＋25 μmol· L－1curcumin）。

HepG2细胞接种于用含有体积分数为0．1的FBS和体积分数为0．01的青－链霉素的高糖DMEM培养液，在37℃条件下培养24 h后，再按上述分组药物孵育24 h。

2．2 油红O染色观察胞内脂质蓄积细胞培养至对数生长期，每孔105个细胞
接种至预先放置好无菌盖玻片的6孔板内，培养24 h，药物孵育24 h后，质量
浓度为40 g·L－1的多聚甲醛固定30 min，油红O染色7 min，苏木精染色4 s，
甘油封片，倒置显微镜拍照观察，HepG2细胞中脂滴呈橘红色，核呈蓝色。

2．3 酶法检测细胞内胆固醇细胞培养至对数生长期，每孔105个细胞接种细胞至6孔板培养24 h，再药物孵育24 h，PBS洗3次，吸干余液，加入200 μL裂解液，冰上裂解10 min，收集裂解液，6 000 r· min－1离心5 min，取上清液，按照总胆固醇含量酶法测定试剂盒（E1015／E1016）的说明书操作，37℃条件下水浴20 min后，酶标仪分别测定总胆固醇和游离胆固醇的含量。

BCA测各组细
胞内总蛋白含量用于标化各样本的胆固醇值，标化后胆固醇的浓度单位为：总胆固醇（游离胆固醇）／蛋白＝μmol·g－1。

2．4 DiI-LDL摄取检测对数期生长HepG2细胞以每孔105个细胞接种6孔板内，贴壁生长24 h后，药物孵育24 h。

除Basal组外，其余各组更换培养液为体积分数为0.02的LPDS＋DMEM，加DiI-LDL 10 mg·L－1，避光37℃孵育4 h，含质量浓度为4 g ·L－1的BSA的PBS摇床摇洗2×5 min，PBS洗3次，质量浓度为40 g·L－1的多聚甲醛的PBS固定10 min，PBS洗3次，Hoechst 33342
染色20 min，PBS 洗3次，加抗荧光淬灭液，荧光显微镜观察，细胞膜呈橙红色荧光，细胞核呈蓝色荧光。

2．5 RT-Q-PCR测mRNA水平对数期生长HepG2细胞以每孔106个细胞接
种至50 mL培养瓶，培养24 h，药物孵育24 h后，根据TRIzo1 Rea-gent说明书提取总RNA，紫外分光光度仪测定OD260／OD280比值介于1.9－2.1。

琼脂糖凝胶电泳分析RNA完整性，28s rRNA、18S rRNA条带清晰可见，RNA未被
降解，提取的总RNA可用于后续实验。

根据逆转录试剂盒说明书操作，取2 μg
总RNA逆转录合成cDNA，反应条件为：42℃、30 min，85℃、10 min；再取
2 μg逆转录产物进行real time-PCR，反应体系为20 μL，引物由上海诺伦生物
医药技术有限公司设计与合成（Tab 1）。

PCR反应条件：50℃、2 min，95℃、3 min，然后95℃、12 s，62℃、40 s，40个循环。

用ΔΔCT来计算基因的表达
水平，计算公式如下：ΔCT＝目的基因CT值－β-ac-tin基因CT值；ΔΔCT＝实
验组ΔCT－对照组ΔCT；实验组／对照组基因表达水平的倍数＝2－ΔΔCT。

2．6 Western blot检测蛋白表达水平细胞接种培养24 h，药物孵育24 h后，冰上裂解30 min，收集细胞裂解液4℃条件下，13 000 r·min－1离心15 min。

小心吸取上清，每组预留5 μL裂解液用
于BCA蛋白定量。

裂解上清：SDS-loading buffer＝4∶1混匀，100℃条件下煮沸5 min，于－20℃保存。

电泳条件先恒压80 V，30 min，后转换为120 V，50 min；电泳完毕后切胶，0.22 μm PVDF膜甲醛活化5 min，恒流300 mA，3 h
湿转转膜；质量浓度为50 g ·L－1的脱脂牛奶封闭2 h；TBST稀释一抗（SREBP2稀释1∶500；β-actin、LDLR、PCSK9和I-DOL稀释比例均为1∶1 000），4℃摇床过夜，TBST洗脱一抗3×5 min；孵育二抗（1∶5 000），室温
温和摇晃45 min，TBST洗脱二抗4×10 min；Tanon ECL高敏成像系统对结果
进行检测。

各组细胞目的蛋白与内参β-actin的光密度比值，分别代表各目的蛋白表达水平。

2．7 统计学分析数据均采用SPSS 13．0软件进行统计学分析，数值以±s表示，两组间的比较用单因素方差分析。

3．1 油红O染色观察姜黄素对HepG2细胞内脂质蓄积的影响为研究姜黄素处理24 h后对HepG2细胞荷脂情况的影响，油红O染色结果显示：Control组中细胞内脂滴较Basal组增多；与Control相比，Vehi-cle组细胞内红染脂滴无明
显变化，经curcumin处理的细胞内红染脂滴明显增加，表明curcumin促进HepG2细胞脂滴蓄积增多（Fig 1）。

3．2 酶法测定HepG2细胞内胆固醇含量变化为研究姜黄素处理后细胞内胆固
醇含量的变化，通过胆固醇酶法测定结果显示：与Basal组相比，Control细胞内TC、FC水平增高，提示细胞荷脂成功；与Control相比，Vehicle组细胞内TC、
FC水平有增高的趋势，但差异无统计学意义，提示溶媒对细胞摄取胆固醇无明显
影响；curcumin组细胞内TC、FC水平明显增高（P＜0.01），提示curcumin
促使HepG2细胞摄取胆固醇使得胞内TC、FC含量明显增高（Fig 2）。

3．3 荧光染色检测HepG2细胞胆固醇摄取的影响为研究HepG2细胞是否通过促进LDL摄取使胆固醇含量增高，DiI-LDL摄取实验结果显示：与Con-trol组比较，LPDS组HepG2细胞橙红色荧光明显增高，而25-HC组红色荧光则明显降低；curcumin组HepG2细胞橙红色荧光高于Control组，表明curcu-min促进HepG2细胞LDL摄取（Fig 3）。

3．4 姜黄素对HepG2细胞LDLR及SREBP2表达的影响与Control相比，LPDS组和curcumin组LDLR和SREBP2的mRNA及蛋白表达水平明显升高（P ＜0.05）；25-HC组LDLR和SREBP2的mR-NA及蛋白的表达减少（P＜0.05）；curcumin组的LDLR和SREBP2的mRNA水平明显升高（P＜0.05）。

结果提示，curcumin可能通过激活SREBP2促进LDLR表达增高（Fig 4）。

3．5 姜黄素对HepG2细胞PCSK9及IDOL蛋白表达的影响 Western blot结
果显示，与Control组相比，LPDS组中PCSK9蛋白明显升高（P＜0.05），而诱导低密度脂蛋白受体降解蛋白（inducible de-grader of low-densitylipoprotein receptor，IDOL）蛋白
表达无差异；25-HC组中PCSK9蛋白水平明显降低（P＜0.05），IDOL蛋白表
达水平升高（P＜0.05）；curcumin组中PCSK9和IDOL蛋白水平明显降低（P
＜0.05）。

结果提示：curcumin可能通过降低了PCSK9及IDOL蛋白表达，减
少了LDLR的降解，促进血浆LDL-C的清除（Fig 5）。

美国心脏协会指出降低心血管事件主要归因于LDL-C的下降，他汀类药物通过竞
争性抑制胆固醇合成限速酶的活性成为临床降LDL-C的首选药物，中等强度剂量
他汀可降低血浆LDL-C 30%－40%的水平，不仅降低心血管事件，而且还降低了
总死亡率，奠定了他汀在防控ASCVD事件中的核心地位［9－10］。

然而他汀类还通过激活SREBP2使具有诱导LDLR经溶酶体降解的PCSK9表达增高［11］，加倍他汀用药剂量仅进一步降低LDL-C的6%，且不良反应增加，致使他汀大剂量单用降脂作用受限。

尽管AMG145（PCSK9单克隆抗体）已顺利通过临床Ⅲ期实验阶段［12］，具有明显降低血浆LDL-C水平，减少ASCVD风险的疗效，然而因其免疫原性及临床使用方式有限均使AMG145作为生物制剂降脂
药物开发存在一定的局限性。

本实验采用curcumin作用于体外培养HepG2细胞24 h，油红O染色及胆固醇酶法测定结果表明，curcumin使HepG2细胞胆固醇蓄积增多；并通过DiI-LDL 摄取实验进一步表明curcumin促进HepG2细胞胆固醇摄取；LPDS是通过激活SREBP2促进LDLR mRNA及蛋白表达增高，作为阳性对照组；而25-HC是通过阻断SREBP2的激活，使LDLR mRNA及蛋白表达降低，作为阳性对照组，curcumin处理组SREBP2及LDLR mRNA及蛋白表达增高，因LDLR是SREBP2下游靶基因，结果提示curcu-min可能通过激活SREBP2转录水平调节LDLR的表达增高，这一结果与Dou等［13］报道的一致。

LDLR途径担负着绝大部分血浆LDL-C的清除，LDLR的功能或表达异常产生高胆固醇血症，增加了ASCVD患病风险［14］。

LDLR除了受SREBP2转录水平调节之外，还受PCSK9及IDOL翻译后水平的调节，影响着血浆LDL-C的代谢。

通过GWAS （genome-wide association studies，GWAS）结果表明，墨西哥人群中IDOL的rs9370867因N342S与高胆固醇血脂高度正相关，而荷兰人群中IDOL的R266X突变体引起明显降低血脂的效应［15］，提示IDOL多态性或突变影响人类血浆LDL-C的清除。

本实验结果显示，curcumin作用后，PCSK9及IDOL蛋白表达降低，表明curcumin可能通过翻译后水平抑制LDLR经溶酶体途径降解。

curcumin还可通过抑制HNF-1α的活性降低PCSK9蛋白表达，减少
LDLR溶酶体降解，促进HepG2细胞胆固醇摄取［11］。

但还需进一步实验证明，curcumin是否通过过多靶点抑制HNF-1α的转录活性，阻滞IDOL泛素化溶酶体降解LDLR，使LDLR蛋白表达增高，这将是本文后续研究阐述的重要目标。

（致谢：本文实验主要在生物技术系的分子生物实验室、蛋白化学实验室、细胞培养室、技能实验室及生物信息室等实验室完成，谢谢本校省部级重点心血管病研究所、肿瘤研究所、病原微生物研究所对本实验无偿提供流式细胞仪、激光共聚焦显微镜等必要设备服务。

）
The red lipid droplets and the levels of TC and FC sig-nificantly increased
in HepG2 cells after treated with curcumin．The orange red fluorescence was higher than that of control．Curcumin could promote the expression levels of mRNA and protein of SREBP2 and LDLR，what′s more，curcumin could reduce the expression of the mature PCSK9 level and IDOL protein．Conclu-sion Curcumin accelerates LDL-C uptake probably via downregulating the expression of PCSK9 and IDOL in HepG2 cells．
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