实验六 用离子交换层技术纯化目的蛋白

实验六用离子交换层技术纯化目的蛋白
【实验目的】
使学生掌握离子交换层技术纯化蛋白质的工作原理。

学会筛选离子交换介质的工作方法，以及优化离子交换层析过程的策略，获得具有教高程度的蛋白质。

【实验原理】
离子交换层析技术是一种分离纯化生物物质的最常用的方法之一。

由于此种方法是一种建立在各种生物分子携带有不同的电荷的基础之上的分离方法，所以它依赖于分离系统的PH高于被分离物质的PI时，被分离物质带负电荷，可被阴离子交换剂结合，相反，则同阳离子交换剂结合。

生物分子表面所带电荷即使有很小的差别，也足以采用离子交换层析技术把它们分离开来。

通过优化分离系统的离子强度和PH值以及采用梯度洗脱方法可以使离子交换层析的分辨力更高。

蛋白质是带有多个极性集团的大分子物质，在有多种蛋白质存在的蛋白质混合物溶液中，每种蛋白质因其分子大小，氨基酸组成的差别，对同一种离子交换介质具有不同的离子交换吸附能力，接着于此种差别，我们就可以在特定的离子交换层析技术环境下把目的蛋白分离出来。

离子交换层析环境包括离子交换介质的种类、交联度、蛋白质溶液和离子交换层析柱平衡液的pH值及离子强度等。

通过对离子交换层析环境的优化，可以使选择的离子交换剂在特定的环境下仅同目的蛋白结合。

而不同其他蛋白结合，或者仅同杂蛋白结合而不同目的蛋白结合。

然而，此种环境条件对大多数蛋白质来说是不易找到的。

通常遇到的情况是，在特定的条件下，离子交换介质既能与目的蛋白结合也能与杂蛋白结合，但是对两者的结合量有所不同。

在此种情况下，可以通过选用特异的洗脱条件选择性的将目的蛋白或杂蛋白从离子交换层析柱上洗脱下来，而达到分离纯化目的蛋白质的目的。

离子交换剂同其反离子的结合能力因反离子的种类不同而有差别。

例如强酸性（阳）离子交换剂对H+的结合力比对Na+的小；强碱性（阴）离子交换剂对OH-的结合力比对Cl-1的小；而弱酸性和弱碱性离子交换剂对上述离子的结合力的大小同强酸性和强碱性离子交换剂相反。

因此在应用离子交换剂时，采用何种反离子进行电荷平衡是决定吸附容量的重要因素。

蛋白质是两性离子物质，一种离子交换剂对它的结合力取决于蛋白质的理化性质和在环境中呈现的离子状态。

当环境的pH值底于蛋白质的等电点（PI）时，蛋白质带正电荷能被阳离子交换剂吸附；相反，被阴离子交换剂吸附。

在特定的pH环境中，PI>pH，其值相差愈远，蛋白质的碱性愈强带正电荷愈多，愈易被
阳离子交换剂吸附。

蛋白质是大分子物质，其溶液呈胶体状，因此用离子交换层析技术提纯蛋白质时，应选择那些选择性好弱酸性或弱碱性离子交换剂。

并且希望其交联度小，孔隙大，以利于蛋白质分之渗透入交换剂的网孔中进行离子交换吸附。

蛋白质在离子交换剂上的吸附和解吸附（洗脱）受环境中的pH值和离子强度控制。

因此，可以选择一种特定的环境条件促使蛋白质同离子交换剂吸附；选择另外一种环境条件（即改变pH或改变离子强度），使蛋白质从离子交换剂上解吸附，由于蛋白质的种类无记其数，组成各异，很难找到一种适用于所有蛋白质的离子交换层析条件（包括吸附和洗脱两种过程）。

因此，每一种蛋白质的离子交换层析过程，都需要利用小样法对过程进行优化。

常用的小样法是在试管中进行的而不是采用小型层析柱。

通过改变离子浓度和pH值筛选最佳吸附和洗脱条件。

根据离子交换介质所带的反离子完全离子化的pH值范围，将其分类为强阳强阴，弱阳和弱阴四种类型。

离子交换介质离子化范围较宽的为强，较窄的为弱，与反离子的结合强度无关。

在利用离子交换层析技术分离纯化某种蛋白质的时候，首先需要选择适宜的离子交换剂。

对蛋白质而言，可以选用阴离子交换剂也可以使用阳离子交换剂究竟选用何种离子交换剂，要根据蛋白质的PI来决定。

由于在研究工作开始时，人们尚不知道目的蛋白质的PI，所以一般先在生理pH值下对阴、阳两种离子交换剂都做小样实验。

由于弱酸、弱碱性离子交换剂在生理pH值下的交换容量也比较高，用来分离蛋白质时，其生物活性不易受损，所以常被进行蛋白质纯化工作。

Pharmacia生物工程公司新近研制出强阳SP型和强阴Q型离子交换介质的工作pH范围比弱阴DEAE和弱阳CM型的工作pH范围更宽，更易保持高交换量。

所以不少研究工作者倾向于使用一些新型离子交换剂、代替弱阳和弱阴型交换介质。

在基因工程药物生产实践中，常常根据产品分离纯化过程的不同阶段的样品性质和纯化目标来选择合适的离子交换介质。

如下表所示：
通过小样试验确定了最适离子交换剂以及吸附/洗脱的最适层析条件之后，接下来的工作便是确定离子交换层析柱的尺寸，样品溶液上样体积以及洗脱也流速等。

离子交换层析柱的柱床体积，即离子交换剂的装柱量，由离子交换剂的交换量和样品溶液中待分离蛋白质的含量决定。

在溶液成分复杂时，必须使离子交换剂的交换量留有充分的余地。

因此层析柱的实际交换量只能是理论交换量的25-50%。

在要分离的蛋白质溶液的成分复杂，目的蛋白质与杂质蛋白质性质相似时，则实际交换量应设定得更低。

离子交换层析柱中的离子交换剂的用量可以用下式来计算：
A
W= （1）
B×C×M
式中：W—离子交换剂的装柱量，ml
A—目的蛋白质的含量mg
M—目的蛋白质的分子量Dal
B—单位重量的离子交换剂的理论交换当量毫克当量/ml
C—系数一般取5%—50%
离子交换层析柱的高径比多为10：1。

根据下式可以计算出层析柱的直径和高度：H= 3 400W
π
式中：H—层析柱离子交换剂的装填高度cm
W—所需交换剂的装柱量（由式（1）求得），ml
π—3.1416
1
则，柱的直径D= H
10
离子交换层析柱洗脱液流速一般由离子交换介质的性质、操作压力、层析柱的体积和待分离蛋白质决定的。

流速大小可以用体积流速（ml·cm-2 h–1）或线性流速（cm/h）表示。

对体积不同的层析柱来说，体积流速不能直接用作比较，所以常用线性流速表示，两种流速的换算关系如下：
体积流速（ml·cm-2·h -1）
线性流速（cm·h -1）=
层析柱横断面面积（cm2）
流速过大会降低层析柱的分辨力。

其最佳值，需实验确定。

一般采用5—10cm·h–1。

【实验器材】
1.5ml Eppendorf离心管8支、φ10×15带螺旋盖的试管一支、试管架、1ml、5ml刻度吸管各5支、吸头、紫外分光光度计、SDS-PAGE装置、φ25×300玻璃层析柱、铁架台、木工水平尺、螺动泵、核酸蛋白质检测仪、部分收集器
【实验试剂】
1．蛋白质溶液为实验六得到的脱区硫酸铵的目的蛋白质溶液；
2．20mM磷酸缓冲液pH7.5
3．2M NaCl——磷酸缓冲液：将固体NaCl 添加到20mM 的磷酸缓冲液中，使NaCl 的浓度为2M
4．离子交换树脂：弱酸性CM Sephadex C
弱酸性DEAE Sephadex A50
5．Bradford试剂：称取100mg考马斯亮兰G250，将其溶于50ml 95%乙醇中后，添加100ml 85%磷酸，加双蒸水至1000ml。

【实验方法】
1．层析条件的优化
A．吸附条件的确定
（1）将5ml CM-Sephadex C-50凝胶或DEAE-Sephadex A-50凝胶（本实验选用后者）置于一带有螺旋盖的φ10×15试管中添加5ml 20mM 磷酸缓冲酸（pH7.5），颠倒试管数次后，将试管直立地放置在试管架上，让凝胶自然沉淀，用带吸头的5ml吸管移去凝胶上部的缓冲液；
（2）重复上述洗涤操作10次；
（3）将200μl凝胶分别转至五个1.5ml Eppendorf离心管中，分别编号为1、2、3、4、5；
（4）向每个离心管中添加500μl脱盐的目的蛋白溶液；
（5）向各号、离心管中添加总体积为400μl的不同量的200mM磷酸缓冲液和含2MNaCl的磷酸，使NaCl的终浓度分别为50mM、100mM、200mM、300mM 和400mM
（6）颠倒离心管5—10次以充分混合其中的内容物，然后直立离心管，静置，使凝胶沉于管底。

重复上述操作两或叁次，总时达15min
（7）在高速离心机中，离心1—2分钟，从每个离心管中取50μl上清，制备SDS-PAGE样（一脱盐后的目的蛋白作对照）
(8)作SDS-PAGE分析，观察目的蛋白和杂蛋白在各管中的分布情况，选择上清中杂蛋白多，目的蛋白少的一管的盐浓度作为上柱时的洗柱缓冲液。

B．洗脱条件的确定
（1）将“A”操作中剩余的DEAE-Sephadex A50 凝胶分装于五支Eppendorf 离心管中，每管200μl；
（2）向每管添加500μl脱盐的目的蛋白溶液，添加400μl含浓NaCl的磷酸缓冲液，使NaCl的终浓度为“A”中测定的最佳吸附NaCl浓度，重复A（6）操作后，离心除去上清；
（3）分别向管1、2、3、4和5中加入pH值为5.8、6.4、6.8、7.5和8.0的含有于吸附时相同浓度NaCl的磷酸缓冲液1ml，重复A（6）~（8）操作，观察目的蛋白洗脱情况。

（4）选择目的蛋白质洗脱量最高的缓冲液作洗脱用缓冲液；
2. 装制离子交换层析柱
（1）根据测定的目的蛋白质在实验六得到的脱盐蛋白质溶液中的含量和本实验“1”选顶的离子交换剂的吸水量技术出所需层析柱的尺寸；
（2）将根据装柱量技术出的干离子交换剂用蒸馏水浸泡三小时后，补加过量的水，搅拌使交换剂悬浮后，静止放置，使交换剂颗粒沉降，小心倾倒交换剂表面的上清以除去细微的颗粒。

（3）如果选用的离子交换剂是弱酸性的，则向用水浸泡过的交换剂中假如2倍体积的0.5mol/L盐酸，在室温下处理30分钟后，倾去演算反复用蒸馏水漂洗交换剂，直至漂洗水呈中性后，假如0.5mol/L NaOH浸泡30分钟后，倾去碱液，用蒸馏水漂洗至中性，如果选用的离子交换剂是弱酸性的，则先用NaOH 处理，再用HCl 处理。

起目的是使弱酸性交换剂带的反离子是Na+，而弱酸性交换剂以Cl-作为反离子，以增加交换剂的交换量。

（4）将玻璃层析柱洗净后垂直地固定在铁架台上，用木工水平尺校正垂直度。

关闭柱下出液阀门，向柱中灌注蒸馏水，使液面至1/2柱高，如柱底部有气泡存在，可采用开启出液阀排除。

将处理好的交换剂灌注如层析柱中，待交换剂下沉在柱底形成2-3厘米厚的交换剂后，打开底阀让水一40ml/h的速度流出，并随时将剩余的交换剂悬浮液添加到层析柱中，使交换剂装填均匀、无气泡。

（5）关闭柱底出液阀，向柱内灌注蒸馏水至柱顶；盖上柱顶塞，并用导管同输液量以调整至40ml/h的蠕动泵向联，打开柱底出液阀开动蠕动泵，使二倍柱床体积的蒸馏水通过层析柱；
（6）关闭蠕动泵，并取下柱顶塞，让柱顶上的蒸馏水的弯月面降至与主厂顶面向切，关闭底部出液阀，将已脱盐的蛋白质溶液沿柱壁小心添加到柱床上。

打
开柱底出液阀，使样品液面下降至柱床顶面，用少量洗柱液（其成分由本实验“1”确定）小心冲洗柱壁，使粘在柱壁上的样品完全进入柱床；
（7）关闭柱底出液阀后，小心讲洗柱液灌注如柱床顶部空间后塞上柱顶塞，并将其与上述蠕动泵相联。

打开柱底出液阀，开动蠕动泵，将2倍柱床体积的洗柱液送入层析柱，洗去未被吸附的杂蛋白；
（8）将柱底出液毛细管通过核酸蛋白质检察仪同分部体积已调至1.5ml的部分收集器相联后，将蠕动泵吸液管插入到洗脱液瓶中（洗脱液成分通过“1”确定），开动部分收集器和蠕动泵，以及核酸蛋白质检察仪，用2倍体积的洗脱液洗脱柱床中吸附的目的蛋白质；
（9）核算蛋白质检察仪连接的记录器画出的层析曲线，可能如下图所示：
A B
1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 分部号
（10）收集少量A和B之间相对应的个分部，用Bradford试剂测定蛋白质的含量，并取小量样品做SDS-PAGE检查收集的蛋白质溶液的纯度，技术纯化得率。

【思考题】
1．用离子交换层析技术分离、纯化目的蛋白质时，如何确定层析过程的各种操作参数（包括离子交换剂种类、装柱量、层析柱尺寸，清洗缓冲液和洗脱缓冲液、层析柱洗脱液流等）？
2．何谓强阳、强阴、弱阳、弱阴离子交换介质，纯化基因工程药物产品时如何选择所需的离子交换层析介质？。