利用溶解度差异从人参花中分离人参皂苷Re工艺研究_王冰

利用溶解度差异从人参花中分离人参皂苷Re 工艺研究
王
冰1
李
慧1
杨宗林1
贾
冰1
刘淑莹1，2*
（1.长春中医药大学人参科学研究院，长春130117；
2.中国科学院长春应用化学研究所长春质谱中心，长春130022）
摘
要：目的建立一种利用溶解度差异从人参花中分离人参皂苷Re 新工艺，并对工艺进行优化。

方法：以
人参皂苷Re 含量为指标，对分离工艺进行优化，并通过高效液相-质谱联用技术对人参皂苷Re 进行定性鉴别和含量测定。

结果优化工艺条件为溶液浓缩体积75mL ，静置温度15℃，静置时间
6h 时，分离出人参皂苷Re 纯度达到83.57%，总收率达1.67%。

结论此方法操作简单，重复性好，
可用作以人参花为原料获得人参皂苷Re 的大规模生产。

关键词：人参花；人参皂苷Re ；分离；HPLC-MS/MS ；HPLC
Using the solubility difference separation ginsenoside Re from
ginseng flower buds
WANG Bing 1，LI Hui 1，YANG Zong-lin 1,JIA Bing 1,LIU Shu-ying 1,2*
(1.JiLin Ginseng Academy,Changchun University of Chinese Medicine,Changchun,130117；2.Changchun Center of Mass Spectrometry,
Changchun Institute of Applied Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Changchun,130022)
Abstract:Objective To establish a kind of using solubility difference separated ginsenoside Re from ginseng
flower buds new technology ,and optimized the process.Methods Ginsenoside Re content as the index,optimized the separation process,by High Performance Liquid -Mass Spectrometry technology to ginsenoside Re qualitative identification and content determination.Results The solution is concentrated volume 75mL,standing temperature 15℃,holding time 6h,get the maximum mass Re crude,ginsenoside Re monomer content increase from 40.11%to 83.57,with a total yield of 1.67%.Conclution This method is simple,reproducible,and can be used as raw materials in order to obtain ginsenoside Re mass production.
Key words:Ginseng flower buds;Ginsenoside Re;separation;HPLC-MS/MS
人参花为五加科多年生草本植物人参（Panax ginseng C.A.Mey.）的干燥花蕾。

具有抗肿瘤、抗溃疡和
延缓衰老等作用，临床上常被制成茶品来补充人体元气，恢复体力，提高人体免疫力。

据研究发现，人参花蕾中人参总皂苷含量是人参根的5.06倍[1]，其中人参皂苷Re 含量是人参根的14.7倍[1]。

人参皂苷Re 是三醇型人参皂苷的一种，具有益智[2]、调节血糖[3]、抗缺血性心律失常作用[4],尤其在抗
心肌缺血再灌注损伤方面作用显著[5]，目前以Re 为原料用于心肌缺血治疗的注射液已经被批准进入三期临床。

传统人参皂苷Re 的分离方法有大孔吸附树脂法[6]、高速逆流色谱法[7]、葡聚糖凝胶LH-20柱层析法
[8]
等,均经皂苷组-皂苷单体的分离顺序获得，不仅操
作繁琐、有机溶剂用量大且Re 单体收率低。

本实验采用简单的提取分离工艺，并着重对Re 分离工艺条件进行优化考察,对分离出的Re 单体进行结构鉴定及
基金项目：国家自然科学基金项目，项目编号：21475012，项目名称：中性寡糖和糖苷类化合物的异构体的质谱识别新方法研究。

作者简介：王冰，女，在读硕士，研究方向为中药有效成分与应用开发研究。

E-mail:517218398@.*通讯作者：刘淑莹，女，教授，主要从事质谱分析研究。

E-mail:sylccucm@.
9
人参研究GINSENG RESEARCH 2015年第1期
含量测定，旨在为工业化生产Re 单体提供新方法，为今后进一步开发以Re 单体为有效成分的制剂奠定基础。

1仪器和材料
分析天平FA2004A （上海精天电子仪器有限公司）；TDZS-WS 多管架自动平衡离心机（长沙湘仪仪器有限公司）；DF-101S 集热式磁力搅拌器（吉林省艾那莱特仪器设备有限公司）；Agilent 6520Q-TOF 质谱仪（安捷伦科技有限公司）；人参皂苷Re 标准品（购自中国药品生物制品鉴定所批号：110754-200822）；人参花(购自产地吉林省抚松县,经长春中医药大学姜大成教授鉴定为五加科植物人参Panax ginseng C.
A.Mey 的干燥花蕾)；乙腈为色谱纯（美国Fisher 公
司）；其余试剂为分析纯（均购自北京化工厂）。

2提取分离方法
称取干燥人参花蕾50g ，置圆底烧瓶中，加入
70%乙醇溶液400mL ，回流提取三次，合并滤液，浓
缩，加入50%乙醇溶液，静置过夜，离心，抽滤，滤液浓缩至100mL ，加入蒸馏水60mL ，摇匀，乙醚萃取，收集下层水相，浓缩，不同温度下静置，过滤，干燥滤出物，获得人参皂苷Re 粗品,加入无水乙醇萃取3次，合并滤液，挥干，即获得人参皂苷Re 单体白色粉末。

3人参皂苷Re 的定性鉴别和含量测定
为明确分离产物结构，对2项下分离得到的白色粉末进行结构分析和含量测定。

3.1HPLC-MS/MS 定性鉴别
色谱条件：Agilent SB-C18色谱柱(1.8μm ,2.5
mm ×100mm)，流动相(A)0.1%甲酸水溶液，(B)乙腈，柱
温35℃。

质谱条件：电喷雾电离源，全扫描模式，扫描范围
m/z 700-1200,干燥气(N2)流速为8L min-1，干燥气
温度为350℃，雾化器压力为30psig ，毛细管电压为
350V ，碎裂电压为175V ，锥孔电压为65V 。

3.2HPLC 含量测定
对照品溶液制备：精密称取人参皂苷Re 标准品
1mg ，置于1mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得
浓度为1g L-1人参皂苷Re 对照品溶液。

供试品溶液制备：精密称取人参皂苷Re 粗品、人
参皂苷Re 单体粉末各70mg ，分别置于5mL 容量瓶中，加少量甲醇，超声，使其全部溶解，分别加甲醇定容至刻度，即得到浓度均为14g L-1的人参皂苷Re 粗品、人参皂苷Re 单体供试品溶液。

4优化分离工艺考察方法
为获得最佳分离工艺，以Re 收率为指标，采用单因素考察法，对分离过程中浓缩体积、静置温度、静置时间进行考察。

5实验结果
5.1HPLC-MS/MS 定性鉴别结果
图1为人参皂苷Re 单体的总离子流图，从图中可以看出人参皂苷Re 的含量最高，证明人参皂苷Re 单体得到了充分分离。

图2为人参皂苷Re 单体在负离子模式下的二级质谱串联图，通过和图3人参皂苷
Re[M-H]-碎裂图（MS ）进行对比，可证实白色粉末为
人参皂苷Re 单体。

图1人参皂苷Re 单体总离子流图（TIC ）
由图2、图3对比可知，在负离子模式下，m/z
945.5418为人参皂苷Re [M-H]-峰，m/z 783.4842为
人参皂苷Re α链丢失1分子葡萄糖基（162Da ）的碎片离子，m/z 765.4739为人参皂苷Re α链丢失1分子葡萄糖基（162Da ）和1分子水的碎片离子，m/z
799.471为人参皂苷Re β链丢失1分子鼠李糖基
（146Da ）的碎片离子，m/z 637.4315为人参皂苷Re β链丢失1分子鼠李糖基（146Da ）和1分子葡萄糖基（162Da ）的碎片离子，m/z 475.3789是在m/z 637.4315碎片离子基础上丢失1分子葡萄糖基（162Da ）的碎片离子。

王冰等：利用溶解度差异从人参花中分离人参皂苷Re
工艺研究
10
图2人参皂苷Re[M-H]-ESI-MS2谱图
图3人参皂苷Re[M-H]-碎裂图（MS ）
5.2含量测定结果
由图4可知，人参花蕾70%乙醇提取液总离子流图中人参皂苷Re 含量最高，经过50%乙醇沉淀，离心，乙醚萃取等步骤，去除多糖、色素、鞣制等杂质，人参总皂苷保留于乙醚萃取后下层溶液，经过优化分离工艺，大量人参皂苷Re 从溶液中析出，故优化分离后滤液总离子流图（图5）中人参皂苷Re 含量很低，证明人参皂苷Re 单体得到了充分分离。

采用外标法对获得的人参皂苷Re 粗品、人参皂苷Re 单体中Re 含量进行测定，结果人参皂苷Re 粗品中Re 纯度为40.11%，经无水乙醇精致后，人参皂苷Re 单体中Re 纯度为83.57%,总收率达到1.67%。

图470%乙醇提取液总离子流图（TIC ）
图5滤液总离子流图（TIC ）
5.3优化分离工艺考察结果
由图6可知，溶液浓缩体积75mL ，静置温度15
℃，静置时间6h 时析出人参皂苷Re 粗品质量最大。

溶液浓缩过程选用磁力搅拌器搅拌完成，在搅拌蒸发的同时进行加热。

不同温度、溶液量体积与静置时间
长短都会影响Re 结晶的析出，这是因为人参皂苷Re 的α链、β链连有不同种类的糖基，不同温度下，糖基会发生不同程度的裂解，使Re 极性发生变化，导致其在溶液中的溶解度不同，故过滤后获得人参皂苷Re 结晶质量会有差异。

11
人参研究GINSENG RESEARCH 2015年第1
期
参考文献
[1]赵灵燕.人参花蕾知多少[N].国际商报,2005,1,23.
[2]赵莹,刘金平,卢丹,等.人参皂苷促进自然衰老大鼠学习记忆作用及其机理的研究[J].Traditional Chinese Drug Research &Clinical Pharmacology 2007,January,Vol,18,No.1,20.
[3]高钧,卢守四,张蕾,等.人参皂苷Re 促进胰高血糖素样肽－1分泌的研究[J].中国药物与临床,2011,11(12):1383.
[4]陈英杰,徐绥绪,裴玉萍.人参化学成分及其抗心率不齐构效关系的研[A]//徐绥绪.92国际人参研讨会论
文集[C].沈阳:沈阳药学院,1992.
[5]郑振中,刘正湘,刘晓春,等.人参皂苷Re 抑制心肌缺血再灌注损伤中性粒细胞浸润和髓过氧化物酶活性
的研究[J].J Clin Cardiol(China),Dec2004,Vol 20,No12,736.
[6]郑友兰,张崇禧,张春红,等.D-101大孔树脂对人参皂苷吸附容量的影响[J].吉林农业大学学报,2002,24(6):47.
[7]孙成贺,王英平,刘继永,等.HSCCC 法分离制备人参果中人参皂苷Re[J].中药材,2008,31(4):527.
[8]张慧丽,孙印石,郑毅男,等.葡聚糖凝胶LH-20柱层析法分离人参皂苷Re 的研究[J].吉林农业大学学报,2005,27(3):293.
图6分离优化工艺考察
6讨论
本实验曾对人参花提取溶剂、乙醇沉淀溶液浓度及萃取溶剂等因素进行正交实验考察，通过对人参皂苷Re 含量测定，确定采用70%乙醇回流提取3次，对提取液进行浓缩，加入50%乙醇沉淀，乙醚萃取，获得Re 单体质量最大且粉末松散。

实验过程中以同样方法对比分离了人参茎叶、人参根及人参须中的人参皂苷Re 单体,均没有获得晶体析出，可能与其含有皂苷种类、含量及混合物中皂苷单体之间的相互作用有关，具体分离机制还需要进一步研究。

12
人参研究GINSENG RESEARCH 2015年第1期。