1.促肾上腺皮质激素释放激素对海...

◆用１ｍｌ注射器抽打１０次，１５～３０。

ｃ水浴孵育５ｍｉｎ，加Ｏ．２ｍｌ三氯甲烷，用力振荡１５ｓｅｃ，１５ｑｏｏｃ水浴静置３ｍｉＩｌ；
◆４。

ｃ１２０００９离心１５ｍｉｎ；
◆离心后液体分为上中下三层，仔细将上层上清移入另一１．５ｍｌ离心管中（注意勿混杂中间层），加与上清等体积的异丙醇；
◆轻轻颠倒离心管混匀，１５４０。

ｃ水浴孵育１０ｍｈ，４０ｃ１２０００９离心１５ｍｉｎ；
◆离心后可见离心管底部的白色ＲＮＡ块，弃去上清，加ｌｍｌＤＥＰｃ水配制的７５％乙醇，颠倒离心管３～５次清洗Ｉ蝌Ａ块，４。

ｃ７５００９离心５ｍｉｎ；
◆弃去上清，重复清洗一次；
◆弃去上清，空气干燥５ｍｉｎ至白色ＲＮＡ块转为透明，加入ｌＯ～１５ｕ１去鼢ｎ酶水溶解眦～；
◆采用紫外分光光度法测定融妊．浓度，根据ＲＮＡ样品在波长２６０ｎｍ和２８０ｍ的紫外吸收值的比值（ｏＤ２６加Ｄ２８０）判断ＲＮＡ样品的纯度，比值在１８～２．ｏ视为鼢ＪＡ纯度优良。

２．引物设计
从ＧｃｎｅＢⅫｋ中检索大鼠Ｄ＿ａｃｔｉｎ、ｃ啪ｔｌ、ｃＲ腿２、ＧＲ、ｓＧＫ基因序列号分别为ＮＭ—０３１１４４、ＮＭ一０３０９９９、ＮＭ—０２２７１４、ＮＭ—０１２５７６、ＮＭ＿０１９２３２，应用ＰｍｅｒＰｒｅＩⅡｉｅｒ５。

０软件设计引物。

（１）ｐ—ａｃｔｉｎ引物序列
上游：５’．ＡＴＧＧＴＧＧＧＴＡＴＧＧＧＴＣＡＧＡＡＧＧ．３’
下游：５’．ＴＧＧｃＴＧＧＧＧＴＧＴＴＧＡＡＧＧＴｃ－３’
用该引物进行ｐｃＲ扩增得到２６５ｂｐ的特异性产物条带，与理论值相符（图１）。

６００
３００
２００２６５ｂｐ
１００
图ｌ大鼠Ｂ－ａｏｔｉｎＰｃＲ产物的琼脂糖凝胶电泳图
Ｆｉ９１．Ｅ１ｅｃ廿０ｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆｐ－ａｃ廿ｎｐｃＲｐｒｏｄｕｃｔ
１７
（２）ｃⅪＩＲｌ引物序列
上游：５’．ｃｃＧｃＴＡｃＡＡｃＡｃＧＡｃＡＡＡｃＡ－３’
下游：５’．ＡＧＧＡＴＧＡＡＡＧｃｃＧＡＧＡ：ｒＧＡＧ－３’
用该引物进行ＰｃＲ扩增得到２６７ｂｐ的特异性产物条带，与理论值相符（图２）。

６００
３００
２ＢＴｂ口
２００
图２．ｃＲ王ｍ１ＰＣＲ产物的琼脂糖凝胶电泳图
Ｆｉ９２Ｅｌｃｃ灯ｏｐｈｏｒｃｓｉｓ
ｏｆｃ啪ｕＰｃＲ
ｐｒｏｄｕｏｔ
Ｏ）ｃ妞Ｒ２引物序列
上游：５’一ＣＣｃＴＧｃＣｃＴＡＴｃＡｒＴＧＴｃＧ－３’
下游：５’．ＧｃｃＴＴｃＡｃＴＧｃｃＴＴｃｃＴＧ’ｒ－３’
用该引物进行ＰｃＲ扩增得到２３０ｂｐ的特异性产物条带，与理论值相符（图３）。

２００
２３∞ｐ
图３．ｃＲＨＲ２ＰｃＲ产物的琼脂糖凝胶电泳图
Ｆｉ９３．Ｅｌｅｃ¨ｐｈｏｒｅｓｉｓｏｆｃＲ王报２ＰｃＲｐｍｄｕ。

ｔ
（４）ＧＲ引物序列
上游：５’．ＡＧＡＧｃＡＧＴＧＧＡＡＧＧＡｃＡＧｃＡ－３’
下游：５’－ＡｃｃＴｃｃＡＧｃＡＧＴＧＡｃＡｃｃＡＡ一３’
用该引物进行ＰｃＲ扩增得到２２７ｂｐ的特异性产物条带，与理论值相符（图４）。

一１８—
６００
３００
２２７ｂＤ
１００
图４ＧＲＰｃＲ产物的琼脂糖凝肢电泳图
Ｆｉ９４．Ｅｌｅｏ扛ｏｐｈｏｒｅｇｉｇｏｆＧＲＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔ
（ｓ）ｓＧＫ引物序列
上游：５’．ＴＴＧＡＧＡＧＧＧＡｃＴＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴ－３’
下游：５’．ＣＣＡＧＡＡＴＧＡＧＧＧＧＡＡＴＧＧＴＡＧＣ－３’
用该引物进行ＰｃＲ扩增得到１９０ｂｐ的特异性产物条带，与理论值相符（图５）。

３．Ｒｒ－ＰＣＲ
图５．ｓＧＫＰｃＲ产物的琼脂糖凝胶电泳图
Ｆｉ９５．Ｅｋｍｐｈｏｒｅｓｉｓ０ｆＳＧＫＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔ
（１）ｃＤＮＡ第一链的合成
取上述抽提的总ｍｑＡ为模板，按以下体系进行Ｒ＝ｒ反应，总体积为２５ｐ１
ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１８（１ｐｇ／肛１）总ＲＮＡ７０。

ｃ５ｍｍ，立即冰浴５ｍｉｒＩ，加入
５×扩增缓冲液１０ｍＭｄＮＴＰｓｌｕｌ
２ｐｇ
５ｕｌ
１．２５ｕｌ
ＲＮＡｈｌｈｉｂｉｔｏｒ（４０Ｕ／ｐ１）Ｏ．６２５ｐｌ
一１９—
图６．ＧＲ引物温度梯度ＰｃＲ扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图
Ｆｉ９６．Ｅｌｅｃ仃叩ｈ甜ｃｇｉｓ０ｆＧＲｇｒａｄｉｅｎｔｔｅｍｐｅ伯ｔｕｒｃＰＣＲｐｒｏ“ｃｔｇ
（２）最适引物浓度
因Ｒ１二ＰｃＲ实验显示，各对引物间不互补、无错配、Ｔｍ值接近且范围在５６。

ｃ～５８。

ｃ
间、长度一致且范围在２０～２３个碱基之问，ＰｃＲ产物经电泳鉴定，条带特异性好。

因此，在Ｒｃａｌ＿ｔｉｍｅＰｃＲ方法选择最适引物浓度时，不再进行上游和下游引物之间不同浓度的矩阵分析实验，而在上游和下游引物浓度一致的情况下，对不同浓度引物与浓度逐渐递增ｏＤＮＡ进行组合匹配，在Ｒｅａｌ．ｔｉｍｅＰｃＲ的结果分析中，当ＰｃＲ产物随ｏＤＮＡ量的增加而明显呈线性增加时，选择这个反应体系所使用的引物浓度为最适引物浓度。

将ｃＤＮＡ稀释５倍后，１：５倍比稀释，共４个梯度，每个ＰｃＲ管中加入ｃＤＮＡｌ０ｍ，
每个梯度４管。

引物终浓度选择ｏ０５州、ｏ．１心Ｉ、Ｏ．２州、Ｏ．４心Ｉ四种浓度，相同浓度引物分别组合不同浓度梯度的国ＮＡ，组成引物浓度与ｃＤＮＡ浓度的矩阵（图７，图８）。

以ｓＧＫ选择最适引物浓度的实验为例：
ｄｄＨ２０补足至总体积２５ｍ
１０×ＰｃＲ扩增缓冲液２．５ｍ
２５ｍＭＭｇｃｌ２１．５ｍ
ｌＯｍＭｄＮ’ｎ）ｓＯ．５ｕｌ
ｃＤＮＡ不同浓度
ｓＧＫ引物不同浓度
１０×Ｓｙｂｒ＿Ｇ１．ｅｅｎＯ．１５ｐｌ
Ｔａｑ酶（５ｕ／ｕ１）ｌ¨ｌ９５。

ｃ热启动２ｍｉｎ，
一２１．
第二军医大学硕士学位论文第一部分一材料与方法９５０ｃ３０ｓｅｃ，５９。

ｃ２５秒，７２。

ｃ３０秒，４０个循环
图７．不同浓度ＳＧＫ引物矩阵分析的ＰｃＲ扩增曲线
Ｆｉ９７．ＲａｗｄａｌａＯｆＰｃＲ锄ｐｌｉｎｃａｔｉｏｎｗｉｃｈｖａｒｉｏｕｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆＳＧＫｐｒｉｍｅｒ
图８．不同浓度ｓＧＫ引物矩阵分析的ＰｃＲ产物溶解曲线
Ｆｉ９８．ＭｅｌｔｉｎｇｃｕｒｖｅｏｆＰｃＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｗｉｌｈｖ撕ｏｕｓｃｏｎｃｅｎ觚ｄｏｎｓｏｆｓＧＫｐｍｌｅｒ将同一引物浓度ＰｃＲ样本的起跳循环数值（ｃｔ值），与不同ｃＤＮＡ浓度的ＬＯＧ值做散点图。

融解曲线显示，引物浓度为０．０５¨Ｍ时，ＰＣＲ产物溶解曲线呈双峰，可能含有引物二聚体；引物浓度为０．１Ⅲ、ｏ．２州、Ｏ．４斗Ｍ时，ＰｃＲ产物溶解曲线呈单峰，且峰值高于８５。

ｃ（图８）。

其中当引物浓度为Ｏ．２ｕＭ时，ＰＣＲ标准曲线相关系数为Ｏ．９９８２５，产物呈明显的线性增加，而引物浓度为Ｏ．１¨Ｍ和Ｏ．４“Ｍ的反应体系中，ｐｃＲ标准曲线相关系数分别为Ｏ．９６７２５和Ｏ．９７１３６，ＰｃＲ产物不呈明显线性增加。

因此选择引物浓度Ｏ．２ｕＭ为ｓＧＫＲｅａｌ－ｔｉｍｅＰＣＲ体系的最适引物浓度（图９）。

Ａ
．２２－
第二军医大学硕士学位论文第一部分一材料与方法９５０ｃ热启动２ｍｉｎ，
９５。

Ｃ３０ｓｅｃ，５９０Ｃ２５秒，７２。

Ｃ３０秒，４０个循环
图１０．不同Ｍ９２＋浓度矩阵分析的ＳＧＫＰＣＲ扩增曲线
ｄｉ魁ｒｅｎｔＭ孑＋ｃｏｎｃｅｎ仃ａｔｉｏｎｓＦｉ９１０．ＲａｗｄａｔａｏｆｓＧＫＰｃＲａＩｎｐｌｉｎｃａｔｉｏｎｗｉｔｈ
图１１．不同Ｍｇ”浓度矩阵分析的ｓＧＫＰｃＲ产物溶解曲线
Ｆｉ９１１．ＭｅｌｔｉｎｇｃｕｒｖｅｏｆｓＧＫＰｃＲａｍｐｌ讯ｃａｎｏｎｐｒｏｄｕｃｔｓｗｉｔｈｄｉｆｒｅｒｅｎｔＭ旷。

ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
将同一Ｍ矛＋浓度ＰｃＲ样本的ｃｔ值，与不同ｃＤＮＡ浓度的ＬｏＧ值做散点图。

融解
曲线显示，Ｍ譬２＋浓度为２ｍＭ和２．５ｍＭ时，ＰｃＲ产物溶解曲线呈双峰，可能含有引物：聚体；Ｍ９２＋浓度为１ⅡｌＭ和１．５ｍＭ时，ＰｃＲ产物融解曲线呈单峰，且峰值高于８５。

ｃ（图１１）。

其中Ｍｆ＋浓度为１ｍＭ时，ＰｃＲ标准曲线相关系数为ｏ．９９９７６，Ｍ９２＋浓度为１．５ｎ１Ｍ时，ＰｃＲ标准曲线相关系数为ｏ．９７５８９，因此选择Ｍ矛＋浓度１ｍＭ为ｓＧＫＲｅａｌ一ｔｉｍｅＰｃＲ体系的最适Ｍｆ＋浓度（图１２）。

Ａ
．２４—
第一军医大学硕士学位论文第一部分一材料与方法Ｂ
图１２．不同Ｍ一＋浓度矩阵分析的ｓＧＫＰｃＲ标准曲线
Ａ：１ｍＭＭ孑＋浓度；Ｂ：１．５ｍＭＭ９２＋浓度。

Ｆｉｇｌ２．ｓ诅ｎｄａｒｄｃｕⅣｃｏｆｓＧＫＰｃＲ砌ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｗｉｔｌｌｄｉ脏ｒｅｎｔＭ∥＋ｃｏｎｃｅｎ恻ｉｏｎｓ
用同样方法优化出ｐ－ａｃｔｉｎ的最适Ｍｆ＋浓度为１．５ｍＭ。

（４）ＲｅａＩ－ｔｉｍｅＰｃＲ定量分析
采用浓度逐渐递增的ｃＤＮＡ，作为相对已知浓度的模板，在Ｒｅａｌ—ｔｉｍｅＰｃＲ中分别作为ｐ—ａｃｔｉｎ和ＳＧＫ的标准品，同时扩增样本，应用Ｒｏｔｏｒ－ｇｅｎｅ６．Ｏ软件绘制标准曲线，以该标准曲线相对定量样本ｃＤＮＡ浓度，用Ｂ．ａｃｔｉｎ与ｓＧＫ相对ｃＤＮＡ浓度比值反映ｓＧＫｍＲＮＡ的表达量（图１３）。

ＡＱｕａｎｔｉ僦ｉｏｎｄ也ｆｏｒｃｙｃｌｆｎｇＡ·ＦＡＭ，ｓｙｂｒＭｅｎｄａｔａｆｏｒＭｅｌｔＡＦＡ删ｓｙｂｒ
ｓ协ｄａｒｄｃ㈣
ＢＱⅡａｎｔ｝ｔａｔ㈨ｄ咖ｆｏｒｑｃｌｉｎｇＡＦＡＭ／ｓｙｂｒＭｅｈｄｎａｆｏｒＭｅｌｔ
ＡＦＡＭ／ｓｙｂｒ
图１３．Ｉｋａｌ一ｔｉｍｅＰｃＲ定量分析不同试剂影响下Ｂ－ａｃｔｉｎ和ｓＧＫｒＩｌＩｕｑＡ的变化
Ａ：Ｂ－ａｃｎｎ，Ｂ：ＳＧＫ。

Ｆｉｇｌ３．Ｒｅａｌ＿ｔｉｍｅＰｃＲＡｎａｌｙｓｌｓｏｆｓ０Ｋａｎｄｐ－ａｃｂｎｍＲＮＡｉｎｔｈｅｐｒｅｓｅｎｃｅｏｆｄｉⅡ醯ｅｎｔｃｈｅｍｉｃａｌｓ（四）免疫荧光细胞化学
聚用改良的ＡＢｃ免疫酶染色法，按照说明书流程操作：
－２５—
第二军医大学硕士学位论文第一部分一实验结果
实验结果
一、原代培养的大鼠海马神经元
新生大鼠海马神经元经消化分离成单个细胞，均匀接种在培养板上，有的呈圆形，有的呈椭圆形，有的细胞可见突起存在。

培养２￣３小时细胞开始贴壁，１２ｈ后大部分细胞贴壁，少数细胞长出突起，２４ｈ后细胞突起约为１０～５０ｕｍ，３天后突起形成稀疏网络。

培养至第８天的神经元突起互相形成密集网状，多数细胞呈锥体形或多极形，胞体有明显的折光性，立体感强，部分细胞可见细胞核呈空泡状，核仁明显（图１４）。

对培养至第８天的海马神经元进行ＮｓＥ、ＭＡＰ２、ＧＦＡＰ免疫荧光细胞化学染色，结果显示９５％细胞呈ＮｓＥ、ＭＡＰ２免疫原性细胞，而仅少数细胞呈ＧＦＡＰ免疫原性细胞（图１５），提示本研究中原代培养的海马神经元纯度可达９５％左右。

图１４原代培养第８天的大鼠海马神经元
Ｆｉ９１４Ｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｏｆｐｄｍａｒｙｃｕｈｕ佗ｄｒａｔｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｎｃｕｔｏｎｓｏｎ８出ｄａｙ
Ｍ８９ｎｉｆｉｃａｔｉｏｎＡ×１００，Ｂ×２００．
图１５．原代培养的海马神经元鉴定
Ｆ遮１５．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｐｒｉｍａｒｙｃｍｔｕｒｅｄｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｎｅｕｒｏｎｓ
二、原代培养大鼠海马神经元中ｃＲＨ受体及Ｇｃ受体的表达
用原代培养的海马神经７Ｅ研究ＣＲＨ和Ｇｃ是否调节ｓＧＫ，其分子基础是在培养的海马神经元有ＣＲＨ受体和Ｇｃ受体的表达。

以往原位杂交［１９Ｊ及ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ口０１的结果表明，大鼠海马细胞表达ｃＲＨ两种类型的受体以及Ｇｃ受体。

我们用Ｒ１：ＰｃＲ方法证实本实验中采用的原代细胞培养的方法所得到的海马神经元中是否表达ＣＲＨＲｌ、ｃＲＨＲ２和ＧＲ，电泳结果显示，ｃＲＨＲｌ、ｃ砌｛Ｒ２和ＧＲ的ＰｃＲ扩增产物分别为２６７ｂｐ、２３０ｂｐ和２２７ｂｐ的特异性条帝（图１６），与理论值相符，说明在培养至第８天的原代培养大鼠海马神经元中，ｃＲＨ受体ｃＲＨＲｌ、ｃＲＨＲ２和Ｇｃ受体ＧＲ的ｍＲＮＡ均有表达。

Ｍ１２３Ｍ１２３Ｍ３
ＡＢＣ
６００
３００
１００６００２６７ｂＤ３００１００６００
３００２３０ｂＤ１００
图１６．ｃＲＨＲｌ、ｃＲＨＲ２和ＧＲ的ＰｃＲ扩增产物电泳图。

Ａ：ｃＲＨＲｌ；Ｂ：ＣＲＨＲ２；ｃ：ＧＲ。

Ｍ
第二军医大学硕上学位论文第一部分一实验结果五、ｃＲＨ对海马神经元ｓＧＫ蛋白表达的调节及其机制
（一）ｃＲＨ对海马神经元ｓＧＫ蛋白表达的调节及其受体机制
为研究ｃＲＨ对海马神经元ＳＧＫ蛋白水平的表达是否也具有相应的诱导作用，我们利用免疫荧光细胞化学方法检测ｓＧＫ蛋白表达的变化。

结果显示，ＳＧＫ蛋白主要位于海马神经元胞体和轴突的细胞浆和细胞核内（红色荧光），以其胞体的细胞浆内表达为主（图２４Ａ）。

ｃＲＨ（１０４Ｍ）能诱导海马细胞内ＳＧＫ蛋白的表达明显增加（图１０Ｃ），特异性ＣＲＨＲｌ拮抗剂Ａｎ诅１ａｎｎｉｎｆ１０—７Ｍ）能抑制ＣＲＨ的诱导作用（图１０Ｄ）。

图２４．ｃＲＨ对海马神经元ｓＧＫ蛋白表达的调节及ａｎｔａｌａｍｉｎ的影响。

Ａ：对照组；Ｂ：ＤＥｘ（１０‘７Ｍ）；Ｃ：ＣＲＨ；Ｄ：如ｔａｌａ丌Ｉｌｉｎ。

Ｆｉ９２４．ｓＧＫｐｒｏｔｅｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｂｙＣＲＨｉｎｈｉｐｐｏｃａ唧ａ１ｎｅｌｌｒｏｎｓ锄ｄｅ髋ｃｔｏｆａｎｌａｔａ瑚ｉｎ．１押ｉｃａｌｐｉｃｔｕｒｅｓａｒｃｃｈｏｓｅｎｆｍｍｔｈｒｅｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ（ｎ＝３）．
进一步研究ｃＲＨ诱导ＳＧＫ蛋白表达的时间效应，我们给予海马神经元ＣＲＨ（１０＿８Ｍ）分别孵育ｌｈ、３ｈ、６ｈ、１２ｈ、２４ｈ。

免疫荧光细胞化学染色的结果显示，ＣＲＨ孵育３ｈ后细胞内荧光开始增强，直至２４ｈ荧光强度仍高于对照组。

由此提示，ＣＲＨ作用于海马神经元３ｈ后ＳＧＫ蛋白表达开始增加，至少持续到加药后２４ｈ（图２５）。

（二）ｃＲＨ调节海马神经元ｓＧＫ蛋白表达的胞内信号转导机制
为证实ｃＲＨ诱导海马神经元ｓＧＫ蛋白表达的细胞内信号转导途径是否与ｍＲＮＡ水平一致，我们运用ＰＫＡ抑制剂Ｈ８９、ＭＡＰＫ抑制剂ＰＤ９８０５９、ＰＫｃ抑制剂Ｇ０６９７６和ＰＫＣ激动剂ＰＭＡ，观察它们对ｃＲＨ调节ＳＧＫ蛋白表达的影响。

免疫荧光细胞化学的结果显示，ＣＲＨ（１０＿８Ｍ）对ｓＧＫ蛋白表达的诱导作用被Ｈ８９（１０＿７Ｍ）所阻断，而ＰＤ９８０５９（５×１０＿７Ｍ）、Ｇ０６９７６（１０一７Ｍ）或ＰＭＡ（１０７Ｍ）均不能阻断ＣＲＨ的诱导作用，
第二军医大学硕士学位论文第一部分一实验结果
图２５，ｃＲＨ调节海马神经元ｓＧＫ蛋白表达的时间效应。

Ａ：对照组；Ｂ：ｃＲＨ作用１ｈ；ｃ：ｃＲＨ
作用３ｈ：Ｄ：ｃＲＨ作用６ｈ；Ｅ：ｃＲＨ作用１２ｈ；Ｆ：ｃＲＨ作用２４ｈ。

ｉｎｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌｎｅ啪ｎｓ．ＴｙｐｉｃａｌｐｉｃｔｕｒｃｓａｒｅＦｉ９２５，ＴｉｍｅｃｏｕｒｓｅｏｆＳＧＫｐ１．０ｔｅｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｂｙＣＲＨ
ｃｈｏｓｅｎｆ沁ｍｔｈｒｅｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ（ｎ＝３）．
图２６．Ｈ８９、ＰＤ９８０５９、Ｇ０６９７６、ＰＭＡ对ｃＲＨ调节ｓＧＫ蛋白表达的影响
ｏｆＨ８９、ＰＤ９８０５９、Ｇ０６９７６、ＰＭＡｏｎＳＧＫｐｒｏｔｅｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｂｙｃＲＨ．１ｙｐｉｃａｌｐｉｃｔｕｒｅｓＦｉｇｌ２ＥｆＩｂｃｔ
ａｒｅｃｈｏｓｅｎｆ如ｍｔｈｒｅｅｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ（ｎ＝３）．
六、ｃＲＨ对谷氨酸所致海马神经元损伤的影响
为探讨ＣＲＨ在谷氨酸所致海马神经元损伤中所起的作用，我们的实验分别观察谷氨酸损伤前ｃＲＨ预处理和损伤同时ｃＲＨ处理两组细胞培养液上清中ＬＤＨ的含量。

ＬＤＨ测定结果显示，不同浓度的谷氨酸作用于海马神经元２４小时后，培养液中ＬＤＨ含量增加，并呈现剂量依赖性，谷氨酸受体拮抗剂ＭＫ８０１（１００脚）可以完全阻断谷氨酸对海马神经元的损伤作用（图２７）。

ｃＲＨ（１０‘８Ｍ）预处理１２ｈ可加强谷氨酸（２００肛Ｍ）对海马神经元的损伤，而损伤同时ｃＲＨ处理可减轻谷氨酸对海马神经元的损伤作用（图２８）。

第二军医大学硕士学位论文第一部分一讨论
讨论
一、原代培养的大鼠海马神经元中ｃＲＨ受体以及Ｇｃ受体的表达
哺乳类动物ｃＲＨ受体有两种类型：ｃＲＨＩ型受体和ｃＲＨＩＩ型受体。

ｃｈａｌＩＩｌｅｒｓ等人用原位杂交方法显示，ｃＲＨＩ型受体主要分布于大脑皮层额叶、小脑、被盖核、隔、上丘、杏仁基底外侧核、红核、三叉神经核、终纹床核、海马、蓝斑、嗅球、内嗅皮层、导水管周围的中央灰质、垂体等，下丘脑含量较少。

而ＣＲＨｌＩ型受体主要分布于下丘脑室旁核和视上核、腹内侧核、中脑下丘核、缝核、侧隔、杏仁体、终纹床核、海马、嗅球、内嗅皮层、导水管周围的中央灰质、大脑微动脉和脉络丛等［２２１（图３０）。

我们的实验运用ＲＴ＿ＰｃＲ方法，在ｍＲＮＡ水平证实了用王福庄等方法体外培养的大鼠海马神经元中表达ＣＲＨＲｌ和ＣＲＨＲ２，与Ｃｈａｌｍｅｒｓ等的结果一致。

我们的实验中还发现，海马神经元中ｃＲＨＲｌ受体的表达较为丰富，ｃＲＨＲ２受体的表达较少，与ｃｈｅｎ等人的结论一致【２３】。

图３０．脑横断面ｃＲＨＲｌ和ｃＲＨＲ２ｆｒｌＲＮＡ的分布
红色和橙色区域为受体ｍＲＮＡ高表达区，蓝色区域为ｍＲＮＡ受体低表达区。

ｍＲＮＡｉｎｂｒａｉｎｔｍｎｓｅｃｔｉＯｎ
Ｆｉｇ３０．Ｄｉｓ廿ｉｂｕｄｏｎｏｆＣＲＨＲｌａｎｄＣＲＨＲ２
正常成年大鼠脑中，海马稳定表达丰富的Ｇｃ受体ＧＲ。

但在海马发育时或原代培。