发酵生产中杂菌的检查与防治
发酵常见染菌原因及分析
发酵常见染菌原因及分析发酵是一种利用微生物代谢产生特定产物的过程。
在发酵过程中，微生物的生长和代谢活动是至关重要的，因此发酵过程中的染菌问题是不可避免的。
染菌的原因可能有很多，包括环境因素、操作不当、杂菌污染等。
下面将详细介绍一些常见的染菌原因及分析。
1. 空气中存在杂菌空气中存在大量的微生物，包括细菌、真菌和酵母等。
这些微生物可以通过空气传播到发酵系统中，并在适宜的环境条件下生长繁殖，导致发酵过程中的染菌问题。
为了减少空气中的杂菌对发酵系统的污染，可以采取以下措施：- 严格控制发酵环境的洁净度，保持操作区域的干净和无尘。
- 在发酵容器上使用滤器，可以有效阻止空气中的杂菌进入容器。
- 在操作过程中尽量减少容器的开启和移动，以减少空气中的杂菌进入的机会。
2. 操作不严谨对于发酵过程来说，操作的规范性和严密性非常重要。
操作不当往往是染菌的主要原因之一。
以下是一些可能导致染菌的操作不严谨的情况：- 使用不洁净的操作工具或容器，如不经过高温灭菌的培养瓶、试管等。
- 未经过严格的消毒处理，如未进行高温灭菌或化学消毒。
- 制备培养基时没有正确的称量和配比，导致培养基中存在过多或过少的某种成分。
- 操作时没有佩戴干净的实验室服装和帽子，容易将外界的杂菌带入发酵系统。
- 操作时没有对抽取样本的工具进行适当的消毒处理，可能会将外界的杂菌带入样品中。
为了避免操作不严谨导致的染菌问题，应采取以下预防措施：- 在实验室中建立操作规范，并进行培训，确保操作人员熟知并遵守相关操作程序。
- 使用洁净的操作工具和容器，并进行必要的灭菌处理。
- 对操作区域进行定期的清洁和消毒，保持操作环境的洁净。
- 在操作过程中密封容器，减少外界微生物的进入。
- 检查操作工具的消毒情况，确保消毒措施的有效性。
3. 培养基污染发酵过程中，培养基是微生物生长和代谢的基础。
如果培养基本身存在污染，就会导致发酵过程的染菌问题。
常见的培养基污染原因包括：- 培养基配制不当，如配制浓度错误、培养基中存在异物。
发酵染菌的检查
染菌的检查、原因分析和防止措施染菌的检查、原因分析和防止措施1.染菌的检查与判断在发酵过程中对杂菌污染的及早发现，及时处理，是免除染菌造成严重损失的重要问题。
因此，要求有确切、迅速的方法来检出杂菌的污染，目前常用方法主要有以下几种：（1）显微镜检查通常用革兰氏染色法，染色后在高倍显微镜下观察。
对霉菌、酵母发酵，先用低倍显微镜观察生产菌的特征，然后再用高倍显微镜观察有否染菌存在，根据生产菌与杂菌的特征区别，判断是否染菌。
必要时，可进行芽孢和鞭毛染色。
（2）平板划线培养或斜面培养检查法先将经灭菌的固体培养基倒入灭菌的平板中置培养箱摄氏37度，保温24h检查无菌即可使用。
将需要检查的样品，在无菌平板上划线，分别置摄氏37度、摄氏27度培养，以适应嗜中菌和低温菌的生长，一般在8h后即可观察。
噬菌体检查可采用双层平板培养法，底层同为肉汁琼脂培养基，上层减少琼脂用量。
先将灭菌的底层培养基熔后倒平板，凝固后，将上层培养基熔解并保持摄氏40度，加生产菌作为指示菌和待检样品混合后迅速倒在底层平板上，置培养箱保温培养，经12~20h培养，观察有无噬菌斑。
培养基（PH7.0）葡萄糖（%）牛肉膏（%）蛋白胨（%）氯化钠（%）琼脂（%）上层0.5 1.0 1.0 0.5 1.0下层0.5 1.0 1.0 0.5 2.0（3）肉汤培养检查法将需要检查样品接入经灭菌并经过检查无菌的肉汤培养基中，放置摄氏37度和摄氏27度分别培养24h，进行观察，并取样镜检。
此法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，也可用于噬菌体检查，此时使用生产菌作为指示菌。
葡萄糖酚红肉汤培养基：牛肉膏0.3%，葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，蛋白胨0.8%，1%酚红溶液0.4%，PH7.2。
用以上的检查方法检查未发现污染，还不能肯定未被污染。
除以上方法外，还可以从发酵过程的异常现象来判断是否染菌，如溶解氧、PH值、排气中CO2含量和菌体酶活力等变化来判断。
做泡菜发酵过程中控制杂菌的方法
做泡菜发酵过程中控制杂菌的方法
在泡菜发酵过程中，控制杂菌的方法主要有以下几个方面：
1. 发酵条件控制：利用无氧发酵和酸性环境抑制杂菌繁殖。
无氧环境可以抑制好氧菌，而乳酸菌发酵、酒精发酵形成的酸性环境可以抑制杂菌繁殖。
2. 食材选择：选择幼嫩、不新鲜的蔬菜，因为它们所含亚硝酸盐比较重。
腌制泡菜得蔬菜不要久放，不能堆积，加工前经过水洗、晾干，可以把绝大部分亚硝酸盐分解掉。
3. 容器消毒：装泡菜的容器彻底消毒，消灭细菌，减少有害生物和杂菌的污染。
4. 盐量控制：泡菜使用的盐水太少会使亚硝酸盐含量增多，盐量保持在15%左右，大部分腐败细菌不会滋生，产生的亚硝酸盐就少。
5. 温度控制：温度控制在20度适中，有利于乳酸菌发酵。
6. 避免搅动：泡菜过程中不要经常打开盖子搅动，乳酸菌只有在没有氧气的情况下才会正常繁衍，有效抑制有害细菌的生成。
如卤水表面长霉，不要轻易搅动打捞，以免杂菌下沉，污染泡菜导致腐烂。
这些方法仅供参考，可根据具体情况进行调整。
另外请注意，自制泡菜时一定要注意卫生和安全。
第七章发酵生产染菌及其防治
发酵罐罐底脓疱状积垢
罐底的加强板
a
b
c
法兰的“死角”
a—垫圈内径过小；b—垫圈内径过大；c—法 兰不平造成的泄漏与“死角”
灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方 法
压力表安装不合理形成“死角”
1,6—发酵罐；2—缓冲管；3,4—压力表； 5—旋塞
五、噬菌体污染及其防治
⑴ 菌体生长缓慢
⑵ 菌丝结团
⑶ 代谢不正常
⒉ 发酵异常
⑴ 菌体生长差 ⑵ pH值过高或过低
谷氨酸发酵时正常 和异常的溶氧曲线
⑶ 溶氧水平异常
⑷ 泡沫过多
⑸ 菌体浓度过高或过低
二、染菌的检查和判断
发酵过程是否染菌应以 无菌试验的结果为依据 进行判断。
⒈ 显微镜检查法(镜检 法)
微生物与发酵工艺
第七章 发酵生产染菌及其防治
第七章 发酵生产染菌及其防治
第一节 第二节
第三节
染菌对发酵的影响 发酵异常现象及原因 分析 杂菌污染的途径和防 治
所谓发酵染菌是指在发酵过程中，生产菌 以外的其他微生物侵入了发酵系统，从而 使发酵过程失去真正意义上的纯种培养这 一现象。
据报道，国外抗生素发酵染菌率为2％～5 ％，国内的青霉素发酵染菌率2％，链霉素、 红霉素和四环素发酵染菌率5％，谷氨酸发 酵噬菌体感染率1％～2％。
防治噬菌体染菌的方法具体归纳以下几点： ① 严禁活菌体排放，切断噬菌体的“根
源”；
② 做好环境卫生，消灭噬菌体与杂菌； ③ 严防噬菌体与杂菌进入种子罐或发酵罐
内；
④ 抑制罐内噬菌体的生长。
生产中一旦污染噬菌体，可采取下列措 施加以挽救：
微生物发酵中杂菌污染及其防治
微生物发酵中杂菌污染及其防治微生物发酵中杂菌污染及其防治发酵染菌是指在发酵过程中，生产菌以外的其他微生物侵入了发酵系统，从而使发酵过程失去真正意义上的纯种培养的现象。
发酵生产过程大多为纯种培养过程，需要在无杂菌污染的条件下进行。
从国内外目前的报道看，在现有的科学技术条件下要做到完全不染菌是不可能的。
目前要做的是提高生产技术水平，强化生产过程管理，防止发酵染菌的发生。
一旦发生染菌，应尽快找出污染的原因，并采取相应的有效措施，把发酵染菌造成的损失降到最小。
一、发酵异常现象及原因分析发酵过程中的种子培养和发酵的异常现象是指发酵过程中的某些物理参数、化学参数或生物参数发生与原有规律不同的改变，这些改变必然影响发酵水平，使生产遭受损失。
对此，应及时查明原因，加以解决。
（一）种子培养的异常现象种子培养异常导致培养的种子质量不合格。
种子质量差会给发酵带来较大影响。
然而种子内在质量常被忽视，由于种子培养的周期短，可供分析的数据较少，因此种子异常的原因一般较难确定，也使得由种子质量引起的发酵异常原因不易查清。
种子培养异常往往表现为菌体生长缓慢、菌丝结团、代谢不正常三方面。
1．菌体生长缓慢种子培养过程中菌体数量增长缓慢的原因很多。
培养基原料质量下降、菌体老化、灭菌操作失误、供氧不足、培养温度偏高或偏低、酸碱度调节不当等都会引起菌体生长缓慢。
此外，接种物冷藏时间长或接种量过低而导致菌体量少，或接种物本身质量差等也会使菌体数量增长缓慢。
生产中，培养基灭菌后需取样测定其pH，以判断培养基的灭菌质量。
2．菌丝结团在液体培养条件下，繁殖的丝状菌并不分散舒展而聚成团状称为菌丝团。
一个菌丝团可由一个孢子生长发育而来，也可由多个菌丝体聚集一起逐渐形成。
菌丝结团时从培养液的外观就能看见白色的小颗粒，菌丝聚集成团会影响内部菌丝的呼吸和对营养物质的吸收。
如果种子液中的菌丝团较少，进入发酵罐后，在良好的条件下，可以逐渐消失，不会对发酵产生显著影响。
第七章 发酵染菌及防治
无菌试验要严格取样操作，力求减少误差。
应同时用肉汤和双碟作对照，以便迅速作出判断。
当发现染菌时，要通过分辨菌型来探索菌源，并对杂菌
做耐热试验考察。
如果怀疑种子罐染菌，则种子不能轻率进发酵罐。
《发酵工程》
第七章 发酵染菌及防治
3、 无菌检查与染菌的处理
为了防止在种子培养或发酵过程中污染杂菌，在接种前 后、种子培养及发酵过程中分别进行无菌检查，以便及时 （1）无菌检查 发现染菌，并在染菌后及时进行必要处理是很重要的。 染菌通常通过3个途径发现：无菌试验、发酵液直接镜 检、发酵液的生化分析。其中无菌试验是判断染菌的主要 依据。
废弃的发酵液处理不当可以成为难以对付的污
染源。
《发酵工程》 2、 噬菌体污染与发酵异常
第七章 发酵染菌及防治
噬菌体污染后的情况因发酵工业的种类、 污染的噬菌体特性、污染时间、感染复度（即培
养物内的噬菌体与细菌的比率）、培养基成分、
发酵罐内的物理和化学条件不同而异。即使同样 的噬菌体并不一定引起同样的异常发酵情况。
《发酵工程》
项目 百分率%
进罐前未做设备严密度检查
接种违反操作规程
25.8
25.8
检修质量缺乏验收制度
操作不熟练
19.35
19.35
配料违反工艺规程
调度不当
6.45
3.25
《发酵工程》
（4）染菌的处理
第七章 发酵染菌及防治
发现染菌后，应立即根据染菌的种类及产生菌的菌龄等 具体情况分别进行处理。除据染菌时间及危害程度对污染 种子罐染菌后，种子不能再接入发酵罐中，这时可用备用 罐进行挽救或处理外，对有关设备也应进行处理。 种子接种。如无备用种子，则可选一适当培养龄的发酵罐培 养物作种子，即生产上所说的“倒种”。 发酵罐前期染菌后，如培养基中C、N含量尚高，则可重新 灭菌，接种后再运转；若染的杂菌危害性较大，则放掉部分 料液，补入新料液，重新灭菌、接种。 发酵中后期染菌或前期染菌轻微而发现较晚时，可加入适 当的杀菌剂或抗生素；或把高单位的后期发酵液压一部分到染 菌罐中，抑制杂菌生长速度；或者降低罐温，减缓杂菌繁殖速 度。
发酵生产中杂菌的检查与防治
发酵生产中杂菌的检查与防治在发酵生产过程中，杂菌的检查与防治是至关重要的环节。
杂菌的存在会严重干扰目标菌的生长发育，影响发酵效率，甚至会污染目标产品。
以下将详细介绍杂菌检查与防治的方法。
一、杂菌检查方法1.显微镜检查：取发酵液进行显微镜检查，观察菌体形态和生长情况。
如果发现杂菌，可以进一步进行革兰氏染色、芽孢染色等实验，确定杂菌种类。
2.培养基培养：将发酵液均匀涂布在选择性培养基上，观察菌落形态和颜色。
如果有杂菌，可以根据菌落的特征鉴别其种类。
3.抗体检测：有些杂菌会产生特定的抗体，可以利用抗体检测技术如ELISA、免疫荧光等方法检测杂菌的存在。
4.分子生物学方法：利用PCR、基因测序等分子生物学技术，可以快速、准确地检测杂菌。
二、杂菌防治方法1.发酵原料控制：严格控制原料来源，保证无污染。
对发酵设备进行定期消毒，防止设备带菌。
2.菌种选择与保藏：选择抗逆性强的菌种，并进行定期纯化与保藏，防止杂菌污染。
3.培养基优化：优化培养基成分和配方，提高目标菌对杂菌的竞争力。
4.发酵过程控制：通过控制发酵温度、pH值、溶氧量等参数，抑制杂菌生长。
5.添加抗生素：在发酵过程中添加适量的抗生素，抑制杂菌生长，但要注意不能影响目标菌的生长。
6.膜过滤法：采用膜过滤技术，将发酵液中的杂菌滤除，保证目标菌的纯度。
7.生物防治法：利用某些特定微生物或植物提取物，抑制杂菌生长。
例如，某些乳酸菌可以抑制病原菌的生长。
三、实际案例分析以酱油发酵为例，常见的杂菌检查与防治方法如下：1.杂菌检查：取发酵液进行显微镜检查，观察是否有杂菌存在。
如果发现杂菌，进行革兰氏染色确定其种类。
同时，将发酵液涂布在选择性培养基上，观察菌落形态和颜色。
根据菌落的特征，判断是否有杂菌污染。
2.杂菌防治：首先，严格控制原料和水质，避免污染。
其次，选择优良的菌种进行发酵，并定期进行纯化和保藏。
在发酵过程中，控制温度、pH值和溶氧量等参数，以抑制杂菌生长。
发酵过程中控制杂菌的方法
发酵过程中控制杂菌的方法
1.设备与环境消毒：
-在发酵前，应对所有接触发酵物料的设备，如发酵罐、管道、过滤器、阀门等进行全面、彻底的清洁和消毒，可使用高温蒸汽灭菌、化学消毒剂浸泡等方式进行消毒处理。
2.培养基灭菌：
-制备的发酵培养基必须在严格的无菌条件下操作，通过高压蒸汽灭菌或其它适用方式彻底灭菌，确保无任何杂菌存在。
3.无菌操作技术：
-接种、转接、取样等操作应在无菌操作台上进行，操作人员需要穿戴无菌防护装备，遵循无菌操作规程，避免引入杂菌。
4.种子纯化：
-使用纯净、活性良好的种子进行接种，必要时对种子进行多次传代净化，剔除可能携带的杂菌。
5.温度与pH控制：
-发酵过程中适当调整和控制温度、pH值等参数，创造有利于目标菌株生长而不利于杂菌滋生的条件。
6.监控与检测：
-定期对发酵过程进行监测，包括pH值、溶解氧、浊度等指标的变化，及时发现异常。
并对发酵液进行微生物检测，一旦发现杂菌污染，立即采取相应措施。
7.添加抑菌剂：
-在某些情况下，可在发酵过程中添加适量的抑菌剂或抗生素来抑制杂菌生长，但这需要考虑对目标菌株的影响。
8.应急措施：
-若发现早期染菌，可通过降低培养温度、调整补料策略、补充杀菌剂或抗生素等手段尝试挽救；若中后期染菌且不影响产品质量，则可考虑提前终止发酵。
9.优化工艺流程：
-改进工艺流程，如采用一次性使用系统、密闭连续流发酵技术等，减少人为操作带来的污染风险。
发酵车间日常杀菌措施
发酵车间日常杀菌措施发酵车间是进行微生物发酵的场所，因此，保持车间内的清洁卫生，防止杂菌污染，是保证发酵过程顺利进行的重要措施之一。
为了确保发酵产品的质量和安全，以下是一些常见的发酵车间日常杀菌措施：1.定期清洁和消毒发酵车间的清洁和消毒是防止杂菌污染的重要措施。
定期进行清洁和消毒工作，包括对发酵设备、管道、墙壁、地面等各个部位的清洁和消毒，可以有效地去除杂菌，保证发酵环境的卫生。
2.使用抑菌剂在发酵过程中，可以添加一些抑菌剂来抑制杂菌的生长。
例如，可以使用双氧水、酒精等消毒剂对发酵原料和设备进行消毒处理。
此外，一些天然的抑菌剂，如柠檬酸、醋酸等，也可以在发酵过程中使用，以抑制杂菌的生长。
3.空气净化发酵车间的空气中含有大量的微生物，这些微生物可能会对发酵过程产生不利影响。
因此，对发酵车间的空气进行净化处理也是非常重要的。
可以采用空气净化器、过滤器等设备对空气进行净化处理，以去除空气中的微生物和尘埃。
4.定期检查和监测为了确保发酵车间的卫生状况符合要求，需要对发酵环境进行定期检查和监测。
例如，可以定期对发酵设备进行检查和维护，以确保设备的正常运行和使用效果；同时，还可以对发酵产品的质量进行监测和分析，以确保产品的质量和安全。
5.人员管理发酵车间的工作人员是进入车间的最大污染源之一。
因此，对工作人员的管理也非常重要。
需要对工作人员进行健康检查和培训，以确保他们不带有任何疾病或细菌；同时，还需要对工作人员的服装、鞋帽等进行消毒和处理，以减少杂菌的污染。
6.环境控制发酵车间的环境温度、湿度、光照等因素都会影响微生物的生长和繁殖。
因此，需要对发酵环境进行严格的控制，以确保微生物的生长和繁殖符合要求。
例如，可以控制发酵温度、湿度和光照等参数，以获得最佳的发酵效果。
7.防止鼠类和昆虫的污染鼠类和昆虫是发酵车间的另一种污染源。
为了防止鼠类和昆虫的污染，可以在车间内部安装捕鼠器和灭虫器等设备；同时，还需要保持车间的清洁卫生，定期清理垃圾和废弃物等。
生化工艺第六章 发酵生产染菌及防治 第三节杂菌污染的途径和防治
第三节 杂菌污染的途径和防治
（1）严格控制无菌室的污染 根据生产工艺的要求和 特点，建立相应的无菌室，交替使用各种灭菌手段对无菌 室进行处理。除常用的紫外线灭菌外，如发现无菌室已污 染较多的细菌，可采用石碳酸或土霉素等进行灭菌；如发 现无菌室有较多的霉菌，则可采用制霉菌素等进行灭菌； 如果污染噬菌体，通常就用甲醛、双氧水或高锰酸钾等灭 菌剂进行处理。
第三节 杂菌污染的途径和防治
生产上发酵过程的管路大多数是以法兰连接，但常 会发生诸如垫圈大小不配套、法兰不平整、安装未对中、 法兰与管子的焊接不好、受热不均匀使法兰翘曲以及密 封面不平等现象，从而形成“死角”而染菌。因此，法 兰的加工、焊接和安装要符合灭菌的要求，务必使各衔 接处管道畅通、光滑、密封性好，垫片的内径与法兰内 径匹配，安装时对准中心，甚至尽可能减少或取消连接 法兰等措施，以避免和减少管道出现“死角”而染菌。
第三节 杂菌污染的途径和防治
加强生产环境的卫生管理，减少生产环境中空气的含 菌量，正确选择采气口，如提高采气口的位置或前置粗过 滤器，加强空气压缩前的预处理，如提高空压机进口空气 的洁净度。
设计合理的空气预处理工艺，尽可能减少生产环境中 空气带油、水量，提高进入过滤器的空气温度，降低空气 的相对湿度，保持过滤介质的干燥状态，防止空气冷却器 漏水，防止冷却水进入空气系统等。
第三节 杂菌污染的途径和防治
具体归纳以下几点： （1）严格活菌体排放，切断噬菌体的“根源” ； （2）做好环境卫生，消灭噬菌体与杂菌； （3）严防噬菌体与杂菌进入种子罐或发酵罐内； （5）抑制罐内噬菌体的生长。 生产中一旦污染噬菌体，可采取下列措施加以挽救。 （1）并罐法 利用噬菌体只能在处于生长繁殖细胞中
第三节 杂菌污染的途径和防治
发酵生产中杂菌的检查与防治
发酵生产中杂菌的检查与防治Prepared on 22 November 2020第一节发酵生产中杂菌的检查与防治一染菌的检查与判断凡是在发酵液或发酵容器中侵入了非接种的微生物统称为杂菌污染，及早发现杂菌，及早采取相应措施，对减少由杂菌污染造成的损失至关重要。
因此检查的方法要求准确、快速。
目前发酵生产上常用的检查方法有下列几种：1．显微镜检查一般单染色后用油镜观察，凡是从视野中发现有形态与生产菌株不同的菌体都可认为是污染了杂菌。
优点：简便、快速，能及时检查出杂菌。
缺点：（1）对固形物多的发酵液检查较困难；（2）对含杂菌少的样品不易得出正确结论，应多检查几个视野；（3）由于菌体较小，本身又处于非同步状态，应注意区别不同生理状态下的生产菌与杂菌，必要时可用进行革蓝氏染色、芽孢染色等辅助方法进行鉴别。
2．平板检查若怀疑发酵液被细菌污染，可取少量待检发酵液涂布在肉汤平板上，在适宜条件下培养，若出现与生产菌株形态不一的菌落，就表明可能被杂菌污染；若要进一步确证，可配合显微镜形态观察，若个体形态与菌落形态都与生产菌相异，则可确认污染了杂菌。
优点：（1）适于固形物多的发酵液；（2）形象直观，肉眼可辩，不需仪器。
缺点：（1）所需时间较长，至少也需8小时；（2）无法区分形态（包括细胞形态与菌落形态）与生产菌相似的杂菌，如啤酒生产中污染野生酵母时，由于啤酒酵母与野生酵母很难从形态上加以区分，只能借助生理生化试验进行确认。
（3）检查过程需严格执行无菌操作技术。
3．肉汤培养检查法此法主要用于空气过滤系统和液体培养基的无菌检查。
具体方法是将葡萄糖酚红肉汤培养基（牛肉膏%，蛋白胨%，葡萄糖%，氯化钠%，1%酚红溶液%，）装在吸气瓶中，经灭菌后，置37 ℃培养24小时，若培养液未变浑浊，表明吸气瓶中的培养液是无菌的，就可用于空气过滤系统的杂菌检查。
把过滤后的空气引入吸气瓶的培养液中，经培养后，若培养液变混，表明过滤后的空气中仍有杂菌，说明过滤系统有问题，若培养液未变混，说明空气无菌。
发酵生产中杂菌的检查与防治
第一节发酵生产中杂菌的检查与防治一染菌的检查与判断凡是在发酵液或发酵容器中侵入了非接种的微生物统称为杂菌污染，及早发现杂菌，及早采取相应措施，对减少由杂菌污染造成的损失至关重要。
因此检查的方法要求准确、快速。
目前发酵生产上常用的检查方法有下列几种：1．显微镜检查一般单染色后用油镜观察，凡是从视野中发现有形态与生产菌株不同的菌体都可认为是污染了杂菌。
优点：简便、快速，能及时检查出杂菌。
缺点：（1）对固形物多的发酵液检查较困难；（2）对含杂菌少的样品不易得出正确结论，应多检查几个视野；（3）由于菌体较小，本身又处于非同步状态，应注意区别不同生理状态下的生产菌与杂菌，必要时可用进行革蓝氏染色、芽孢染色等辅助方法进行鉴别。
2．平板检查若怀疑发酵液被细菌污染，可取少量待检发酵液涂布在肉汤平板上，在适宜条件下培养，若出现与生产菌株形态不一的菌落，就表明可能被杂菌污染；若要进一步确证，可配合显微镜形态观察，若个体形态与菌落形态都与生产菌相异，则可确认污染了杂菌。
优点：（1）适于固形物多的发酵液；（2）形象直观，肉眼可辩，不需仪器。
缺点：（1）所需时间较长，至少也需8小时；（2）无法区分形态（包括细胞形态与菌落形态）与生产菌相似的杂菌，如啤酒生产中污染野生酵母时，由于啤酒酵母与野生酵母很难从形态上加以区分，只能借助生理生化试验进行确认。
（3）检查过程需严格执行无菌操作技术。
3．肉汤培养检查法此法主要用于空气过滤系统和液体培养基的无菌检查。
具体方法是将葡萄糖酚红肉汤培养基（牛肉膏0.3%，蛋白胨0.8%，葡萄糖0.5%，氯化钠0.5%，1%酚红溶液0.4%，pH7.2）装在吸气瓶中，经灭菌后，置37 ℃培养24小时，若培养液未变浑浊，表明吸气瓶中的培养液是无菌的，就可用于空气过滤系统的杂菌检查。
把过滤后的空气引入吸气瓶的培养液中，经培养后，若培养液变混，表明过滤后的空气中仍有杂菌，说明过滤系统有问题，若培养液未变混，说明空气无菌。
发酵工程制药—发酵染菌及防治
三、不同染菌途径对发酵的影响
04 设备渗漏 染菌几率较大
03 培养基或设备灭菌不彻底 一般不具延续性，使单个（批）发 酵罐发酵失败
01 种子带菌 将导致染菌范围不断扩大，使生产 蒙受重大损失。
02 空气带菌 使发酵大面积染菌
四、不同染菌时间对发酵的影响
染菌时间：指无菌检查方法确准的污染时间，不是杂菌进入培养液的时间
（四）培养基灭菌不彻底导致染菌及防治
原料性状及灭菌技术的好坏影响灭菌质量。 1、原料性状 稀薄的培养基易灭菌彻底；而淀粉质原料特别是有颗粒时易灭菌不彻底或是升温过快或混 合不均时，易结块，使中心部位在灭菌时“夹生”，导致在发酵过程中团块散开而染菌。 防止措施： 淀粉质培养基以实罐灭菌为好，在升温时先搅拌均匀，加入一定量的a-淀粉酶进行液化， 并将原料大颗粒筛去。
放掉部分料液，补入必要营 养，重新灭菌再接种发酵
降温培养、调节ｐＨ、补加 培养基
发酵中后期染菌的处理
发
轻微染菌
酵
中
后
期
染
代谢产物已达一定水平
菌
的
处
无提取价值的发酵液
理
适当加入杀菌剂或抗生素及正 常的发酵液以抑制杂菌的生长 速度。
明确是染菌可放罐或继续培养
加热至1２0℃，保持30分钟 后排放
处理措施应具体问题具体分析、多种方法综合应用，如 案例：柠檬酸发酵中期染菌，处理措施：
✓ Ⅰ发酵初期，溶解氧基本不变 ✓ Ⅱ对数生长期，溶解氧浓度迅速下降 ✓ Ⅲ发酵中期，溶解氧有波动但变化不大 ✓ Ⅳ发酵后期，溶解氧浓度上升
ⅠⅡ Ⅲ
Ⅳ
➢ 异常的溶解氧曲线
1、当感染噬菌体时，生产菌的呼 吸作用受抑制，溶解氧浓度迅速上 升。感染噬菌体时的溶解氧的变化 比菌体浓度变化更灵敏。
发酵过程中染菌的有效控制及预防
发酵过程中染菌的有效控制及预防邢攀科摘要：针对微生物发酵过程中的染菌现象，分析了导致发酵染菌的几种主要原因，并提出了有效控制方法，以预防为主，及时观察分析，杜绝发酵染菌的隐患。
关键词：发酵染菌微生物发酵前言：杂菌感染，简称染菌，普遍存在于微生物发酵工业生产中。
特别是夏季，随着气温的不断升高．在丙酮、醇粮食发酵法工业生产中尤其突出[5]。
发酵过程是利用某种特定的微生物在一定的环境中进行新陈代谢，从而获得某种产品。
现代发酵工业要求纯种培养，不仅斜面、种子和培养基以及发酵罐、管道等须经严格灭菌除去各种杂菌，而且在需氧发酵中通入的空气也需经过除菌处理。
只有这样，才能确保生产不受杂菌污染，从而保证生产菌的旺盛生长。
染菌的结果，轻者影响产量或产品质量，重者导致倒罐，甚至停产。
工业发酵中污染杂菌造成的损失是十分惊人的，所以必须认真对待除菌。
1 发酵过程对设备的要求1.1发酵罐发酵罐在使用之前，需要进行认真检查，以消除染菌隐患，如搅拌系统转动有无异常;机械密封是否严密:罐内的螺丝是否松动;罐内的管道有无堵塞;夹层或罐内盘管是否泄漏;罐体连接阀门严密度等等。
机械密封目前在发酵罐上得到广泛应用，取代了以前搅拌轴采用的填料密封形式，但是由于安装精度不高或选用的机械密封不合适，仍然会由于轴封泄露造成染菌，因此在安装搅拌轴时要注意对中，为了便于观察罐内发酵情况，在人型发酵罐内一般设置有冲洗视镜的蒸汽管道，但是蒸汽一旦冷凝在管道中，冷凝水并不能完全保证无菌，因此冲洗视镜的蒸汽管道要去除，杜绝染菌隐患。
如果罐内雾气大看小清楚，可以采用更高亮度的视镜灯[6]。
1.2发酵罐附属设备发酵罐附属设备有空气净化系统，温度、压力流量等控制系统及相应的管道阀门。
哪一个环节出问题都会造成发酵失败[3]。
1.2.1空气净化系统传统的空气净化使用活性炭、棉花、超细玻璃纤维纸做过滤器Ul，过滤效果差，操作复杂。
目前国内的膜过滤技术比较成熟，用偏二氟乙烯((PVDF)制成的折叠微孔滤膜滤芯，过滤精度高，流量大。
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发酵生产中杂菌的检查与防治————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期:ﻩ第一节发酵生产中杂菌的检查与防治一染菌的检查与判断凡是在发酵液或发酵容器中侵入了非接种的微生物统称为杂菌污染,及早发现杂菌，及早采取相应措施，对减少由杂菌污染造成的损失至关重要。
因此检查的方法要求准确、快速。
目前发酵生产上常用的检查方法有下列几种：1．显微镜检查一般单染色后用油镜观察,凡是从视野中发现有形态与生产菌株不同的菌体都可认为是污染了杂菌。
优点:简便、快速，能及时检查出杂菌。
缺点:（1) 对固形物多的发酵液检查较困难;（２）对含杂菌少的样品不易得出正确结论,应多检查几个视野;（３) 由于菌体较小,本身又处于非同步状态，应注意区别不同生理状态下的生产菌与杂菌，必要时可用进行革蓝氏染色、芽孢染色等辅助方法进行鉴别。
2．平板检查若怀疑发酵液被细菌污染,可取少量待检发酵液涂布在肉汤平板上，在适宜条件下培养,若出现与生产菌株形态不一的菌落，就表明可能被杂菌污染;若要进一步确证,可配合显微镜形态观察，若个体形态与菌落形态都与生产菌相异，则可确认污染了杂菌。
优点：（１)适于固形物多的发酵液；（2)形象直观,肉眼可辩,不需仪器。
缺点:（１)所需时间较长，至少也需8小时；(２)无法区分形态（包括细胞形态与菌落形态）与生产菌相似的杂菌，如啤酒生产中污染野生酵母时,由于啤酒酵母与野生酵母很难从形态上加以区分，只能借助生理生化试验进行确认。
(3)检查过程需严格执行无菌操作技术。
3.肉汤培养检查法此法主要用于空气过滤系统和液体培养基的无菌检查。
具体方法是将葡萄糖酚红肉汤培养基（牛肉膏0.3％,蛋白胨０．8％,葡萄糖0.5%，氯化钠０.5%，1%酚红溶液0.4%,ｐＨ７.２）装在吸气瓶中，经灭菌后，置3７℃培养24小时,若培养液未变浑浊,表明吸气瓶中的培养液是无菌的,就可用于空气过滤系统的杂菌检查。
把过滤后的空气引入吸气瓶的培养液中,经培养后，若培养液变混,表明过滤后的空气中仍有杂菌,说明过滤系统有问题，若培养液未变混,说明空气无菌。
此法还可用于检查培养基灭菌是否彻底,取少量培养基接入肉汤中,培养后观察肉汤的浑浊情况即可。
4.根据发酵过程中的异常现象来判断是否染菌（1）溶解氧水平异常变化显示染菌每一种生产菌都有其特定的耗氧曲线,当杂菌污染时，如果污染的是好气性杂菌,会使溶解氧在较短的时间内下降，甚至接近零,且长时间不能回升;当污染的是非好气菌，生产菌的代谢由于受污染而遭抑制时,会使耗氧量减少,发酵液中的溶解氧就会升高。
如味精生产上受噬菌体污染时,使菌体利用的氧气量减少,DO上升。
（2）排气中CO2的异常变化显示染菌对特定的发酵,排气中CO2的含量变化也是有规律的。
在染菌后,糖的消耗发生变化，从而引起排气中CO２含量的异常变化。
一般说来污染杂菌后，糖耗加快,CO２含量增加；污染噬菌体，糖耗减慢,CO2含量减少。
（3）根据ｐＨ的变化及菌体酶活力的变化来判断杂菌的有无。
二杂菌污染的原因分析1．发酵染菌率发酵的总染菌率是指一年内发酵染菌的批次与总投料批次数之比。
即总染菌率＝发酵染菌批数/总投料批数×100%发酵染菌率是指发酵罐中的染菌率。
若种子罐染菌因及早发现未投入发酵罐中就不能计算入内。
2.发酵原因分析及防治措施要防治杂菌污染,首先要知道造成污染的途径,然后对症下药,堵塞污染源,达到安全生产的目的。
造成发酵污染的原因很多,现介绍如下。
根据造成污染的途径看,主要有:（1）种子带菌在发酵前期染菌，很可能是种子带菌。
种子带菌的原因主要有以下几方面ａ培养基及用具灭菌不彻底，特别是灭菌锅冷空气排放不完全,使温度达不到要求;ｂ菌种在移接过程中受污染。
应严格无菌管理制度，合理设计无菌室,并重视人员培训,严格按无菌操作规程接种；c 菌种在培养过程或保藏过程中受污染。
应注意培养室清洁卫生,规范试管的棉塞,摇瓶的瓶口布等。
（２)无菌空气系统染菌。
主要是由过滤介质的效能下降引起,包括ａ过滤介质(棉花、玻璃纤维等）被油水浸湿，失去了过滤效能;b 突然停电时,由于发酵罐压力高于过滤器的压力，导致培养基倒流入过滤器的介质中，使之成为杂菌生长繁殖的场所。
所以在遇停电时，要立即关闭发酵罐上的进气阀，再关闭排气阀;ｃ过滤介质铺放松紧不均匀，空气从疏松的部位穿过，造成过滤不完全，过滤后的空气中仍带有杂菌；ｄ过滤系统发生渗漏，密封性能差，造成染菌。
(3）培养基灭菌不彻底。
主要原因有a 对淀粉质原料,若搅拌时间不足，没有让淀粉与冷水充分混匀,一经加热，淀粉容易结成块状，蒸汽就不易穿入其内，致使灭菌不彻底而染菌;b冷空气未放尽,虽到预定压力,但达不到预定温度,致使灭菌不彻底;c对黏度高的培养基,若在灭菌过程中搅动不均匀,会造成受热不均,使一部分培养基灭菌不彻底。
（4）设备管道灭菌不彻底。
主要原因有ａ设备管道存在死角，使蒸汽不能有效地到达,造成染菌；ｂ操作不当引起。
在管道系统灭菌时，应把所有进气阀门都打开，让蒸汽均匀地进入管道，并维持一段时间。
所有放气（料)阀门及进料阀门（如接种阀或加料阀）也应微开，以消除死角。
（5）设备管道系统渗漏。
可能原因有a、罐体部位腐蚀;b、罐中冷却用的蛇形管穿孔；c、管路上的阀门不配套，或阀门连接方式、管路安装方法等不当。
综上所述，发酵染菌的原因很多,我们应根据发酵的现象，合理地分析污染的原因，并提出相应的挽救措施，表2－3-1~表２-3-3是前人在这方面的一些经验总结。
表2－3-1根据发酵时期来分析原因染菌的现象污染的原因分析挽救措施发酵早期染菌（接种后1２~24小时) 1、种子带菌2、培养基或设备灭菌不彻底1、染菌的种子灭菌后弃之2、加强灭菌，加强设备的检修3、轻者加大接种量，重者补料后灭菌，再重新接种发酵后期染菌1、操作过程中,特别是中间补料时带入2、设备渗漏或空气过滤系统污染4、轻者照常发酵５、重者提前放罐表2-3-2 根据染菌的类型来分析原因染菌的现象污染的原因分析挽救措施芽孢杆菌、霉菌1、培养基灭菌不彻底2、管道设备灭菌不彻底1、加强培养基的灭菌及管道死角的灭菌工作2、加强设备检修3、轻者加大接种量,重者补料后灭菌,再重新接种不耐热的细菌1、种子带菌2、设备渗漏一些G—菌（在葡萄糖酚红培养基中菌落呈绿色）由水带入,一般由设备渗漏或冷却器穿孔引起表2－3-3 根据染菌的范围来分析原因染菌的现象污染的原因分析挽救措施大批发酵罐染同一种菌空气过滤器除菌不净１、保持过滤介质干燥2、介质铺放均匀部分发酵罐染菌菌种带菌或补料时染菌或其它操作不严格执行无菌操作当带入杂菌加强设备的检查和维修个别发酵罐染菌一般是设备损坏，如阀门的渗漏、罐体的破损等根据对多个厂家的综合分析,造成杂菌污染的原因以设备问题为主，如设备的渗漏、管道不严密、设备中存在死角、空气过滤系统失效等;其次是种子（主要是二级种子)染菌,而培养基灭菌不彻底造成的染菌极少发生。
第二节噬菌体的污染和防治在许多发酵生产中，如氨基酸发酵、丙酮-丁醇发酵和抗生素发酵中常常遇到噬菌体(bactｅriaphａgｅ）污染，引起溶菌，并随之出现发酵迟缓或停止发酵等异常现象。
本节主要介绍噬菌体污染的特征,检查方法及防治措施。
一噬菌体污染的特征1发酵液光密度上升缓慢，甚至下降,肉眼可见发酵液逐渐变清；２耗糖速度缓慢或停止，产物生成量少或不增加,发酵液中残糖高；３产生大量泡末，发酵液呈粘稠状;４菌体不规则,甚至出现畸形。
二噬菌体的检查方法1．双层琼脂平板法（1）双层琼脂平板的制备:先用7～8mL 2%的琼脂培养基作底层,凝固后,加入3～4mL 冷至45℃的1%琼脂上层培养基（其中含０.２mＬ发酵菌种悬液和０．1mL待检发酵液）,让其平整凝固;（2）在发酵菌的适宜温度下培养,若是细菌，一般培养1６~20小时。
（3）检查有无透明的噬菌斑。
2．液体培养检查法将培养基、发酵菌种及待检发酵液三者混合，培养后观察培养液是否变清。
3．斑点试验法先制备好涂布有发酵菌种的平板,再用接种环或无菌吸管取少许发酵液在平板上点种，培养后，观察是否有噬菌斑。
４.玻片快速法将发酵菌种、发酵液和少量琼脂培养基（含0.5~0.8%的琼脂)混匀后涂布于无菌载玻片上,经短期培养后，在低倍镜下观察是否有噬菌斑。
三噬菌体的防治发酵液中污染噬菌体，不外乎有两种原因。
１菌种本身带噬菌体,特别是溶源性噬菌体,对这种菌种,一经发现,应立即弃去。
2 生产的环境中有噬菌体。
因此，可采取相应的预防措施:1 决不使用可疑菌种；2清除周围环境中存在的噬菌体。
能灭菌的灭菌，能消毒的消毒，搞好清洁卫生工作;3 选育抗噬菌体菌株4 轮换使用菌株。
因为一个菌株用的时间一长，就有可能出现该菌种的噬菌体。
5 注意通气质量。
取风口应设在30~４０米的高空,空气过滤器要保证质量;四发酵液污染噬菌体后的抢救措施如果一旦发现噬菌体污染，应及时采取补救措施1.若在发酵前期污染了噬菌体,因为此时耗糖还不多,常用以下措施（1）补加抗性种子,并根据发酵液中的营养多少,适当补加营养物质；（2）补加约5０%的已培养至对数期的正常的发酵液,再进行发酵;（3）若噬菌体轻度污染，菌体仍能较正常地生长,并积累代谢产物,则可照常进行发酵,若污染严重，则用加热法(7０~80℃）灭活噬菌体，放罐后重消毒。
2.若在发酵中后期污染了噬菌体，且比较严重，则应提前放罐,尽快提取产物。
发酵罐、管道、洗涤水及用具均应彻底灭菌，防止噬菌体扩散而造成新的污染。
并及时改用抗该噬菌体的生产菌株。
3．对某些产品可用药物防治。
选择能特异性地抑制噬菌体而对生产菌株及其发酵产物的积累和提取均无影响，又符合卫生要求、对人无毒的药物。
尽可能选活性高（用药量少)、价格低的药物。
如在谷氨酸发酵中常选用的药物有:（1）螯合剂。
如植酸盐(0．05～1％),柠檬酸盐（0.2~０.5%),草酸盐（0.2～0．5%),三聚磷酸盐(0.5~１%）等可抑制噬菌体的吸附或阻止DNA的注入；（2）表面活性剂。
0．01～0.2％的聚乙二醇单酯、聚氧乙烯烷基醚、土温２0、土温6０等。
主要作用于寄主细胞表面，抑制噬菌体在细菌上的吸附。
（3）抗菌素。
如1ug/mL的金霉素、四环素、氯霉素等抑制噬菌体蛋白质的合成;（4）Ｎ-脂酰氨基酸。
是一类具有16~1８个碳原子的衍生物。
如２0uｇ/mL的N-棕榈酰-L-谷氨酸,其作用机制是抑制噬菌体核酸的复制或子代噬菌体的成熟。