一株鸡大肠杆菌噬菌体的分离鉴定及治疗试验

一株鸡大肠杆菌噬菌体的分离鉴定及治疗试验
路建彪;王俊丽;吴伟胜;司振书;李玉保
【摘要】为探究大肠杆菌噬菌体的生物学特性及其治疗效果,本研究采用双层平板法分离纯化大肠杆菌噬菌体,并测定噬菌体的效价、温度稳定性、pH稳定性、感染复数(MOI)、一步生长曲线等生物学特性,以及噬菌体治疗大肠杆菌病的效果.结果显示分离的噬菌体Bp1805最佳MOI为1时,其效价可达2.4×10m pfu/mL;噬菌体Bp1805对温度的耐受范围较广,在pH5～pH10范围内非常稳定,该噬菌体潜伏期为20 min,裂解期为50min.大肠杆菌病治疗试验结果显示,注射噬菌体比口服噬菌体治疗效果好,大肠杆菌病的防治效果与噬菌体治疗方式和治疗时间有关;噬菌体治疗大肠杆菌病效果优于恩诺沙星和硫酸庆大霉素.噬菌体Bp1805能够裂解致病性大肠杆菌,为临床大肠杆菌病的噬菌体防治提供参考依据.
【期刊名称】《中国预防兽医学报》
【年(卷),期】2019(041)005
【总页数】4页(P530-533)
【关键词】大肠杆菌;噬菌体;分离鉴定;生物学特性
【作者】路建彪;王俊丽;吴伟胜;司振书;李玉保
【作者单位】聊城大学农学院,山东聊城252059;聊城大学农学院,山东聊城252059;聊城大学农学院,山东聊城252059;聊城大学农学院,山东聊城252059;聊城大学农学院,山东聊城252059
【正文语种】中文
【中图分类】S852.61
禽大肠杆菌病是由某些致病性或条件致病性大肠杆菌引起，是危害养禽业最为严重的细菌性疾病之一，在疾病预防和治疗过程中最易产生耐药性，导致抗生素用量增加和禽类产品药物残留等一系列问题。

该病一年四季均可发生，但以冬春季节和气温多变时期多发，给养禽业带来严重的经济损失。

禽大肠杆菌病在临床上主要通过抗生素防治，但由于抗生素的盲目添加或过量使用，导致大肠杆菌的耐药菌株不断增多、耐药谱不断扩大，进而导致治疗效果下降，养殖效益降低，同时对食品安全构成威胁[1]。

目前，大肠杆菌病仍是危害畜禽养殖业的主要细菌性传染病之一。

因此基于养殖效益、食品安全和公共卫生方面的考虑，寻找一种新的治疗大肠杆菌病疗效确实、无残留、符合国家减抗或无抗养殖发展方向的抗菌制剂乃当务之急[2]。

噬菌体作为细菌的天敌，可以裂解宿主菌，专一性强，高效，快速杀菌，不会感染畜禽机体，也不会产生耐药性[3]。

噬菌体主要感染细菌，对动物机体和人体安全，不污染环境[4]。

噬菌体作为抗生素的替代品，已经引起业内专家和相关企事业单
位的广泛关注。

本研究通过鸡大肠杆菌噬菌体的分离及其生物学特性的测定、大肠杆菌病的治疗试验，为大肠杆菌病的防治和无抗养殖开辟新思路、新方法，也是畜禽疾病防治研究的一个方向。

1 材料与方法
1.1 主要实验材料 15 份鸡新鲜粪便样品采集自聊城地区某大型肉鸡养殖场不同的
鸡舍；实验用大肠杆菌E5 从上述病样样品中分离纯化并保存于本实验室；恩诺沙星溶液购自山东潍坊华英生物科技有限公司；硫酸庆大霉素购自河南正大动物药业有新公司。

1.2 大肠杆菌噬菌体的分离及纯化参照文献[3]从采集的15 份鸡粪便样品中进行噬
菌体分离及纯化。

1.3 噬菌体的生物学特性测定将噬菌体裂解液10 倍倍比稀释，双层LB 培养基平
板法培养噬菌体产生噬菌斑，选择噬菌斑数量在30～300 个的平板，计算噬菌体
的效价，计算公式为效价(pfu/mL)=pfu×稀释倍数×10[3]。

取效价为2×1010 pfu/mL 噬菌体裂解液0.5 mL分别放入温度为40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃恒温水浴锅中，作用30 min 和60 min 时，检测噬菌体效价，平行检测3 次，取平均值。

取效价为2×1010 pfu/mL 噬菌体裂解液0.1 mL与37 ℃预温的各pH(pH4～11)LB 液体培养基0.9 mL混合，37 ℃恒温水浴60 min，检测噬菌体效价，平行检测3 次，取平均值。

将MOI 分别为1 000、100、10、1、0.1 和0.01的噬菌体裂解液分别加入
2.4×107 cfu/mL 的大肠杆菌培养液中，37 ℃摇床中培养12 h，离心，0.22 μm 滤膜过滤，并测定滤液中子代噬菌体的效价。

各个比例重复做3 次，取平均值，
以最高效价的MOI 作为最佳MOI[3]。

以最佳MOI 向试管中加入噬菌体和大肠杆菌，混合均匀，37 ℃温浴15 min，离心，弃掉上清，用37 ℃的液体LB 培养基洗涤沉淀2 次，最后用37 ℃LB 液体培养基10 mL，重悬沉淀，迅速放入摇床中，37 ℃、150 r/min 培养。

每隔10
min 测定噬菌体效价，平行检测3 次，取平均值。

以时间、效价对数值分别为横、纵坐标绘制曲线，即得噬菌体一步生长曲线。

1.4 鸡大肠杆菌病的噬菌体治疗试验将128 只健康的7 日龄817 肉鸡随机分为
16 组，每组8 只，其中3 组为对照组，1 组为空白组，同时设恩诺沙星和硫酸庆大霉素治疗组。

连续饲喂168 h。

除对照组2、对照组3、空白组外，其余各组分别腹腔注射大肠杆菌感染实验鸡，菌悬液浓度为2.4×108 cfu/mL(经细菌计数测定)，0.5 mL/只。

按照最佳MOI，分别在注射大肠杆菌前6 h、3 h、0 注射后3
h、6 h，其中5 组口服噬菌体裂解液，5 组腹腔注射噬菌体裂解液，浓度为
2.4×108 pfu/mL，剂量为0.5 mL/只，对照组，0：对照1 为腹腔注射大肠杆菌、对照2 为腹腔注射噬菌体裂解液，对照3 为口服噬菌体裂解液。

抗生素治疗组：0，口服10 %恩诺沙星注射液，0.1 mg/只；硫酸庆大霉素，1 万单位/只，连喂3 d，1 次/d。

空白组鸡正常饲喂，不做任何处理。

记录各组鸡只的状态(疾病计分标准：1= 精神不振、闭眼、缩头、采食下降等，2= 死亡，0= 正常)。

致病指数=疾病计分/总分。

2 结果与讨论
2.1 大肠杆菌噬菌体分离纯化从采集的鸡场粪便分离得到一株噬菌体，命名为
Bp1805，经过纯化后得到的边缘整齐、大小统一的透明的噬菌斑。

对Bp1805 测定效价结果为2.4×1010 pfu/mL。

2.2 噬菌体生物学特性测定最适温度测定结果显示，Bp1805 对温度有一定耐受性，在40 ℃～50 ℃范围内效价基本不变，较为稳定，50 ℃～80 ℃范围内，随着温
度的增加其效价下降很快，80 ℃降为零(图1A)。

表明，Bp1805 最适温度为50 ℃以下。

最适pH 值测定结果显示，Bp1805 对pH 的适应范围较广，在pH5～pH10 仍能保持较高活性，效价在108 以上；pH 在5 以下或10 以上，Bp1805 的活性开始下降(图1B)。

Bp1805 最适pH 为6～8，效价在1010 以上。

最佳MOI 测定结果显示，当MOI 1 时，Bp1805侵染大肠杆菌并裂解出子代噬
菌体效价最高，达到2.35×1010 pfu/mL，其MOI 为1。

一步生长曲线测定结果见图1C，Bp1805 的潜伏期为20 min，裂解期为50 min。

之后，噬菌体效价稳
定在1.48×1010 pfu/mL左右。

图1 噬菌体Bp1805 生物学特性测定结果Fig.1 Biological characteristics of phage Bp1805A：Bp1805 最适生长温度测定结果；B：Bp1805pH 稳定性试验
结果；C：Bp1805 的一步生长曲线A: The optimum growth temperature of phage Bp1805; B: The pH stability test of phage Bp1805; C: The one-step growth curve of pahge Bp1805
2.3 大肠杆菌病的噬菌体治疗效果口服和腹腔注射Bp1805 治疗大肠杆菌感染试验，结果显示，该噬菌体对鸡大肠杆菌病具有一定的治疗作用，抗生素治疗组致病指数分别为56.3 %和62.5 %，治疗效果较差(表1)。

表明，Bp1805 对致病性大肠杆菌有很好的治疗作用，腹腔注射噬菌体效果优于口服方式，在大肠杆菌感染前注射噬菌体起到很好的预防作用，感染后的6 h 内起到一定的治疗作用。

抗生素组致病指数高于噬菌体，可能与试验致病性大肠杆菌携带的耐药性有关。

Bp1805 治疗大肠杆菌的治疗效果明显优于抗生素组。

空白组鸡的疾病计分和致病指数均为0。

噬菌体具有对细菌特异、高效、快速杀伤的特性，特定的噬菌体只感染裂解特定的目标菌株[2,5]。

噬菌体杀伤细菌能力强，在细菌体内大量复制增殖，但对人和动物是安全的[4,6]。

能否分离鉴定多种噬菌体组成复合噬菌体制剂来防治细菌性疾病，甚至是防治多种细菌的混合感染，在养殖业将有很大的应用前景。

噬菌体治疗试验结果显示，大肠杆菌噬菌体治疗效果与给药方式、给药时间有关。

尽管噬菌体治疗细菌感染效果明显，但仍需解决如何延长噬菌体的保存时间、保存活性、准确把握给药时间、给药途径、提高给药的效率及安全性、科学评价噬菌体的治疗效果等难题[7-8]。

表1 致病指数Table 1 Intravenous pathogenicity indexA：口服噬菌体；B：腹腔注射噬菌体；C：口服恩诺沙星溶液；D：口服硫酸庆大霉素；E：腹腔注射大肠杆菌A: Oral administration bacteriophage; B: Intraperitoneal injection of phage; C: Oral of enrofloxacin; D: Oral gentamycin suifate; E: Intraperitoneal injection of E.coli分组Groups 168 h致病指数Pathogenicity
index 总分Total A前6 h Before 6 hour前3 h Before 3 hour 0 h 0 hour后3 h 3 hours later后6 h 6 hours later对照1 Control group 1对照2 Control group 2对照3 Control group 3 A 8 2 1 0 D--1 1650.00%B 0 0 0 1 C--9-----E-----1 1612.50%C--D--B 0 0 0 1662.50%56.30%62.50%1487.50%0 6-0-0---1662.50%4--0 1625.00%37.50%E-----0--1662.50%16 16--0-0-------------
【相关文献】
[1]高海涛，韩俊丽，关道明.大肠杆菌耐药现状的严峻性[J].生命科学，2017，29(5)：514-520.
[2]周祥莹，张灿，刘文华.鸡白痢沙门氏菌及其噬菌体vB-SpuS-Spp4 的分离鉴定[J].病毒学报，2018，34(2)：239-243.
[3]吴伟胜.鸡大肠杆菌噬菌体的分离鉴定及初步应用[D].聊城：聊城大学，2016：20-25.
[4]许东勤，姚琳，张奇，等.沙门氏菌和副溶血性弧菌裂解性噬菌体及其裂解酶研究进展[J].食品安全质量检测学报，2017，8(4)：1203-1211.
[5]朱育玮，李玉保，王守荣，等.噬菌体及其治疗细菌感染的研究进展[J].中国畜牧兽医，2015，42(3)：769-773.
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