染色体改构复合物（baf）和转录因子（nf12fctf）与rna聚合酶ⅱ在基因转录活动中的联系

摘要
哺乳动物ＳＷＩ／ＳＮＦ（ＢＡＦ）复合物和转录因子（ＮＦｌ／ＣＴＦ）都是转录活动的重要调控因子，许多实验证实，它们共同参与了基因转录调控活动。

ＢＡＦ复合物与转录因子ＮＦｌ／ＣＴＦ是否一同参加了由ＲＮＡ聚合酶ＩＩ介导的基因转录起始复合物的形成，目前还没有比较一致的认识，已有的模型仍缺乏实验支持。

本文以Ｊｕｒｋａｔ细胞、ＨｅＬａ细胞和小鼠脾Ｔ淋巴细胞为研究材料，通过酶联免疫吸附实验（ＥＬＩＳＡ）、免疫共沉淀、免疫荧光共定位和免疫电镜双标记等实验，观察和分析了ＢＡＦ复合物与转录因子ＮＦｌ／ＣＴＦ和ＲＮＡ聚合酶ＩＩ在基因转录活动中的
实，在自主增殖的Ｊｕｒｋａｔ细胞核中，存在ＢＡＦ复合物和转录因子ＮＦｌ／ＣＴＦ。

进一步用小鼠Ｔ淋巴细胞活化体系的研究发现，未经Ｃｏｎｈ激活的Ｔ淋巴细胞中，ＢＡＦ复合物和转录因子ＮＦｌ／ＣＴＦ不表达或低水平表达。

经Ｃｏｎｈ激活后，小鼠脾Ｔ淋巴细胞中ＢＡＦ复合物和转录因子ＮＦｌ／ＣＴＦ开始表达，随着刺激时间的增加，表达量增加。

以上实验表明，ＢＡＦ复合物和转录因子ＮＦｌ／ＣＴＦ在细胞中的表达是与细胞活化和基因转录活动密切相关的。

２、免疫共沉淀实验证明，在活化的小鼠脾Ｔ淋巴细胞和自主增殖的Ｊｕｒｋａｔ细胞中，ＢＲＧｌ、ＮＦｌ／ＣＴＦ和ＲＮＡ聚合酶ＩＩ是紧密结合在一起的，在没有活化的小鼠脾Ｔ淋巴细胞中这三种蛋白质没有免疫共沉淀现象。

以ＨｅＬａ细胞为材料，分别用抗ＢＲＧｌ抗体、抗ＲＮＡ聚合酶ＩＩ抗体和抗ＮＦｌ／ＣＴＦ抗体进行免疫荧光共定位分析，发现ＢＡＦ复合物的核心亚基ＢＲＧｌ和ＲＮＡ聚合酶ＩＩ的大亚基存在很好的荧光共定位现象，ＮＦｌ／ＣＴＦ和ＲＮＡ聚合酶ＩＩ的大亚基之间的共定位现象不明显，ＢＲＧｌ和ＮＦｌ／ＣＴＦ也有很好的共定位现象。

为了进一步揭示ＢＡＦ复合物与转录因子ＮＦｌ／ＣＴＦ和ＲＮＡ聚合酶ＩＩ的大亚基之间在亚显微结构水平的联系，我们用ＨｅＬａ细胞进行了免疫电镜双标记实验。

通过计算和分析分别代表两种蛋白质的两种金颗粒之间的距离，进一步证实ＢＡＦ复合物
与ＲＮＡ聚合酶ＩＩ的大亚基及转录因子ＮＦｌ／ＣＴＦ之间的联系紧密，而转录因子ＮＦｌ／ＣＴＦ与ＲＮＡ聚合酶ＩＩ的大亚基之间的联系相对较弱。

３、通过免疫荧光实验我们还发现，ＢＲＧｌ和ＲＮＡ聚合酶ＩＩ小亚基Ｂ６之间没有明显共定位现象，与ＲＮＡ聚合酶ＩＩ小亚基Ｂ８有部分的共定位现象；ＮＦｌ／ＣＴＦ与ＲＮＡ聚合酶ＩＩ小亚基Ｂ６有比较明显的共定位，与ＲＮＡ聚合酶ＩＩ小亚基Ｂ８有部分的共定位。

这些结果表明，ＢＲＧｌ和ＲＮＡ聚合酶小亚基Ｂ６可能不直接联系，与小亚基Ｂ８可能部分联系。

ＮＦｌ／ＣＴＦ可能是通过与ＢＲＧｌ和ＲＮＡ聚合酶ＩＩ小亚基Ｂ６的联系参与了转录起始复合物的形成。

免疫电镜双标记实验结果进一步证实了上述观察结果，即ＢＲＧｌ与ＲＮＡ聚合酶ＩＩ小亚基联系不紧密或不直接联系。

转录因子ＮＦｌ／ＣＴＦ与ＲＮＡ聚合酶ＩＩ小亚基Ｂ６的联系比较紧密。

４、研究表明，肌动蛋白是ＢＡＦ复合物的一个亚基，我们在本论文中通过蛋白质免疫沉淀、免疫荧光共定位和免疫电镜双标记实验，探讨了肌动蛋白与ＢＲＧｌ、转录因子ＮＦｌ／ＣＴＦ和ＲＮＡ聚合酶ＩＩ之间的联系。

结果表明，在活化的小鼠脾Ｔ淋巴细胞和自主增殖的Ｊｕｒｋａｔ细胞中，肌动蛋白可以与ＢＡＦ复合物、转录因子ＮＦｌ／ＣＴＦ和ＲＮＡ聚合酶ＩＩ结合。

肌动蛋白与ＢＡＦ复合物和ＲＮＡ聚合酶ＩＩ的联系紧密，与转录因子ＮＦｌ／ＣＴＦ的联系不太密切。

根据上述实验结果，我们推测，在转录活跃的细胞中，ＢＡＦ复合物、转录因子ＮＦｌ／ＣＴＦ、ＲＮＡ聚合酶ＩＩ和肌动蛋白是结合在一起的，共同参加了基因转录起始复合物的形成活动；ＢＡＦ复合物与ＲＮＡ聚合酶ＩＩ的大亚基直接联系，与转录因子ＮＦｌ／ＣＴＦ通过其Ｎ末端直接联系，转录因子ＮＦｌ／ＣＴＦ与ＲＮＡ聚合酶ＩＩ小亚基Ｂ６直接联系。

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关键词：ＢＡ—Ｆ：复厶物；ＲＮＡ聚合酶ＩＩ；转录因子母偷；基因转录———————‘—：——————－＿一一．————一、－——‘＝＝—二二二。

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１，ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔＢＡＦｃｏｍｐｌｅｘａｎｄＮＦｌ／ＣＴＦｅｘｉｓｔｉｎｔｈｅｎｕｃｌｅｉｏｆｓｅｌｆ－ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅＪｕｒｋａｔｃｅｌｌｓ．Ｆｕｒｔｈｅｒ，ｉｎｔｈｅｍｏｕｓｅｓｐｌｅｅｎＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ，ｉｔＷａｓｆｏｕｎｄｔｈａｔ，ｗｉｔｈｏｕｔａｃｔｉｖａｔｉｏｎｂｙＣｏｎＡ，ｔｈｅｒｅｗｅｒｅｎｏｏｒｅｘｔｒｅｍｅｌｙｌｏｗｌｅｖｅｌｏｆｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＢＡＦｃｏｍｐｌｅｘａｎｄＮＦｌ／ＣＴＦｉｎｔｈｅｓｐｌｅｅｎＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．ＡｆｔｅｒａｃｔｉｖａｔｅｄｂｙＣｏｎＡ，ｔｈｅｍｏｕｓｅｓｐｌｅｅｎＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｓｔａｒｔｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇＢＡＦ
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２，Ｉｍｍｕｎｏ—ＣＯ—ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｉｎｔｈｅａｃｔｉｖａｔｅｄｍｏｕｓｅ
ａｎｄｓｅｌｆ－ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅＪｕｒｋａｔｃｅｌｌｓ，ＢＲＧｌ，ＮＦｌ／ＣＴＦｓｐｌｅｅｎＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ
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３，ｂｙｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｅｎｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ｗｅａｌｓｏｆｏｕｎｄｔｈａｔＢＲＧｌｄｉｄ
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Ｉｎｇｅｎｅｒａｌ，ｗｅｓｕｐｐｏｓｅｔｈａｔｉｎｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｌｙａｃｔｉｖｅｃｅｌｌｓ，ＢＡＦｃｏｍｐｌｅｘ，ＮＦｌ／ＣＴＦ，ＲＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＩＩａｎｄａｃｔｉｎａｒｅｂｏｕｎｄｔｏｇｅｔｈｅｒａｎｄｔｈｅｙｊｏｉｎｔｌｙｔａｋｅｐａｒｔｉｎｔｈｅｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｉｎｔｉａｔｉｏｎｃｏｍｐｌｅｘ；ＢＡＦｃｏｍｐｌｅｘｄｉｒｅｃｔｌｙｂｉｎｄｓｔｏｂｏｔｈＲＮＡｐｌｏｙｍｅｒａｓｅＩＩａｎｄＮＦｌ／ＣＴＦＮ－ｔｅｒｍｉｎｕｓ．ＡｎｄＮＦｌ／ＣＴＦｄｉｒｅｃｔｌｙａｓｓｏｃｉａｔｅｓｔｏＲＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＩＩｓｍａｌｌｓｕｂｕｎｉｔＢ６．
Ｗｏｒｄｓ：ＢＡＦｃｏｍｐｌｅｘ；ＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩＩ；ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒＫｅｙ
ＮＦｌ／ＣＴＦ；仃ａｎｓｃｆｉｐｔｉｏｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ
独创性声明
本人声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。

除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不含其他人已经发表的研究成果，也不包含他人为获得东北师范大学或其他教学机构的学位或证书而取得的研究成果。

与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。

丛凹歪垒日期：押弓．‘
签名：赵函赶
关于本论文使用授权的说明
本人了解并遵守东北师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留、向国家有关部门送交学位论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保留论文。

（保密的论文在解密后应遵守此规定）
作者签名：
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第一章前言
一、染色体结构与基因的转录活动
真核生物的基因组是以染色体的形式存在的，染色体的结构对基因转录活动至关重要。

在真核生物的细胞核中一般能看到两种类型的染色体，高度凝缩的结构称为异染色体（ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｎ），凝缩程度轻，相对松散的结构称为常染色体，二者的比例根据细胞的类型和细胞所处的时期不同而有所差异。

一般认为基因的转录活动发生在常染色质区域，也就是说松散的染色体的形成是基因转录的前提。

真核细胞染色质的基本结构是核小体。

核小体的核心结构是由１６４个碱基对的ＤＮＡ缠绕四对核心组蛋白的八聚体外面近两周构成。

核小体核心组蛋白Ｈ３／Ｈ４异源二聚体是核小体亚颗粒的核心，它能稳定地与ＤＮＡ结合。

Ｈ２Ａ／Ｈ２Ｂ二聚体在核小体核心中较不稳定。

大量的研究表明，组蛋白与ＤＮＡ的紧密结合对基因转录具有抑制作用。

所以在基因转录起始前，染色体必须进行结构调整，使ＤＮＡ与核心组蛋白相对分离，以利于转录因子等与ＤＮＡ模板的接触“’“。

在核小体中，每个组蛋白由两个区域组成，一个是特征性的组蛋白折叠，另一个是称之为“尾”的非结构的氨基末梢。

组蛋白中的一些氨基酸可以被磷酸化、甲基化、乙酰化等化学修饰。

修饰后的组蛋白通常是碱性减弱，即正电荷减少，从而削弱了组蛋白和ＤＮＡ之间的相互作用。

一般认为组蛋白的这些化学修饰与基因表达的调控有关。

１。

近年来又发现了一类能通过改变染色体构型来影响（活化或抑制）转录的蛋白质因子，统称为染色体改构复合物（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘｅｓ）。

它们或是能够改变核小体中ＤＮＡ一蛋白质的相互作用方式，或是具有修饰核心组蛋白的酶活性，在基因转录、重组、ＤＮＡ复制和修复等重要活动中起作用“１。

目前了解比较清楚的主要是以下两大类起不同作
用的蛋白质家族。

一类是依赖ＡＴＰ的改构复合物（ＡＴＰ—ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇｃｏｍｐｌｅｘｅｓ），能够改变核小体结构，其中有的被证实可以通过增强核小体ＤＮＡ与转录因子装置的可接触性而激活转录。

已经报道的这类因子包括ＳＷＩ／ＳＮＦ，ＲＳＣ，ＮＵＲＦ，ＡＣＦ，ＮＵＲＤ等。

另一类是组蛋白乙酰转移酶（ｈｉｓｔｏｎｅａｃｅｔｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ，ＨＡＴｓ），核心组蛋白的Ｎ一末尾（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌｔａｉｌＳ）可以活跃地与ＤＮＡ及其他蛋白质发生作用，在调整核小体以及染色体结构中起重要作用。

有关染色体结构调整与基因转录调控的研究已成为当前分子生物学和细胞生物学热门的领域之一”’“。

二、染色体改构复合物ＳｉｆｔＩ／ＳＮＦ
１、ＳＷＩ／ＳＮＦ复合物的发现及种类
最初在研究ＳＵＣ２基因的表达中，发现酵母菌可以利用蔗糖和棉子糖作为碳源生长，ＳＮＦ基因缺失后不能利用蔗糖和棉子糖，引起酵母菌的突变，ＳＮＦ以此命名（ｔｈｅｎａｍｅｓｎｆｉｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｓｕｃｒｏｓｅｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）。

非常相似的是在酵母菌生长中，ＳＷＩ基因的缺失可以引起ＨＯ基因表达的突变，也是因为不能转换对蔗糖和棉子糖的利用，这就是ＳＷＩ的来源（ｔｈｅｎａｍｅｓｗｉｉＳｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｓｗｉｔｃｈｉｎｇｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）。

在以后的研究中逐渐发现，ＳＷＩ和ＳＮＦ基因的缺失能引起多种基因发生突变。

所以，在基因的表达中，ＳＷＩ／ｓＮＦ起着全面的调节作用。

’“…。

ＳＷＩ／ＳＮＦ是具有ＤＮＡ激活的ＡＴＰ酶活性的复合体，它们通过重构核小体的组蛋白核心或改变ＤＮＡ链在核小体上的位置来增加启动子序列与转录因子的可接触性，激活转录“…。

ＳＷｌ２／ＳＮＦ２亚家族中的１７个成员在酵母菌的基因组中已经确定，其中４个具有ＡＴＰ酶活性的蛋白质复合物作为不同的染色体改构复合物亚单位已经确定下来，它们是ｙＳＷＩ／ＳＮＦ、ｙＲＳＣ、ＩＳＷｌ和ＩＳＷ２…３。

另外，ＳＷｌ２／ＳＮＦ２亚家族依赖ＡＴＰ酶活性的染色体改构复合物在Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（ｄＡＣＦｍｌ、ｄＮＵＲＦｍｌ，ｄＣＨＲＡＣ）㈨、Ｂｒａｈｍａ…１、爪蟾（ｘＭｉ一２）和人类（ｈＳＷＩ／ＳＮＦ““ｈＮＵＲＤ““，ｈＲＳＦ“”）中也已经部分被确定。

虽然这些复合物都有不同的亚基，每一种酶水解很少的ＡＴＰ就能改变染色体的结构，大大提高蛋白质结合到核小体的ＤＮＡ结合位点上的能力““。

６
表１．１
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ＭａｔｏｍａｌｓＭｉ．２ＲＳＦＭａｔｏｍａｌｓｈＳＮＦ２ｈＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｈｏｍｏｌｅｇｏｆＳＷＩ／ＳＮＦｃｏｍｐｌｅｘ［３６】Ｈｕｎｎｍｈｏｍｏｌ０８ｏｆＳＷ“ＳＮＦｃｏｍｐｌｅｘ【３７，３８．３９】ＣｏｍｐｌｅｘｉｓｓｉｍｌＩ盯ｔ。

ｍｃｏａｃ
啪ｔｅｉｎｉｎｇＢＲＧＩ［３７，３８】
Ａｂ＿ｎｍｅｏｆＢＡＦ２５０Ｏｎｌｙ
ＢｒｇｌＡＴＰａｓｅｐｒｅｓｅｎｔ
Ｓｍｌｎ
Ｒｓｅ６ｐ，ＲｓｃＳｐａｎｄＳｍｌｏｏｆＲＳＣ雠ｓｌｍｉｌⅡｔｏ
Ｓｗｉ２／Ｓｎｔ２，Ｓｗｐ７３ｐ，Ｓｗｉ３ａｎｄＳＯｆ５ｏｆＳＷＩ／ＳＮＦ
ｃｏｍｐｌｅｘ［４０，４１】
ＡＴＰａｓｅｓｔｉｍｕＩｎｔｅｄｂｙ
ｎｅｃｌｅｏｓｏｍｃｓ，ｎｏｔｈ∞ＤＮＡ
ｃ∞№ｐ５５【４２．４３，４４，４５ｌＣｏＢｔａ血ｔｍＩＩ
ｎｕｄｅｏｓｏｍｅ∞们ｈｇｆｋ∞ｒ
［４６】
Ｎ呲蛔ｏｏⅢ’Ⅻ晌ｇ
自曲”
Ｈ铂Ｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎ８ｅｒｉｅｓｉｌａｎｅｉｎｇＦａｃｉｌｉｔａｔｅｓｍｍｓｃｒｉｐｔｉＯｎ
ｆ，ｏｍｃ㈣ｎｔｅｍｐｌａｔｅｓＨａｓ
ｎｕｄ㈣ｒｅｍｏｄｅｌｉｎ８ａｎｄ
酵母菌中的染色体改构复合物ｙＳＷＩ／ＳＮＦ的分子量为２×１０６，有１２个亚基，包括ＳＷｌｌ、ＳＷｌ２／ＳＮＦ２、ＳＷｌ３、ＳＮＦ５、ＳＮＦ６、ＳＮＦｌｌ、ＳＷＰ８２、ＳＷＰ７３和ＴＦＧ３（ＴＡＦ３０），ＳＷＰ６１，ＳＷＰ５９“…。

最近又从酵母菌中分离出具有１５个亚基的复合物，命名为ＲＳＣ（ｒｅｍｏｄｅｌｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆｃｈｒｏｍａｔｉｎ）。

离体实验发现，它具有ＡＴＰａｓｅ的活性，能改变染色体的结构。

目前已证实有六个亚基和酵母菌ＳＷＩ／ＳＮＦ具有同源性呦１。

在酵母菌中，ＲＳＣ的含量
一：一～蛳兰三～
图１．１ＢＡＦ复合物的组成
ＢＡＦ复合物一般是由９—１２亚基组成，图中是几个重要的亚基。

ＳＷＩ／ＳＮＦ复合物依靠ＡＴＰ酶释放出来的能量改变了核小体的结构，增加了核小体ＤＮＡ的可接触性“…。

目前对ＳＷＩ／ＳＮＦ改构核小体的调节机制有四种解释：①ＳＷＩ／ＳＮＦ可以移动或重新分布Ｈ２Ａ—Ｈ２Ｂ二聚合体；（室）ＳＷＩ／ＳＮＦ可以诱导（Ｈ３一Ｈ４）：四聚合体构象的变化形成新的组蛋白八聚合体构象；
③ＳＷＩ／ＳＮＦ复合物依靠ＡＴＰ酶释放出来的能量使ＤＮＡ移位，使组蛋白与ＤＮＡ的接触出现不稳定的现象：＠ＳＷＩ／ＳＮＦ复合物用ＡＴＰ酶释放出来的能量改变了核小体ＤＮＡ作用的途径或在没有改变八聚合体结构的情况下，把ＤＮＡ从八聚合体的表面移开ｏ’“１。

最近有实验证实ＳＷＩ／ＳＮＦ对基因转录有抑制作用，如ＳＷＩ／ＳＮＦ家族成员ＢＲＧｌ加强了ＲＢ对基因转录的抑制作用。

Ｒｂ（ｒｅｆｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）是一种关键的细胞周期调控因子，能结合几种负责细胞生长的转录活性因子，如Ｅ２Ｆ、ＡＴＦ２、ＭｙｏＤ、ＭＤＭＬ和Ｃ－Ａｂｌ激酶等。

５’“”’…。

目前对ＳＷＩ／ＳＮＦ复合物抑制基因转录的相关机制还不清楚。

无论是在酵母菌还是在哺乳动物细胞中，目前我们还有许多不知道的机理，如ＳＷＩ／ＳＮＦ类复合物是如何被靶定到核小体上参加染色体的改构作用。

一种可能是ＳＷＩ／ＳＮＦ复合物通过与转录因子作用（如糖皮质受体）结合到启动子上的；另一种可能是ＳＷＩ／ＳＮＦ复合物可以稳定地与ＲＮＡ聚合酶
ｑ
ＩＩ全酶结合，从而参加了转录起始复合物的形成；还有一种可能是ＳＷＩ／ＳＮＦ复合物本身含有ＤＮＡ结合活性区，它的作用和高迁移蛋白组（ＨＭＧ）的功能相似““。

·…１。

三、转录因子ＮＦｌ／ＧＴＦ
真核基因表达的调节是通过多个层次来实现的，其中，转录水平的调节是表达调控中最主要的步骤。

基因转录的调节元件主要有三种，即①ＲＮＡ聚全酶，②顺式作用元件（ｃｉｓ—ａｃｔｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔ），为与结构基因串联的特定ＤＮＡ顺序，它们对基因转录的精确起始的活性调节起着十分重要的作用，③反式作用因子（ｔｒａｎｓ—ａｃｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ），是能直接或间接地识别或结合在各顺式作用８－１２ｂｐ核心序列上，参与调控靶基因转录效率的一组蛋白质。

在基因转录起始过程中涉及到很多蛋白质与ＤＮＡ、蛋白质与蛋白质之间相互作用的复杂反应，不同基因的表达受不同组合的蛋白质因子的协同调控。

真核细胞中，不同的顺式调控元件按不同的数量、类别及空间位置串联排列，组成了各种基因表达的调控区域。

ＮＦｌ／ＣＴＦ是启动子上的一个转录因子，能和ＣＡＡＴ－ｂｏｘ结合，在转录起始复合物的形成过程中起重要作用。

ＮＦｌ／ＣＴＦ首次是在腺病毒ＤＮＡ复制中发现的，这个转录／复制蛋白家族被认为参与了几种病毒的复制，而且表现出对多种细胞和病毒基因的转录有调控作用。

另外，ＮＦｌ／ＣＴＦ蛋白与细胞生长状态的变化相联系，也同许多致癌基因及疾病相联系８。

６３’…。

１、ＮＦｌ／ＧＴＦ的结构
从大鼠、人类、小鼠、大颊的鼠类和猪分离的ＮＦｌｃＤＮＡ来看，是多种ＮＦｌ／ＣＴＦ基因存在脊椎动物中“’“”’“”’“”１。

Ｓｉｐｐｅｌ实验室在鸡中确定了四种基因，并对ＮＦｌ基因进行了命名（ＮＦ—Ａ，ＮＦ—Ｂ，ＮＦ—Ｃ结合ＣＡＡＴｂｏｘ，ＮＦ—ｘ在大颊的鼠类。

２’７…。

在脊椎动物中ＮＦｌ家族有四个成员组成（ＮＦ—Ａ，ＮＦ—Ｂ，Ｎ卜Ｃ和ＮＦ—Ｘ），在老鼠的胚胎和成体中，这四种ＮＦｌ基因具有独特性，但以相互重叠的模式表达。

每种ＮＦｌ基因的转录通过不问的剪接方式，从一个单基因中可以产生九种不同的蛋白，四种ＮＦｌ基因的产物通过不同的作用机制和调节方式激活或抑制转录ｏ…。

１０
动子上，由ＢＡＦ引起的染色质结构的改变是部分的或是暂时的。

在ＤＮＡ或染色质模板中，瞬时负超螺旋或超螺旋扭转由ＢＡＦ复合物提供能量诱导，暂时在ＴＧ重复序列中形成类似Ｚ－ＤＮＡ结构，它进一步打开染色质结构，允许其它转录因子和转录元件在启动子上募集。

启动子区域内转录因子和转录元件的聚集，可以进一步稳定Ｚ－ＤＮＡ结构，在启动子上形成开放的染色体结构，有利于基因转录的延伸。

”１。

图１．３是说明ＳＷＩ／ＳＮＦ（ＢＡＦ）复合物与转录因子ＮＦｌ／ＣＴＦ和ＲＮＡ聚合酶ＩＩ之间可能的模拟图。

图１．３．ＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩＩｉｎｉｔｉａｔｉｏｎＡ：Ａｃｔｉｖａｔｉｏｒ；Ｉｎｉ：Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ，Ｐｏｌｌｌａ：
ＤｅｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｖｅＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅＩＩ）ＳＲＢ：ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆＲＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
Ｂ；ＮＦｌ：ｔｈｅＮｕｃｌｅａｒＦａｃｔｏｒ１；ｌｉＥ：ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉＯｉｌＦａｃｔｏｒＥ｛ＩＩＦ：Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ＦａｃｔｏｒＦ；ＩＩＨ：ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒＨ；ＩＩＢ：ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒＢ：ＴＡＴＡ：
尉用．ｂｏｘ
五、本论文研究的内容和意义
哺乳动物细胞中的染色体改构复合物（ＢＡＦ）和转录因子（ＮＦｌ／ＣＴＦ）都参加了基因的转录活动。

ＢＡＦ复合物利用ＡＴＰ水解释放的能量，使核小体中ＤＮＡ与组蛋白的结构暂时松散，以利于转录因子等在启动子区域募集，形成转录起始复合物ｏ“。

位点特异的ＤＮＡ结合蛋白ＮＦｌ／ＣＴＦ是特殊的转录因子，能和ＣＡＡＴ—ｂｏｘ结合，对于转录起始复合物的募集和定点形成起重要作用。

但目前对于基因转录活动中ＢＡＦ复合物与ＮＦｌ／ＣＴＦ和ＲＮＡ聚合酶ＩＩ的联系和相互作用还知道的不多，已有的模型还缺乏实验证据支持”１。

本论文以ＨｅＬａ细胞、Ｊｕｒｋａｔ细胞和小鼠脾Ｔ淋巴细胞为研究材料，
１４
第二章材料与方法
一、实验材料
１、细胞
（１）小鼠脾成熟Ｔ淋巴细胞自体重为１８—２２克左右的昆明系小鼠按本实验室方法分离纯化。

（２）ＨｅＬａ细胞由上海细胞所购进。

（３）Ｊｕｒｋａｔ细胞由北京阜外医院赠送。

２、抗体
（１）抗肌动蛋白单克隆抗体购自Ｓｉｇｍａ公司（Ｎｏ．Ａ５４４１），工作浓度：间接免疫荧光ｉ：１０００，免疫印迹１：５０００。

（２）抗染色体改构复合物ＢＡＦ核心亚基ＢＲＧｌ多克隆抗体（１９０ｋＤａ蛋白）由ＺｈａｏＫｅｊｉ博士馈赠，工作浓度：间接免疫荧光ｌ：５００，免疫印迹１：１０００。

（３）抗转录因子ＮＦｌ／ＣＴＦ多克隆抗体（识别Ｎ一末端保守序列），购自ＳａｎｔａＣｌｕｚ公司（ｓｃ一８７０），工作浓度为：间接免疫荧光ｌ：５００，免疫印迹ｉ：ｉ０００。

（４）抗ＲＮＡ聚合酶ＩＩ大弧基多克隆抗体由ＳａｎｔａＣｌｕｚｅ公司购进，工作浓度为：间接免疫荧光ｌ：５００，免疫印迹１：１０００。

（５）抗ＲＮＡ聚合酶ＩＩ小亚基Ｂ６和Ｂ。

单克隆抗体阱１由Ｃｏｏｋ博士馈赠（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＯｘｆｏｒｄ），工作浓度为：免疫荧光６ｕｇ／ｍｌ，免疫印迹２ｕｇ／ｍｌ。

（６）所有ＨＲＰ和荧光标记的次级抗体均由北京中山公司进口分装。

（７）ｌＯｎｍ胶体金偶联蛋白Ａ购自Ｓｉｇｍａ公司（ＮＯ．Ｃ－５７６１）。

（８）与１７ｎｍ胶体金颗粒偶联的羊抗兔ＩｇＧ购自北京第三军区所电镜室。

（９）与２０ｎｍ胶体金颗粒偶联的羊抗鼠ＩｇＧ购自ＢｒｉｔｉｓｈＢｉｏｃｅｌｌＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ．（Ｂａｔｃｈ３８０９）。

１６
３、主要试剂
（１）刀豆蛋白Ａ（ＣｏｎＡ）由Ｓｉｇｍａ公司进口，北京百灵克生物公司分装。

ＣｏｎＡ贮存液的制备：称取ＣｏｎＡ粉剂７１．４ｍｇ，加无血清培养基ｌＯＯｍｌ，充分溶解，用Ｏ．２５ｕｍ滤膜过滤除菌。

ＣｏｎＡ浓度为１００ｕｇ／ｍｌ，一２０。

Ｃ保存。

工作浓度为５ｕｇ／ｍ１。

（２）培养基和血清：ＲＰＭＩ１６４０自ＧＩＢＣＯ公司购进。

胎牛血清由天津血液研究所生产。

（３）预染标准分子量蛋白（分子量范围１４．４－２００ｋＤａ）购自Ｐｉｅｒｃｅ公司（Ｎｏ．２６６８１）。

（４）硝酸纤维素膜（Ｎｃ）购自Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司（ＮＯ．ＬＣ２０００）。

（５）ＡＥＣ（３－ａｍｉｎｏ一９一ｅｔｈｙｌｃａｒｂａｚ０１），购自Ｓｉｇｍａ公司（ＮＯ．１０１）。

（６）二甲基甲酰胺（Ｎ，Ｎ－ｄｉｍｅｔｈｙｌｆｏｒｍａｍｉｄｅ），购自上海生工生物工程有限公司，由ＡＭＲＥＳＣＯ进口分装（ＮＯ．Ｄ０４６４）。

（７）低温包埋剂Ｋ４Ｍ购自德国ＣｈｅｍｉｓｃｈｅＷｅｒｋｅＬｏｗｉＧＭＢＨ＆Ｃｏ公司。

（８）蛋白ＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ，购于Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司（ＮＯ．１７—０７８０一０１）。

４、主要仪器和设备
超净工作台（ＡｉｒＴｅｃｈ，苏州净化仪器厂）、台式高速冷冻离心机（Ｈｅｔｔｉｃｈ－１６Ｒ）、电泳仪及电转移装置（ＢｉｏＲａｄ）、倒置显微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ）、正置荧光显微镜（ＯｌｙｍｐｕｓＢＸ６００）、Ｃ０２培养箱（ＴｈｅｒｍｏＦｏｒｍａ３１１１）、透射电镜（ＨｉｔａｃｈＨ－７５００）、图像处理仪（ＩＢＡＳ２０００）。

二、实验方法
１、静止小鼠脾Ｔ淋巴细胞分离
试剂：
Ｈａｎｋ’Ｓ液：
Ａ．溶液：８．ＯｇＮａＣＩ，０．４９ＫＣＩ，０．１２９Ｎａ２ＨＰＯ。

．１２Ｈ２０，０．０６９Ｋｔｔ２
１７
ＨＰＯ。

，１．Ｏｇ葡萄糖，２ｍｌ１％酚红液，２．ＯｇＭｇＳＯ。

．７Ｈ：０，双蒸水定容至９００ｍｉ。

Ｂ．溶液：０．１４９ＣａＣＩ。

溶于１００ｍ１水中，８磅１５分钟灭菌，４℃冰箱保存，临用时Ａ、Ｂ两种溶液混合，调ｐＨ至７．３～７．６。

红细胞裂解液（Ｔｒｉｓ—ＮＨ。

ｃｌ缓冲液）：０．１７ｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ—ＨＣＩ
２．０６０９／ｌＯＯｍｌ，０．１６ｍｏｌ／ＬＮＨｄＣｉ８．３０９／ｌＯＯＯｍｌ，将ｌＯＯｍｌＴｒｉｓ—ＨＣＩ与９００ｍｌＮＨ。

Ｃ１混合，调ｐＨ为７．２
方法：
（１）小鼠脾静止淋巴细胞的分离。

８’”’”“（所用溶液均在４℃预冷，所有步骤均在４℃无菌条件下进行。

）
Ａ、颈椎脱臼法致死小鼠，放入７０％乙醇的烧杯中，使其体毛完全浸湿。

Ｂ、将小鼠放在用７０％乙醇润湿的纸巾上，用镊子夹起腹中部皮肤，沿左侧作一切口，剪开腹壁各层，注意不要剪破肠管。

Ｃ、将肠管从腹部切口拉出，暴露脾脏，用剪刀减断脾门的血管和结缔组织，取脾，放入盛有冷的ｌＯｍｌＨａｎｋ’Ｓ液平皿的纱布上，剔除脂肪。

Ｄ、将脾组织减成两段，用结核菌素注射器的针芯轻轻捻碎脾组织，使单个细胞经纱布进入溶液中，再经１００目不锈钢丝网过滤。

Ｅ、将细胞悬液移到离心管中，２００９（１２００转／分钟，离心５分钟，弃上清。

加０．５ｍｌＨａｎｋ’ｓ液重悬细胞，加１０倍体积的Ｔｒｉｓ－ＮＨ。

Ｃｉ（ｐＨ７．２）到细胞悬液中，混合，置室温１０分钟，加适量缓冲液终止反应。

１２００转／分钟，离心５分钟，Ｔｒｉｓ—ＮＨ。

Ｃ１可引起红细胞溶解，但对白细胞无影响。

用冷Ｈａｎｋ’Ｓ液洗涤细胞２—４次。

Ｆ、最后加入含１０％新生牛血清的ＲＰＭＩ１６４０培养液悬浮细胞，并调节细胞浓度至４Ｘ１０６细胞／ｍｌ，以上操作均在无菌条件下进行。

杀死动物到制成单细胞悬液的时间少于３０分钟，到进入培养状态少于３小时。

（２）小鼠脾Ｔ淋巴细胞的分离
将获得的细胞悬液（４×ｉ０６细胞／ｍ１），在５％Ｃ０。

培养箱中３７。

Ｃ培养６
小时，终止培养时弃去贴壁细胞，收集悬浮细胞，在经预先包被羊抗鼠
１８
ＩｇＯ（５０ｕｇ／ｍ１）的培养瓶中室温孵育１小时，再次收集悬浮细胞，即为Ｔ淋巴细胞。

由于脾脏是外周淋巴器官，其淋巴细胞是处于静止期的淋巴细胞。

２、ＨｅＬａ细胞的免疫胶体金透射电镜观察
试剂：
Ａ．２．７０９Ｋ４ＭＣｒｏｓｓｌｏｎｋｅｒＡ；１７．３０９ＭｏｎｏｍｅｒＢ；０．１０９ＩｎｉｔｉａｔｏｒＣ。

Ｂ．１０ｍｎ胶体金偶联蛋白Ａ（１：２０稀释）。

Ｃ．２０ｎｍ胶体金偶联兔抗鼠ＩｇＧ（１：２０稀释）。

Ｄ．１７ｎｍ胶体金偶联抗羊兔ＩｇＧ（１：２０稀释）。

Ｅ．固定液：０．２ｍｏｌ／ＬＰＢＳ（ｐＨ７．４）中含２．５％的戊二醛和４％多聚甲醛。

Ｆ．（１）：ｉｍｏｌ／ＬＮａ２ＨＰＯ＾１２Ｈ２０ｌＯＯｍｌ
（２）：ｌｍｏｌ／ＬＮａＨ２ＰＯ｛２Ｈ２０ｌＯＯｍｌ
ｐＨ７．４０．２ｍｏｌ／ＬＰＢＳ２００ｍｌ
Ｇ．１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ５０＝（１）：３８．７ｍｌ＋（２）：１１．３ｍｌ
将上述溶液加水至２５０ｍｌ即为ｐＨ８．０，０．２ｍｏｌ／ＬＰＢＳＨ．在０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ（ｐＨ７．４）中含０．９％ＮａＣｌ
Ｉ．ＰＢＳＴ：０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ（ｐＨ７．４）中含０．２％Ｔｗｅｅｎ２０
Ｊ．ＰＢＳＴＧ：０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ（ｐＨ７．４）中含０．２％Ｔｗｅｅｎ２０和０．０１５ｍｏｌ／Ｌ甘氨酸
（１）低温包埋电镜样品制备
１）培养细胞加０．１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ缓冲液悬浮，１５００ｒｐｍ离心５分钟，０．１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ洗两次，用微量２．５％低熔点琼脂糖包埋。

２）固定：固定液室温固定２小时，０．１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ洗３次，每次３０分钟；双蒸水洗３次，每次３０分钟。

３）脱水：样品经３０％、５０％，７０％、９０％和１００％乙醇系列脱水，每次各１小时；９０％乙醇过夜（７０％乙醇４℃可停留）。

４）浸透：样品在浸透液１（乙醇；Ｋ４Ｍ２：１），浸透液２（乙醇：Ｋ４Ｍ１：１）和浸透液３（Ｋ４Ｍ）中各浸透１２小时；Ｋ４Ｍ浸透６０小时（室温１２小时，Ｏ℃２４小时，－３０℃２４小时）。

１９
５）聚合：将样品放入装满Ｋ４Ｍ的ＳＰＩ—ｂｅａｍ胶囊中，放入一３０。

Ｃ冰柜中，在紫外线照射下聚合２—３天；室温聚合２—３天。

６）切片：Ｒｅｉｃｈｅｒｔ—Ｊｕｎｇ—Ｂ切片机切片，厚度７０ｎｍ。

切片在室温下干燥。

（２）免疫胶体金双标记
１）切片标本经饱和Ｎａｌ０４溶液处理３０分钟，双蒸水洗４次，每次５分钟。

２）０．１ｍｏｌ／Ｌ盐酸处理１０分钟，双蒸水洗４次，每次５分钟。

０．Ｏｌｍｏｌ／ＬＰＢＳＴＧ（ｐＨ７．４）洗４次，每次５分钟。

３）Ｉ％ＢＳＡ（０．Ｏｌｍｏｌ／ＬＰＢＳＴＧ配制，ｐＨ７．４）封闭１５分钟。

４）第一次标记：加数滴按比例稀释（Ｏ．１％ＢＳＡ—ＰＢＳＴＧ）一抗于切片上，在湿盒中４＂Ｃ过夜。

取出湿盒后室温ｌ小时，０．ＯＩＭ／ＬＰＢＳＴＧ（ｐＨ７．４）洗三次，每次５分钟。

加数滴用０．１％ＢＳＡ—ＰＢＳＴＧ按１：２０比例稀释蛋白Ａ一胶体金于切片上，在湿盒中室温作用２小时。

０．０１ｍｏｌ／ＬＰＢＳ（ｐＨ８．０）洗３次，每次５分钟；０．Ｏｌｍｏｌ／ＬＰＢＳ（ｐＨ７．４）洗３次，每次５分钟；双蒸水洗２次，每次５分钟。

５）第二次标记：加数滴用０．１％ＢＳＡ—ＰＢＳＴＧ按比例稀释的一抗于切片上，在湿盒中４。

Ｃ过夜，取出湿盒后室温１小时，０．０１Ｍ／ＬＰＢＳＴＧ（ｐＨ７．４）三遍，每次５分钟。

加数滴用０．１％ＢＳＡ—ＰＢＳＴＧ按１：２０比例稀释的胶体金偶联的鼠抗兔抗体于切片上，在湿盒中室温作用２小时。

０．Ｏｌｍｏｌ／ＬＰＢＳ（ｐＨ８．Ｏ）洗３次，每次５分钟；０．Ｏｌｍｏｌ／ＬＰＢＳ（ｐＨ７．４）洗３次，每次５分钟；双蒸水洗２次，每次５分钟。

６）样品经５％醋酸铀染色１０ｍｉｎ，双蒸水洗３次，每次５分钟。

室温干燥。

７）日立Ｈ一６００—２型电子显微镜下观察、拍照。

３、小鼠脾Ｔ淋巴细胞核的分离和核蛋白的免疫印迹分析
试剂：
２０
基础缓冲液：３．７５ｒａｍＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．４），０．０５ｍＭＳｐｅｒｍｉｎｅ：０．１２５ｍＭＳｐｅｒｍｉｄｉｎｅ，０．５ｍＭＥＤＴＡ—ＫＯＨ（Ｐｈ７．４），２０ｍＭＫＣｌ，５ｍＭＭｇＣｌ２，１删ＥＧＴＡ分离液：临用前基础缓冲液中加入下述试剂使其终浓度达到５ｕｇ／ｍｌＡｐｒｏｔｉｎｉｎ，０．５ｍＭＰＭＳＦ，５ｍＭＤＴＴ，２０ｍＭＤ磷酸甘油。

细胞核保存液：５０ｍＭＴｒｉｓ—ＨＣＩ（ｐＨ７．４），２ｍＭＭｇＣｌ２，２５％ｇｌｙｃｅｒｏｌ细胞核裂解液：２５ｍＭＴｒｉｓ—ＨＣｌ（ｐＨ７．４），ｌｍＭＤＴＴ，０．２ｍＭＥＤＴＡ，０．４ｍＭＣａＣＩ２，０．２５ｍＭＭｇＣｌ２，２ＭＮａＣＩ。

（１）Ｔ淋巴细胞核的分离
Ａ．收集Ｔ淋巴细胞培养液，１０００ｒｐｍ（３００ｇ）离心５分钟，沉淀用分离液清洗２次，１０００ｒｐｍ（２５０ｇ）离心５分钟。

Ｂ．沉淀加入预冷的分离液１２ｍｌ（Ｖ：Ｖ＝ｌＯ：１）置于Ｏ＇Ｃ冰浴３０分钟，然后在４℃匀浆（５－１０次），镜检９０％细胞已破碎，细胞核已游离出来，５５０９（１２００ｒｐｍ）离心８分钟。

Ｃ．沉淀用分离液洗１次，５５０９离心８分钟，提取到的细胞核于ｌｍｌ细胞核保存液中一２０℃保存。

（Ｊｕｒｋａｔ细胞核的分离同上）。

（２）电泳及杂交过程
试剂：
Ａ．丙烯酰胺贮备液：Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ／ｂｉｓ（２９．１９／０．９９），每ｌＯＯｍｌ贮存液中含有８７％的甘油２５ｍｌ，用梯度混合器制备４－２０％浓度梯度凝胶。

Ｂ．丽春红染液：ＰｏｎｃｅａｕＳ０．５９，加水至ｌＯＯｍｌ。

Ｃ．底物溶液：２０ｍｇＡＥＣ，２．５ｍｌ二甲基甲酰胺，５０ｍｌ０．０５ＭＮａＡｃ，２．５“ｌ３０％Ｈ。

０。

临用前新鲜配制。

Ｄ．ＰＢＳＴ：１６．ＯｇＮａＣＩ，０．４９ＫＣｌ，０．４９ＫＨｚＰＯｔ（椰１３６．０９），５．８０９ＹａｚＨＰ０４１２Ｈ。

０（ＭＷ３５８．１４），ｌｍｌＴｗｅｅｎ一２０，加水至体积２０００ｍｌ。

方法：
Ａ．取细胞核沉淀，按细胞核体积加１０倍细胞核裂解液重悬细胞，冰浴超声处理３０秒，２次，超生强度７０分贝，１００００ｒｐｍ离心１０分钟，收集上清。

Ｂ．Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测蛋白浓度。

Ｃ．对检测的蛋白质进行４—２０％ＳＤＳ—ＰＡＧＥ浓度梯度电泳。

Ｄ．蛋白质从ＳＤＳ—ＰＡＧＥ凝胶转移至硝酸纤维素膜，常规配置到转移缓冲液（ｐＨ８．３）中，冰浴下１００伏转移２小时。

Ｅ．用丽春红染液对转印后的蛋白质进行可逆染色。

将膜放入丽春红染液中染色５分钟，在水中脱色２分钟，如转膜成功，可见蛋白带出现。

在水中再浸泡１０分钟，使完全脱色。

Ｆ．将转移后的硝酸纤维素膜置于ＰＢＳＴ缓冲液中冲洗２—３次，将膜转入５％脱脂奶粉的封闭液中封闭免疫球蛋白的结合位点，３７℃作用３０分钟。

Ｇ．加入用封闭液稀释至工作浓度的第一抗体溶液，３７。

Ｃ轻轻摇动１小时，置于ＰＢＳＴ缓冲液中洗三次，５—１０分钟／次。

Ｈ．加入用封闭液稀释的第二抗体溶液，３７。

Ｃ轻轻摇动３０分钟，用ＰＢＳＴ缓冲液洗３次，５分钟／次，将膜放入底物溶液中晃动染色至条带显现清楚为止。

Ｉ．用蒸馏水洗膜，终止反应。

４、免疫荧光双标记
试剂：
（１）０．０１ＭＰＢＳ：０．０１ＭＮａ：ＨＰＯ。

，０．０１ＭＮａＨ：ＰＯ。

，０．９％ＮａＣｌ。

（２）固定液：０．０１ＭＰＢＳ，２％葡萄糖，１％甲醛，０．０２％ＮａＮ。

（３）洗涤液：０．Ｏｌｍｏｌ／ＬＰＢＳ，２％小牛血清。

（４）封闭液：０．Ｏｌｍｏｌ／ＬＰＢＳ，ｌＯ％ｄ，牛血清。

（５）透化液：０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ，５ｍＭＥＤＴＡ，２％血清，０．Ｏｌｍｏｌ／ＬＰＢＳ。

方法：
（１）经高压灭菌的载玻片放入旺盛生长的ＨｅＬａ细胞培养皿中，经２４—４８小时生长，细胞通过自身分泌的细胞外基质使细胞粘附于载玻片上，取出载玻片用ＰＢＳ洗两次，固定１小时，０．Ｏｌｍｏｌ／ＬＰＢＳ充分洗涤三次，每次１０分钟。

（２）第一次标记：制备的载片浸于透化液中冰浴１０分钟，加数滴用透化液按比例的一抗于载片上，３７℃作用１小时，取出标本后洗涤，
０．Ｏｌｍｏｌ／ＬＰＢＳ洗三次，每次ｌＯ分钟。

用透化液按１：４０稀释二抗，室温下作用１小时，０．Ｏｌｍｏｌ／ＬＰＢＳ洗涤三次，每次１０分钟。

（３）第二次标记：加数滴用透化液按比例的一抗于载片上，３７℃作用１小时，取出标本后用０．Ｏｌｍｏｌ／ＬＰＢＳ洗涤三次，每次１０分钟。

用透化液按１：４０稀释二抗，室温下作用ｌ小时后，用０．Ｏｌｍｏｌ／ＬＰＢＳ洗涤三次，每次１０分钟，双蒸水洗三次，每次１０分钟。

（４）９０％甘油封片。

（５）对照组标本以ＰＢＳ代替一抗，其余各步与实验组相同。

（６）正置荧光显微镜观察，在４９０ｎｍ波长观察ＦＩＴＣ标记信号，转换５２０—５５０ｎｍ波长观察同一视野细胞ＴＲＩＴｅ标记信号并照相。

５、免疫沉淀分析蛋白质
（１）取细胞核沉淀，按细胞核１０倍的体积加细胞核裂解液重悬细胞。

冰浴下超声处理２次，每次３０秒，超生强度７０分贝。

１００００ｒｐｍ离心１０分钟，收集上清，Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测蛋白浓度。

（２）在一个微量离心管中，加入沉淀抗体５ｕｇ，９００ｕｌ总裂解物（＞２００ｕｇ总蛋白）和１００１１１４×免疫沉淀缓冲液。

（３）涡旋振荡并在４０Ｃ孵育１小时。

（４）加入ｌＯｕ１５０％蛋白ＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ，旋涡振荡并在４０Ｃ孵育３０分钟，离心４分钟（１６０００９，４０Ｃ），去上清液。

（５）用ｌ×免疫沉淀缓冲液（１％Ｔｒｉｔｏｎ一１００，１５０ｍＭＮａＣｌ：ｌＯｍＭＴｒｉｓ—ＨＥｌｐＨ７．４，ｌｍＭＥＤＴＡ，ｌｍＭＥＧＴＡｐＨ８．０，０．２ｍＭ直钒酸钠，０．２ｍＭＰＭＳＦ，０．５％ＮＰ一４０）洗涤，重复洗涤两次。

（６）在３０ｕ１２×浓集的电泳样品缓冲液（２５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨｅｌｐＨ６．８，４％ＳＤＳ，１０％甘油，０．００６％溴酚蓝，２％Ｂ一巯基乙醇）中重悬沉淀物。

（７）煮沸５分钟，离心５分钟（１６０００９，４０Ｃ）。

（８）将上清上样到４－２０％浓度梯度凝胶上进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ。

（９）用相应的杂交抗体检测转移到硝酸纤维素膜上的蛋白质。

６、酶联免疫吸附实验（Ｅｎｚｙｍｅ－ＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔＡｓｓａｙ，ＥＬＩＳＡ）试剂：
Ａ．包被缓冲液：ｌＯＯｍｌ５０ｍＭ碳酸盐缓冲液（ｐＨ９．６）
Ｎａ。

ＣＯ。

（ＭＷ１０５．９９）０．１５９９
ＮａＨＣＯ。

（Ｍｗ８４．０１）０．２９３９
Ｂ．洗涤缓冲液：２０００ｍｌＰＢＳＴ（ｐＨ７．４）
ＮａＣＩ（ＭＷ５８．４４）１６．ＯｇＫＣｌ（ＭＷ７４．５５）０．４９
ＫＨ２Ｐ０４（Ｍ１ｖ１３６．０９）ｏ．４９Ｔｗｅｅｎ２０１．Ｏｍｌ
ＮａｚＨｐ０４．１２Ｈ：０（ＭＷ３５８．１４）５８０９
Ｃ．封闭液：１％（ｗ／ｖ）脱脂奶粉一ＰＢＳ
ｌＯＯｍｌＰＢＳＴｌｇ脱脂奶粉
Ｄ．底物缓冲液：２００ｍｌ０．１Ｍ磷酸一柠檬酸缓冲液（ｐＨ５．０）Ｎａ２ＨＰ０４．１２Ｈｚ０（Ｍｗ３５８．１４）７．３７５９／１０３ｍｌ
ＣｅＨａ０，Ｈ２０（ＭＷ２１０．１４）２．０３７９／９７ｍｌ
Ｅ．底物工作液：ｌＯｍｌ磷酸一柠檬酸缓冲液
１５０ｕｌ３％Ｈ。

０２和ＯＰＤ５ｍｇ
Ｆ．终止液：２００ｍｌ２ＭＨ２ＳＯ。

１７８．３ｍｌ水加２１．７ｍｌ９８％Ｈ。

Ｓ０４
实验步骤：
（１）用包被缓冲液稀释细胞核蛋白液，浓度为ｌＯｕｌ／ｍ１，每孔加ｌＯＯｕｌ此蛋白液包被酶标板，４０ｃ过夜，次日弃之。

（２）每孔１００Ｍ封闭液，３７０Ｃ封闭２０分钟。

（３）洗涤液冲洗三遍后，分别加入待检抗体并设立对照，３７０Ｃ温育１小时。

（４）洗涤液洗涤三遍后，每孔加ｌＯＯｕｌ１：１００００稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔ＩｇＧ（ＨＲＰ—ＩｇＧ），３７０Ｃ温育小时。

（５）洗涤液洗涤后，每孔加ｌＯＯｕｌ底物工作液，室温避光反应１５分钟，加５０ｕｌ２Ｍ硫酸中止反应，４９２ｎｍ测ＯＤ分析结果。