铁蛋白包载药物的方法及其产物[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810188050.5
(22)申请日 2018.03.07
(71)申请人 昆山新蕴达生物科技有限公司
地址 215300 江苏省昆山市玉山镇元丰路
168号6号房生物楼301
(72)发明人 阎锡蕴　范克龙　朱京东　
(74)专利代理机构 北京律智知识产权代理有限
公司 11438
代理人 于宝庆　崔香丹
(51)Int.Cl.
A61K 9/51(2006.01)
A61K 47/42(2017.01)
A61K 47/20(2006.01)
A61K 47/18(2006.01)
A61K 31/704(2006.01)
A61P 35/00(2006.01) (54)发明名称
铁蛋白包载药物的方法及其产物
(57)摘要
本发明涉及铁蛋白包载药物的方法及其产
物。

具体而言，本发明通过具体探索不同浓度的
SDS或盐酸胍或脲、
不同的处理温度和/或不同的处理时间对铁蛋白如全人铁蛋白解聚和复聚的
影响，研究了利用铁蛋白包载药物如阿霉素的最
佳条件。

利用本发明所获得的包载条件，可以方
便、快捷、高效、
足量地利用铁蛋白包载药物。

权利要求书2页 说明书16页序列表3页 附图21页CN 110237047 A 2019.09.17
C N 110237047
A
1.一种铁蛋白包载药物的方法，其包括步骤：
1)将铁蛋白在一定温度下在含有一定浓度的变性剂和待包载药物的溶液中解聚一定时间，
2)通过去除溶液中的变性剂使铁蛋白复聚并包载药物，
3)任选地，去除溶液中残余的变性剂和药物，
4)任选地，干燥上述溶液获得包载了药物的铁蛋白固体，
其中变性剂是可以削弱或打破铁蛋白亚基间氢键相互作用，从而使铁蛋白发生解聚的物质，优选的，变性剂是指阴离子型表面活性剂或盐酸胍或脲，优选地，阴离子型表面活性剂选自SDS、硬脂酸和/或十二烷基苯磺酸钠；其中一定浓度在阴离子型表面活性剂的情况下是指重量比约1％～10％，在盐酸胍的情况下是指4M～8M，在脲的情况下是指3～10M；一定时间在阴离子型表面活性剂的情况下是指10～120min，在盐酸胍的情况下是指30min～300min，在脲的情况下是指10～1200min；一定温度在阴离子型表面活性剂的情况下是指30℃～100℃，在盐酸胍的情况下是指25℃～70℃，在脲的情况下是指15℃～75℃。

2.根据权利要求1所述的铁蛋白包载药物的方法，其中铁蛋白选自可以形成笼状结构的天然铁蛋白或重组铁蛋白及其变体，优选地，铁蛋白是全人铁蛋白，更优选地，铁蛋白是全人重链铁蛋白。

3.根据权利要求1或2所述的铁蛋白包载药物的方法，其中变性剂选自SDS或盐酸胍。

4.根据权利要求1至3任一项所述的铁蛋白包载药物的方法，其中药物选自抗肿瘤药物或非抗肿瘤药物，优选地，抗肿瘤药物选自肿瘤抗生素、天然来源类抗肿瘤药、金属化合物、放射性同位素、烷化剂、抗代谢类抗肿瘤药，激素类抗肿瘤药，优选地，药物选自肿瘤抗生素、天然来源类抗肿瘤药、放射性同位素或烷化剂，更优选地，药物选自肿瘤抗生素，更优选地，药物选自阿霉素、道诺霉素、胆碱、姜黄素、尼莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺、甘磷酰芥、氟铁龙、多西氟鸟啶、5-氟尿嘧啶、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟鸟苷、替加氟、吉西他滨、卡莫氟、羟基脲、甲氨蝶呤、优福定、安西他滨、放线菌素D、柔红霉素、表柔比星、丝裂霉素、培洛霉素、平阳霉素、吡柔比星、伊立替康、三尖杉酯碱、羟基喜树碱、长春瑞滨、紫杉醇、泰索帝、拓扑替康、长春新碱、长春地辛、长春酰胺、长春碱、替尼泊苷、依托泊苷、阿他美坦、阿那曲唑、氨鲁米特、来曲唑、福美坦、甲他孕酮、他莫昔芬、卡铂、顺铂、达卡巴嗪、奥沙利铂、乐沙定、可铂奥沙、米托蒽醌，更优选地，药物选自阿霉素、道诺霉素、胆碱、顺铂、姜黄素、放射性同位素；和/或，优选地，非抗肿瘤药物选自放射性药物、神经递质类药物、多巴胺受体激动剂、神经中枢抗胆碱药、胆碱受体激动剂类药物、γ分泌酶抑制剂、抗氧剂或麻醉剂，更优选地，放射性药物选自64Cu、235U，神经递质类药物选自碳酰胆碱、阿托品、东莨菪碱、多巴胺及其衍生物，多巴胺受体激动剂选自溴隐亭、培高利特、阿扑吗啡等麦角碱类衍生物及非麦角碱类衍生物，神经中枢抗胆碱药选自苯海索、苯扎托品及丙环定，胆碱受体激动剂类药物选自毒蕈碱、毛果芸香碱，γ分泌酶抑制剂选自双氟酮类，抗氧剂选自褪黑激素，麻醉剂选自蒽胺。

5.根据权利要求1至4任一项所述的铁蛋白包载药物的方法，其中去除溶液中的变性剂采用脱盐方式进行，优选地，采用脱盐柱进行。

6.根据权利要求1至5任一项所述的铁蛋白包载药物的方法，其中使用阴离子型表面活性剂的情况下铁蛋白包载药物的质量比为5％-60％，优选地，至少8％、10％、15％、20％、
25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或更高，更优选地，至少20％、25％、30％或35％；使用盐酸胍变性剂的情况下铁蛋白包载的药物的量5％-60％，优选地，至少8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或更高，更优选地，至少20％、25％、30％或35％；使用脲变性剂的情况下铁蛋白包载的药物的量5％-60％，优选地，至少8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或更高，更优选地，至少20％、25％、30％或35％。

7.根据权利要求1至6任一项所述的铁蛋白包载药物的方法，其中溶液中铁蛋白含量范围为0.1～100mg/ml，优选地，0.2～10mg/ml，更优选地，0.3～5mg/ml，更优选地，0.5～2mg/ ml，更优选地，0.7～1.4mg/ml；和/或，待包载药物的含量范围0.1～50mg/ml，优选地，0.2～10mg/ml，更优选地，0.3～5mg/ml，更优选地，0.5～2mg/ml，更优选地，0.7～1.4mg/ml。

8.根据权利要求1至7任一项所述的铁蛋白包载药物的方法，其中一定浓度在阴离子型表面活性剂的情况下是指重量比约5％～10％，在盐酸胍的情况下是指6M～8M，在盐酸胍的情况下是指5～8M；一定时间在阴离子型表面活性剂的情况下是指10～30min，在盐酸胍的情况下是指30min～120min，在脲的情况下是指20～200min；一定温度在阴离子型表面活性剂的情况下是指65℃～75℃，在盐酸胍的情况下是指40℃～60℃，在脲的情况下是指20℃～50℃。

9.根据权利要求1至8任一项所述的铁蛋白包载药物的方法，其中一定浓度在阴离子型表面活性剂的情况下是指重量比约6.5％～8％，在盐酸胍的情况下是指6.5M～7.5M，在盐酸胍的情况下是指5.5～6.5M；一定时间在阴离子型表面活性剂的情况下是指10～20min，在盐酸胍的情况下是指50min～72min，在盐酸胍的情况下是指25～100min；一定温度在阴离子型表面活性剂的情况下是指68℃～72℃，在盐酸胍的情况下是指45℃～55℃，在盐酸胍的情况下是指22℃～35℃。

10.根据权利要求1至9任一项所述的铁蛋白包载药物的方法，其中溶液中含有促进药物的溶解和/或铁蛋白的聚集的添加剂，优选地，所述添加剂选自DMA、DMF、DMSO或其混合物。

11.根据权利要求1至10任一项所述的铁蛋白包载药物的方法，其中溶液中铁蛋白与包载药物的质量比例为5:1～1:5。

12.根据权利要求1至11任一项所述的铁蛋白包载药物的方法，其中溶液的缓冲体系为Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液(PBS)、碳酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或柠檬酸盐缓冲液，缓冲液的pH介于3～10，缓冲液的浓度介于20～500mM。

13.利用权利要求1-12任一项所述的铁蛋白包载药物的方法获得的包载药物的铁蛋白。

铁蛋白包载药物的方法及其产物
技术领域
[0001]本发明涉及铁蛋白包载药物的方法及其产物。

具体而言，本发明涉及利用SDS或盐酸胍或脲解聚、复性铁蛋白如全人铁蛋白并包载药物如阿霉素的方法及产物。

背景技术
[0002]铁蛋白(ferritin)是参与和维持铁代谢平衡的重要功能蛋白，它是一类广泛存在于动植物及微生物细胞中含高铁量的蛋白质。

从细菌到人类，尽管不同生物的铁蛋白氨基酸序列具有极大的差别，但其结构相似。

典型的铁蛋白结构是由蛋白外壳和铁内核两部分构成，其中蛋白外壳是由24个亚基自组装形成的笼状结构(外径12nm，内径8nm)，铁内核的主要成分为水铁矿(5Fe2O3·9H2O)。

铁蛋白外壳通常是由两种蛋白亚基(H和L)组成。

在机体不同组织和器官中，铁蛋白分子中含有H和L亚基的比例有所不同。

[0003]人H铁蛋白(HFn)是指由人铁蛋的H亚基自组装形成的铁蛋白。

由人铁蛋白的H亚基可以自组装形成笼状蛋白，所包含的人铁蛋白的H亚基数目通常为24。

人H铁蛋白的全长氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

[0004] MTTASTSQVRQNYHQDSEAAINRQINLELYASYVYLSMSYYFDRDDVALKNFAKYFLHQSHEEREHAEKLMKLQNQR GGRIFLQDIKKPDCDDWESGLNAMECALHLEKNVNQSLLELHKLATDKNDPHLCDFIETHYLNEQVKAIKELGDHVT NLRKMGAPESGLAEYLFDKHTLGDSDNES(SEQ ID No.1)
[0005]人L铁蛋白(LFn)是指由人铁蛋的L亚基自组装形成的铁蛋白。

由人铁蛋白的L亚基可以自组装形成笼状蛋白，所包含的人铁蛋白的L亚基数目通常为24。

人L铁蛋白的全长氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

[0006] MSSQIRQNYSTDVEAAVNSLVNLYLQASYTYLSLGFYFDRDDVALEGVSHFFRELAEEKREGYERLLKMQNQRGGRA LFQDIKKPAEDEWGKTPDAMKAAMALEKKLNQALLDLHALGSARTDPHLCDFLETHFLDEEVKLIKKMGDHLTNLHR LGGPEAGLGEYLFERLTLKHD(SEQ ID No.2)
[0007]激烈火球菌铁蛋白(pfFn)是指由激烈火球菌铁蛋白亚基自组装形成的铁蛋白。

激烈火球菌铁蛋白亚基可以自组装形成笼状蛋白，所包含的人激烈火球菌铁蛋白的亚基数目通常为24。

激烈火球菌铁蛋白的全长氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

[0008]MLSERMLKALNDQLNRELYSAYLYFAMAAYFEDLGLEGFANWMKAQAEEEIGHALRFYNYIYDRNGRVE LDEIPKPPKEWESPLKAFEAAYEHEKFISKSIYELAALAEEEKDYSTRAFLEWFINEQVEEEASVKKILDKLKFAKD SPQILFMLDKELSARAPKLPGLLMQGGE
[0009]根据文献报道，不同来源铁蛋白的药物装载，主要依赖于两种方式：1、药物在特定处理条件下，通过铁蛋白上的离子通道或疏水通道，进入蛋白壳内部；2、利用低pH值或高浓度脲，使蛋白壳发生解聚，在随后的复聚过程中加入待包载药物，进而实现药物在蛋白壳内部的装载。

上述的包载方法中，尤其以高浓度脲条件下的HFn包载阿霉素效率最高，达到每分子HFn装载33分子阿霉素；该方法的简要步骤为：将人HFn加入终浓度大于6M的脲中，室温
下反应30分钟，随后加入适量阿霉素试剂，并避光反应10分钟，然后使用透析的方法，将反应体系中的脲浓度逐级递减至0，从而实现阿霉素在HFn中的包载。

相比其他包载方法，虽然高浓度脲法有效地提高了阿霉素在HFn中的装载量，但是距离临床用药需求仍有较大的差距，按照1分子铁蛋白装载33分子的阿霉素计算，临床单次给药所需的蛋白质量就达到了克级水平，显著超出了现有蛋白质药物的最高给药剂量(百毫克级)。

为了满足临床用药需求，本领域必须开发载药量更大的HFn药物包载方法。

[0010]现有技术中存在大量需要包载的药物。

这些药物包载后要么可以避免毒副作用，要么可以避免溶解度低以提高利用率，要么可以避免被降解，等等。

例如难溶性药物多西紫杉醇在包载后就可以避免其溶解度低难以施用的确定。

[0011]阿霉素是一种抗肿瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对多种肿瘤均有作用，属周期非特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。

主要适用于急性白血病，对急性淋巴细胞白血病及粒细胞白血病均有效，一般作为第二线药物，即在首选药物耐药时可考虑应用此药。

对于恶性淋巴瘤，可作为交替使用的首选药物。

其对乳腺癌、肉瘤、肺癌、膀胱癌等其他各种癌症都有一定疗效，多与其他抗癌药联合使用。

[0012]但是，阿霉素在直接注射使用时，由于随血液全身弥散分布，对机体可产生广泛的生物化学效应，具有强烈的细胞毒性作用。

主要的毒性反应有，白细胞和血小板减少，约60％～80％的病人可发生；100％的病人有不同程度的毛发脱落，停药后可以恢复生长；心脏毒性，表现为心律失常，ST-T改变，多出现在停药后的1～6个月；恶心、食欲减退；药物溢出血管外可引起组织溃疡及坏死。

另外，用药后尿液可出现红色。

[0013]因此，本领域依然存在对铁蛋白高效装载药物如阿霉素的方法及相应产物的需求。

发明内容
[0014]本发明的第一方面涉及一种铁蛋白包载药物的方法，其包括步骤：
[0015]1)将铁蛋白在一定温度下在含有一定浓度的变性剂和待包载药物的溶液中解聚一定时间，
[0016]2)通过去除溶液中的变性剂使铁蛋白复聚并包载药物，
[0017]3)任选地，去除溶液中残余的变性剂和药物，
[0018]4)任选地，干燥上述溶液获得包载了药物的铁蛋白固体，
[0019]其中变性剂是可以削弱或打破铁蛋白亚基间氢键相互作用，从而使铁蛋白发生解聚的物质，优选的，变性剂是指阴离子型表面活性剂或盐酸胍或脲，优选地，阴离子型表面活性剂选自SDS、硬脂酸和/或十二烷基苯磺酸钠；其中一定浓度在阴离子型表面活性剂的情况下是指重量比约1％～10％，在盐酸胍的情况下是指4M～8M，在脲的情况下是指3～10M；一定时间在阴离子型表面活性剂的情况下是指10～120min，在盐酸胍的情况下是指30min～300min，在脲的情况下是指10～1200min；一定温度在阴离子型表面活性剂的情况下是指30℃～100℃，在盐酸胍的情况下是指25℃～70℃，在脲的情况下是指15℃～75℃。

[0020]在一些实施方案中，铁蛋白选自可以形成笼状结构的天然铁蛋白或重组铁蛋白及其变体，优选地，铁蛋白是全人铁蛋白，更优选地，铁蛋白是全人重链铁蛋白。

[0021]在一些实施方案中，变性剂选自SDS或盐酸胍。

[0022]在一些实施方案中，药物选自抗肿瘤药物或非抗肿瘤药物，优选地，抗肿瘤药物选自肿瘤抗生素、天然来源类抗肿瘤药、金属化合物、放射性同位素、烷化剂、抗代谢类抗肿瘤药，激素类抗肿瘤药，优选地，药物选自肿瘤抗生素、天然来源类抗肿瘤药、放射性同位素或烷化剂，更优选地，药物选自肿瘤抗生素，更优选地，药物选自阿霉素、道诺霉素、胆碱、姜黄素、尼莫司汀、卡莫司汀、洛莫司汀、环磷酰胺、异环磷酰胺、甘磷酰芥、氟铁龙、多西氟鸟啶、5-氟尿嘧啶、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氟鸟苷、替加氟、吉西他滨、卡莫氟、羟基脲、甲氨蝶呤、优福定、安西他滨、放线菌素D、柔红霉素、表柔比星、丝裂霉素、培洛霉素、平阳霉素、吡柔比星、伊立替康、三尖杉酯碱、羟基喜树碱、长春瑞滨、紫杉醇、泰索帝、拓扑替康、长春新碱、长春地辛、长春酰胺、长春碱、替尼泊苷、依托泊苷、阿他美坦、阿那曲唑、氨鲁米特、来曲唑、福美坦、甲他孕酮、他莫昔芬、卡铂、顺铂、达卡巴嗪、奥沙利铂、乐沙定、可铂奥沙、米托蒽醌，更优选地，药物选自阿霉素、道诺霉素、胆碱、顺铂、姜黄素、放射性同位素；和/或，优选地，非抗肿瘤药物选自放射性药物、神经递质类药物、多巴胺受体激动剂、神经中枢抗胆碱药、胆碱受体激动剂类药物、γ分泌酶抑制剂、抗氧剂或麻醉剂，更优选地，放射性药物选自64Cu、235U，神经递质类药物选自碳酰胆碱、阿托品、东莨菪碱、多巴胺及其衍生物，多巴胺受体激动剂选自溴隐亭、培高利特、阿扑吗啡等麦角碱类衍生物及非麦角碱类衍生物，神经中枢抗胆碱药选自苯海索、苯扎托品及丙环定，胆碱受体激动剂类药物选自毒蕈碱、毛果芸香碱，γ分泌酶抑制剂选自双氟酮类，抗氧剂选自褪黑激素，麻醉剂选自蒽胺。

[0023]在一些实施方案中，去除溶液中的变性剂采用脱盐方式进行，优选地，采用脱盐柱进行。

[0024]在一些实施方案中，使用阴离子型表面活性剂的情况下铁蛋白包载药物的质量比为5％-60％，优选地，至少8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或更高，更优选地，至少20％、25％、30％或35％；使用盐酸胍变性剂的情况下铁蛋白包载的药物的量5％-60％，优选地，至少8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或更高，更优选地，至少20％、25％、30％或35％；使用脲变性剂的情况下铁蛋白包载的药物的量5％-60％，优选地，至少8％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％或更高，更优选地，至少20％、25％、30％或35％。

[0025]在一些实施方案中，溶液中铁蛋白含量范围为0.1～100mg/ml，优选地，0.2～10mg/ml，更优选地，0.3～5mg/ml，更优选地，0.5～2mg/ml，更优选地，0.7～1.4mg/ml；和/或，待包载药物的含量范围0.1～50mg/ml，优选地，0.2～10mg/ml，更优选地，0.3～5mg/ml，更优选地，0.5～2mg/ml，更优选地，0.7～1.4mg/ml。

[0026]在一些实施方案中，一定浓度在阴离子型表面活性剂的情况下是指重量比约5％～10％，在盐酸胍的情况下是指6M～8M，在盐酸胍的情况下是指5～8M；一定时间在阴离子型表面活性剂的情况下是指10～30min，在盐酸胍的情况下是指30min～120min，在脲的情况下是指20～200min；一定温度在阴离子型表面活性剂的情况下是指65℃～75℃，在盐酸胍的情况下是指40℃～60℃，在脲的情况下是指20℃～50℃。

[0027]在一些实施方案中，一定浓度在阴离子型表面活性剂的情况下是指重量比约6.5％～8％，在盐酸胍的情况下是指6.5M～7.5M，在盐酸胍的情况下是指5.5～6.5M；一定时间在阴离子型表面活性剂的情况下是指10～20min，在盐酸胍的情况下是指50min～
72min，在盐酸胍的情况下是指25～100min；一定温度在阴离子型表面活性剂的情况下是指68℃～72℃，在盐酸胍的情况下是指45℃～55℃，在盐酸胍的情况下是指22℃～35℃。

[0028]在一些实施方案中，溶液中含有促进药物的溶解和/或铁蛋白的聚集的添加剂，优选地，所述添加剂选自DMA、DMF、DMSO或其混合物。

[0029]在一些实施方案中，溶液中铁蛋白与包载药物的质量比例为5:1～1:5。

[0030]在一些实施方案中，溶液的缓冲体系为Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液(PBS)、碳酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或柠檬酸盐缓冲液，缓冲液的pH介于3～10，缓冲液的浓度介于20～500mM。

[0031]本发明的第二方面涉及如上述第一方面所述的铁蛋白包载药物的方法获得的包载药物的铁蛋白。

[0032]利用本发明的铁蛋白包载药物的方法可以使药物包载量大幅度提高，进而在达到相同治疗效果的前提下，临床给药剂量将会大大减少。

附图说明
[0033]图1. 2％SDS、100℃、10min处理后，HFn 100％解聚后的层析出峰位置(流动相含1％SDS)。

[0034]图2. 1％SDS、30℃、80min处理后，HFn未解聚的层析出峰位置(流动相含1％SDS)。

[0035]图3. 1％SDS、70℃、15min处理后，HFn 30％解聚的层析出峰位置(流动相含1％SDS)。

[0036]图4. 2％SDS、100℃、10min处理条件后，HFn 100％解聚后的层析出峰位置(流动相含2％SDS)。

[0037]图5. 2％SDS、30℃、120min处理后，HFn未解聚的层析出峰位置(流动相含2％SDS)。

[0038]图6. 2％SDS、70℃、30min处理后，HFn 30％解聚的层析出峰位置(流动相含2％SDS)。

[0039]图7. 2％SDS、100℃、10min处理条件后，HFn 100％解聚后的层析出峰位置(流动相含5％SDS)。

[0040]图8. 5％SDS、30℃、120min处理后，HFn 60％解聚的层析出峰位置(流动相含5％SDS)。

[0041]图9. 5％SDS、70℃、15min处理后，HFn 80％解聚的层析出峰位置(流动相含5％SDS)。

[0042]图10. 2％SDS、100℃、10min处理条件后，HFn 100％解聚后的层析出峰位置(流动相含7.5％SDS)。

[0043]图11. 7.5％SDS、50℃、30min处理后，HFn 80％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5％SDS)。

[0044]图12. 7.5％SDS、70℃、30min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5％SDS)。

[0045]图13. 2％SDS、100℃、10min处理条件后，HFn 100％解聚后的层析出峰位置(流动相含10％SDS)。

[0046]图14. 10％SDS、30℃、30min处理后，HFn 80％解聚的层析出峰位置(流动相含10％SDS)。

[0047]图15. 10％SDS、70℃、15min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相含10％SDS)。

[0048]图16.去除SDS后复聚的HFn层析出峰位置(流动相为20mM PB)。

[0049]图17.天然状态HFn层析出峰位置(流动相为20mM PB)。

[0050]图18. 4M盐酸胍、25℃、60min处理后，HFn未解聚的层析出峰位置(流动相含4M盐酸胍)。

[0051]图19. 4M盐酸胍、25℃、90min处理后，HFn未解聚的层析出峰位置(流动相含4M盐酸胍)。

[0052]图20. 4M盐酸胍、25℃、120min处理后，HFn未解聚的层析出峰位置(流动相含4M盐酸胍)。

[0053]图21. 5.5M盐酸胍、25℃、60min处理后，HFn 14.2％解聚的层析出峰位置(流动相含5.5M盐酸胍)。

[0054]图22. 5.5M盐酸胍、25℃、90min处理后，HFn 17.2％解聚的层析出峰位置(流动相含5.5M盐酸胍)。

[0055]图23. 5.5M盐酸胍、25℃、120min处理后，HFn 18.7％解聚的层析出峰位置(流动相含5.5M盐酸胍)。

[0056]图24. 6M盐酸胍、25℃、60min处理后，HFn 24.6％解聚的层析出峰位置(流动相含6M盐酸胍)。

[0057]图25. 6M盐酸胍、25℃、90min处理后，HFn 33.8％解聚的层析出峰位置(流动相含6M盐酸胍)。

[0058]图26. 6M盐酸胍、25℃、120min处理后，HFn 34.3％解聚的层析出峰位置(流动相含6M盐酸胍)。

[0059]图27. 6.5M盐酸胍、25℃、60min处理后，HFn 38.1％解聚的层析出峰位置(流动相含6.5M盐酸胍)。

[0060]图28. 6.5M盐酸胍、25℃、90min处理后，HFn 40.4％解聚的层析出峰位置(流动相含6.5M盐酸胍)。

[0061]图29. 6.5M盐酸胍、25℃、120min处理后，HFn 42.4％解聚的层析出峰位置(流动相含6.5M盐酸胍)。

[0062]图30. 7M盐酸胍、25℃、60min处理后，HFn 53.2％解聚的层析出峰位置(流动相含7M盐酸胍)。

[0063]图31. 7M盐酸胍、25℃、90min处理后，HFn 57.9％解聚的层析出峰位置(流动相含7M盐酸胍)。

[0064]图32. 7M盐酸胍、25℃、120min处理后，HFn 60.9％解聚的层析出峰位置(流动相含7M盐酸胍)。

[0065]图33. 7M盐酸胍、25℃、150min处理后，HFn 63.7％解聚的层析出峰位置(流动相含7M盐酸胍)。

[0066]图34. 7M盐酸胍、25℃、180min处理后，HFn 65.8％解聚的层析出峰位置(流动相
含7M盐酸胍)。

[0067]图35. 7M盐酸胍、25℃、210min处理后，HFn 67.9％解聚的层析出峰位置(流动相含7M盐酸胍)。

[0068]图36. 7.5M盐酸胍、25℃、60min处理后，HFn 66％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。

[0069]图37. 7.5M盐酸胍、25℃、90min处理后，HFn 74.7％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。

[0070]图38. 7.5M盐酸胍、25℃、120min处理后，HFn 79.8％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。

[0071]图39. 7.5M盐酸胍、25℃、150min处理后，HFn 86.1％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。

[0072]图40. 7.5M盐酸胍、25℃、180min处理后，HFn 88.9％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。

[0073]图41. 7.5M盐酸胍、25℃、210min处理后，HFn 95.8％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。

[0074]图42. 7.5M盐酸胍、25℃、240min处理后，HFn 96.6％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。

[0075]图43. 7.5M盐酸胍、25℃、270min处理后，HFn 97.4％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。

[0076]图44. 7.5M盐酸胍、25℃、300min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。

[0077]图45. 7.5M盐酸胍、25℃、330min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。

[0078]图46. 7.5M盐酸胍、25℃、360min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。

[0079]图47. 8M盐酸胍、25℃、60min处理后，HFn 93.9％解聚的层析出峰位置(流动相含8M盐酸胍)。

[0080]图48. 8M盐酸胍、25℃、90min处理后，HFn 98.1％解聚的层析出峰位置(流动相含8M盐酸胍)。

[0081]图49. 8M盐酸胍、25℃、120min处理后，HFn 98.6％解聚的层析出峰位置(流动相含8M盐酸胍)。

[0082]图50. 8M盐酸胍、25℃、150min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相含8M盐酸胍)。

[0083]图51. 4M盐酸胍、70℃、30min处理后，HFn 39.5％解聚的层析出峰位置(流动相含4M盐酸胍)。

[0084]图52. 4M盐酸胍、70℃、60min处理后，HFn 53.3％解聚的层析出峰位置(流动相含4M盐酸胍)。

[0085]图53. 4M盐酸胍、70℃、120min处理后，HFn 82.6％解聚的层析出峰位置(流动相含4M盐酸胍)。

[0086]图54. 4M盐酸胍、70℃、180min处理后，HFn 91.8％解聚的层析出峰位置(流动相含4M盐酸胍)。

[0087]图55. 5M盐酸胍、70℃、30min处理后，HFn 64.1％解聚的层析出峰位置(流动相含5M盐酸胍)。

[0088]图56. 5M盐酸胍、70℃、60min处理后，HFn 92.7％解聚的层析出峰位置(流动相含5M盐酸胍)。

[0089]图57. 5M盐酸胍、70℃、120min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相含5M盐酸胍)。

[0090]图58. 6M盐酸胍、37℃、120min处理后，HFn 41.5％解聚的层析出峰位置(流动相含6M盐酸胍)。

[0091]图59. 6M盐酸胍、50℃、30min处理后，HFn 33.45％解聚的层析出峰位置(流动相含6M盐酸胍)。

[0092]图60. 6M盐酸胍、50℃、60min处理后，HFn 44.6％解聚的层析出峰位置(流动相含6M盐酸胍)。

[0093]图61. 6M盐酸胍、50℃、120min处理后，HFn 61.2％解聚的层析出峰位置(流动相含6M盐酸胍)。

[0094]图62. 6M盐酸胍、50℃、180min处理后，HFn 67.8％解聚的层析出峰位置(流动相含6M盐酸胍)。

[0095]图63. 6M盐酸胍、70℃、10min处理后，HFn 76.6％解聚的层析出峰位置(流动相含6M盐酸胍)。

[0096]图64. 6M盐酸胍、70℃、30min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相含6M盐酸胍)。

[0097]图65. 6M盐酸胍、70℃、60min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相含6M盐酸胍)。

[0098]图66. 7M盐酸胍、37℃、60min处理后，HFn 67.8％解聚的层析出峰位置(流动相含7M盐酸胍)。

[0099]图67. 7M盐酸胍、37℃、90min处理后，HFn 71.3％解聚的层析出峰位置(流动相含7M盐酸胍)。

[0100]图68. 7M盐酸胍、37℃、120min处理后，HFn 75.4％解聚的层析出峰位置(流动相含7M盐酸胍)。

[0101]图69. 7M盐酸胍、37℃、150min处理后，HFn 78.1％解聚的层析出峰位置(流动相含7M盐酸胍)。

[0102]图70. 7M盐酸胍、37℃、180min处理后，HFn 72.3％解聚的层析出峰位置(流动相含7M盐酸胍)。

[0103]图71. 7M盐酸胍、50℃、60min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相含7M盐酸胍)。

[0104]图72. 7.5M盐酸胍、37℃、60min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。

[0105]图73. 7.5M盐酸胍、37℃、90min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相
含7.5M盐酸胍)。

[0106]图74. 7.5M盐酸胍、37℃、120min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。

[0107]图75. 7.5M盐酸胍、37℃、150min处理后，HFn 100％解聚的层析出峰位置(流动相含7.5M盐酸胍)。

[0108]图76.天然状态HFn层析出峰位置(流动相为50mM Tris)。

[0109]图77.去除盐酸胍后复聚的HFn层析出峰位置(流动相为50mM Tris)。

具体实施方式
[0110]定义
[0111]本发明的铁蛋白是指可以形成笼状结构的任何铁蛋白，其可以是天然来源的铁蛋白，也可以是重组表达的铁蛋白，或其突变体，其可以来源于原核生物、原生生物、真菌、植物或动物，例如来源于细菌、真菌、昆虫、爬行动物、禽类、两栖动物、鱼类、哺乳动物，例如来源于啮齿类动物、反刍动物、非人灵长类动物或人类，例如小鼠、大鼠、豚鼠、犬类、猫、牛、马、羊、猴、大猩猩、人。

从细菌到人类，尽管不同生物的铁蛋白氨基酸序列具有极大的差别，但其结构相似，均可以形成蛋白壳结构。

在一些实施方案中，本发明的铁蛋白是人铁蛋白，在一些实施方案中，本发明的铁蛋白是基因工程全人重链铁蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在另一些实施方式中，本发明的铁蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2或3所示。

[0112]本发明的变性剂是指使铁蛋白发生解聚作用的物质，为盐酸胍或者以SDS为代表的阴离子型表面活性剂，或者脲。

[0113]阴离子型表面活性剂为既含有亲水基团又含有疏水基团的两亲性分子，并可在溶液状态下解离出阴离子，包括例如SDS、硬脂酸、十二烷基苯磺酸钠等。

[0114]本发明的解聚是指铁蛋白天然24聚体的紧密闭合球状结构被打开，直观表现为凝胶排阻柱上的出峰时间被显著延迟，从而解聚蛋白峰与未解聚蛋白峰发生分离。

在本发明中解聚比例为至少50％，例如至少55％、60％、65％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％，最高可达到100％。

[0115]复聚是指在引起解聚的物质被去除或降低到足够低浓度后，发生解聚的铁蛋白又恢复到天然24聚体的紧密闭合球状结构，直观表现为凝胶排阻柱上的出峰时间减少至与天然铁蛋白相近的出峰时间。

在本发明中，复聚比例为至少50％，例如55％、60％、65％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％，最高可达100％。

[0116]本发明的药物或包载药物是指可以包载在铁蛋白中的任何药物，只要所述药物的分子尺寸小于8纳米。

在一些实施方案中，本发明的药物或包载药物选自肿瘤抗生素、天然来源类抗肿瘤药、金属化合物、放射性同位素、烷化剂、抗代谢类抗肿瘤药，激素类抗肿瘤药物质。

其中抗生素类抗肿瘤药选自阿霉素(盐酸多柔比星)，盐酸佐柔比星，戊柔比星，硫酸博莱霉素，丝裂霉素，盐酸表柔比星，盐酸依达比星，放线菌素D，光辉霉素，柔红霉素，吡柔比星，表阿霉素，依达比星，阿克拉霉素，博来霉素A5，色霉素A3，盐酸博来霉素，棕霉素，盐酸平阳霉素，柔红霉素，盐酸阿柔比星，含氮霉素，匹来霉素，盐酸吡柔比星，放线菌素C；天然来源类抗肿瘤药选自盐酸拓扑替康，10-羟基喜树碱，7-乙基-10-羟基喜树碱，10-羟基喜树碱，鲁比特康，白藜芦醇，喜树碱，紫杉醇，秋水仙素，依托泊甙，多西他赛，硫酸长春碱，斑。